纳米粒子以其特殊的尺寸效应、界面效应以及优良的光电性质与生物相容性，已经在工业生产、医疗诊断、生物药物和环境监测等领域得到了广泛应用[1, 2]。但是，纳米粒子的尺寸非常小，可以直接穿透生物屏障进入生物及人体内，进而影响体内的生物过程[3, 4]。因此评估纳米材料的生物和环境毒性十分重要，但由于其与生物体作用非常复杂，至今仍然没有一种合适平台对其影响进行研究。
当纳米粒子进入生物体内后，因其具有极高的比表面积，会迅速吸附生物分子以减小其表面能[5, 6]，在纳米粒子表面形成“蛋白质冠”(Protein corona)的结构。目前研究认为，该过程可分为动力学和热力学控制两个步骤，最终在纳米粒子表面形成内外两个吸附层[7, 8]。其中，内吸附层具有高稳定性，纳米粒子即是通过该层与细胞内的受体发生作用。因此，研究纳米粒子和蛋白质的相互作用，有助于对纳米粒子进入细胞后的行为进行预判，从而对其安全性进行评估，最终设计出“安全”的纳米粒子以及高效的纳米药物。
目前，研究纳米粒子与蛋白质相互作用的主要方法为光学方法。Edri等[9]利用紫外可见光谱(UV-vis)简单快速地测定了单壁碳纳米管(SWNT)与牛血清蛋白(BSA)的相互作用常数。但是，该方法对样品本身的光学性质有一定的要求，且很容易受其它物质的干扰，且温度和溶液pH对检测也有一定的影响。Boulos等[10]利用稳态荧光猝灭法研究了AuNPs与BSA的相互作用，发现AuNPs的形状及表面电势对该过程有很大的影响。虽然该方法有很高的灵敏度，但是稳定性较差。其它一些光学方法，如傅利叶变换红外(FTIR)、拉曼(Raman)等光谱方法也被用于此研究[11, 12]。除光学方法外，还有质谱、核磁、透射电镜等方法，但是这些方法大都比较昂贵，且实验操作繁琐，耗时较长。
影响纳米粒子与蛋白质相互作用的因素非常多，如纳米粒子的物理化学性质(大小、形状、表面电荷、亲疏水性、表面基团等)、蛋白质与纳米粒子的比例、吸附的蛋白质构象的转变等，所以该过程在不同研究体系下会有很大差别[13~17]。发展和应用不同的检测方法来对纳米粒子与蛋白质相互作用进行研究，有助于了解其作用机制以及开发安全的生物纳米材料[18]。
Taylor弥散(Taylor dispersion)是一种特殊的扩散机制。压力驱动的流体在通道内稳定流动时，其流速在流动方向上呈现抛物线型的分布，即流速在通道中心最大，而在管道壁上几乎为零; 当样品塞注入通道后，其界面上不同位置具有不同的流速，同时样品塞内的溶质本身存在轴向扩散，扩散作用和对流作用相结合形成Taylor弥散，最终导致样品塞展宽。
Bello等[19]首先将Taylor弥散分析(Taylor dispersion analysis，TDA)用于测定溶液中大分子的扩散系数。近年来，这种方法已经被广泛应用于长毛细管和液相色谱中纳米粒子扩散系数及水合半径的测定[20]。Jensen等[21]将TDA与UV-vis结合提出了一种新的非共价相互作用的研究方法，选取α-萘酚和β-环糊精作为研究对象，通过测定α-萘酚自身以及其与β-环糊精非共价相互作用后的扩散系数，得到了两者分子间的相互作用常数。
本研究以微流控芯片为平台，将TDA与激光诱导荧光检测(LIF)结合，实现了荧光素钠标记狗血清蛋白(FITC-DSA)的高通量、实时检测，并初步研究了不同粒径AuNPs与FITC-DSA的相互作用特性。本方法具有简单快速、易集成、样品消耗量少、数据易处理等优点，为纳米粒子与蛋白质相互作用提拱了一种新的研究方法，对纳米材料的毒性研究和生物粒子的分析检测具有一定意义。
BI-200SM动态光散射仪(布鲁克公司); JEM-2100透射电子显微镜(Transmission electron microscope，TEM，日本电子株式会社); 荧光仪(Cary Eclipse Fluorescence Spectrum, Agilent公司); LongerPump TS-1B/W0109-1B注射泵(保定兰格恒流泵有限公司); KW-4A型匀胶机(鑫有研电子科技有限公司); PDC-32G氧等离子体处理机(Oxygen plasma，美国Harrick公司); Eclipse Ti-U荧光倒置显微镜(Inverted fluorescence microscope, 日本Nikon公司)，配有高灵敏度DS-Fi1CCD彩色视频照相机; 使用自制的激光诱导荧光检测器并配有显微镜用以控制微流控芯片管道与激光检测点的对准。
FITC-DSA(Fluorescein isothiocyanate conjugate dog albumin)(美国Sigma公司); 金纳米粒子(15、30和50 nm，南京中镜科仪技术有限公司)。FITC-DSA溶液由5 mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)稀释配制而成，使用前用0.22 μm的醋酸纤维酯膜(上海新亚净化公司)过滤。所有溶液均用二次蒸馏水(18 MΩ·cm, Milli-Q, Millipore公司)配制。硅片(洛阳单晶硅厂); PDMS预聚体和固化剂(美国Dow Corning公司); Pluronic F127(Sigma公司); SU-8 2025光刻胶(美国Microchem公司)。
要实现Taylor弥散分析，需要满足以下两个基本条件:
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(1) |
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(2) |
其中D为分子扩散系数，tR为保留时间(样品塞从进入分离通道起，直至到达检测点的时间)，RC为分离通道的内径，μ0为分离通道内流体的平均线速度。
只有当流速和管道内径符合以下条件时，才能形成Taylor弥散。
从上述条件可知，由于D是一个很小的固定值(10-11 m2/s)，皮克列数Pe很容易满足条件，为使τ值符合条件，需要使tR较大，RC较小。所以在设计实验芯片时，有两个要求：首先分离通道要长，以增加保留时间; 其次，分离管道内径要小。结合这两点，实验中使用的芯片设计(掩膜)如图 1A。通过设计蛇形通道，有助于在较小的分析区域内实现长管道分离; 进样通道宽度为75 μm，分离通道宽度为150 μm，其中折线形的进样通道设计有助于减少在进样过程中产生的样品损失。通过利用SU-8光刻技术和PDMS (Polydimethylsiloxane)浇注复制的方法制作得到相应芯片[22, 23]，利用显微镜结合相应的软件，可以测量芯片的尺寸。图 1B-a为通道截面图，可见通道呈梯形结构，上下两边分别为156.6和102.4 μm，通道深度为48.2 μm。图 1B-b为进样端的俯视图，图 1B-C和图 1B-d为管道直线部分与蛇形部分的俯视图。
如图 2所示，实验前需通过显微镜将LIF(激光诱导荧光)检测点f与微通道对准。实验过程中采用压力驱动，首先启动a处连接的Pump 1，将样品由a驱动至b，这样在e处即可形成样品塞; 然后启动c处连接的Pump 2，驱动Buffer由c经过f到达d。e处形成的样品塞在通道内流动时产生Taylor弥散，到达LIF检测点f后，可由Ni 2009软件监测荧光强度(点e和点f之间的通道距离为35 cm)。
将PBS缓冲液和一定浓度的FITC-DSA分别加入与Pump 2和Pump 1连接的注射器中，根据实验所需流速设置Pump 2和Pump 1的参数，然后进行样品塞进样，并利用LIF对FITC-DSA的荧光信号进行监测。在FITC-DSA与纳米粒子相互作用研究中，不同粒径的金纳米粒子(15、30和50 nm)与FITC-DSA混合均匀，分别进行了Taylor弥散分析(TDA)和稳态荧光分析(Steady-state fluorescence analysis, SFA)。
由TEM图(图 3)可见，15、30和50 nm金纳米粒子呈现良好的球状，且粒径分布比较均一。
为了考察信号的重现性，使用50 μg/mL FITC-DSA，在进样流速为5 μL/min(进样时间8 s)，分离流速为3 μL/min条件下进行样品塞进样，测定了连续两次实验中FITC-DSA的荧光信号。如图 4A所示，信号峰的信噪比很大，峰形完整，没有拖尾，基线稳定，且具有良好的重现性。
(A) Repeatability of LIF determination with a same concentration of FITC-dog serum albumin (DSA) : 50 μg/mL; flow rate of loading: 5 μL/min; time of loading 10 s; flow rate of separation: 3 μL/min; (B) Optimization of injection time of FITC-DSA. Injection time: 3, 5, 8 and 10 s. Concentration of FITC-DSA: 50 μg/mL; flow rate of loading: 5 μL/min; flow rate of separation: 5 μL/min; (C). Effect of flow velocity on LIF signal. Flow velocity: 3, 5, 8, 10 and 15 μL/min. Concentration of FITC-DSA : 50 μg/mL; flow rate of loading: 5 μL/min; time of loading: 10 s.
为确定实验过程中的进样时间，以50 μg/mL FITC-DSA为分析物，进样流速为5 μL/min，分离流速为5 μL/min，分别考察了进样时间为3、5、8和10 s时的信号。如图 4B所示，随着进样时间延长，信号逐渐增加，8 s后趋于平稳; 出峰时间保持不变，但峰宽逐渐增加。综合考虑，选择10 s作为进样时间。
以50 μg/mL FITC-DSA进行样品塞进样，进样流速为5 μL/min，进样时间为10 s，分离流速为3、5、8、10和15 μL/min，得到一系列FITC-DSA样品塞的荧光信号。如图 4C所示，随着分离流速增加，出峰时间和峰宽逐渐减小，这是样品塞到达和经过检测点的时间均减小所致。其次，随着流速增加，样品塞信号逐渐变小，最后趋于稳定，且信号峰的对称性逐渐下降。这是由于流速增加时，样品塞在微通道中受到的对流作用加强，从而逐渐偏离理想的Taylor弥散所致。
样品塞在微管道内流动时，其溶质的扩散和对流作用共同导致Taylor弥散的产生。由此得到关于分析物浓度的对流扩散方程(3)，即溶质的局部浓度C与轴向位置x，径向位置r以及时间t的关系：
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(3) |
其中，u是平均流速，RC为管道半径，D为溶质的扩散系数。
如果在分离通道的某一点对不同时间样品的平均浓度C进行监测(如本实验中的激光诱导荧光检测)，可以得到信号-时间曲线。对于样品塞进样，上述方程可变为：
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(4) |
其中，k为溶质的表观扩散系数，M为溶质的摩尔质量，tR为样品塞的保留时间，σ2为信号峰的方差(与峰宽有关)。k和σ2分别满足关系式：
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(5) |
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(6) |
结合(5)和(6)两式可得：
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(7) |
利用方程(4)对实验得到的信号曲线进行拟合，即可得到的tR和σ2的值，进而可以根据(7)求出溶质的扩散系数D。
此外，假定生物分子为球形，根据Stokes-Einstein方程(8)还可以进一步计算出生物分子的尺寸：
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(8) |
其中，玻尔兹曼常量(Boltzman constant)k=1.3806505×10-23 J/K，T为温度(K)，η为流体的粘度，r为流体中的粒子的水合半径。
分离通道的半径RC可根据通道截面的参数计算而得。由于通道截面呈梯形结构，可引入水力半径rH和当量直径de表征RC(RC为当量直径de的1/2)：
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(9) |
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(10) |
其中，润湿周边长(Wetted perimeter, π)是指流体与管壁接触的周边长度，即通道截面的周长; 流通截面积(Flow area, A)是指通道截面的面积。通过计算可得水力半径rH=16.88 μm，故当量直径de=67.52 μm，分离通道半径RC=33.76 μm。
在Taylor弥散条件下进行样品塞进样时，荧光强度与时间的关系满足方程(4)。通过简化方程中的参数，可以得到如下关系：
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(11) |
其中a，b，c为3个定量，其中b为保留时间tR，c-2为方差σ2。在Matlab中利用方程(11)对实验得到的信号曲线进行拟合，即可得到a，b，c的值。
取实验中的一组数据进行模拟(实验条件为：FITC-DSA浓度50 μg/mL，进样流速5 μL/min，进样时间3 s，分离流速5 μL/min)，结果如图 5所示。从拟合结果可以得到如下数据：a=1.18(1.171, 1.190)，b=110.8(110.7, 110.9)，c=0.0837(0.0829, 0.08449)，曲线拟合度为0.9699。故保留时间tR=110.8 s，方差σ2=142.7 s2。同样方法处理其余数据，可以得到不同流速下的tR和σ2值。
实验过程中，室温为298.15 K，此时溶液粘度为0.8949 Pa/s，分离通道半径RC=33.76 mm，结合tR和σ2值，可根据方程(7)和方程(8)计算得到FITC-DSA的扩散系数D和水合半径r(表 1)。由表 1可得平均扩散系数为(5.04±1.48)×10-11 m2/s，平均水合半径为(5.21±1.54) nm。根据D和r与分离流速的关系作图(图 6)。随着流速增加，实验测得的扩散系数值逐渐增大，FITC-DSA的水合半径值逐渐减小。经过动态光散射(DLS)测定，FITC-DSA的平均水合半径为7.25 nm，略大于实验得到的平均值，与3 μL/min流速下的实验结果相符。
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| 流速 Flow rate (μL /min) | 3 | 5 | 8 | 10 | 15 |
| D (10-11 m2/s) | 3.33 | 4.09 | 4.90 | 5.73 | 7.15 |
| r (nm) | 7.41 | 5.97 | 4.99 | 4.27 | 3.42 |
Taylor弥散分析得到的FITC-DSA粒径随流速增加而逐渐减小，这是由于高流速下，对流作用加强，样品塞在流体中偏离理想的Taylor弥散，方程(4)不再适用导致的。根据Taylor弥散需满足的条件，即方程(1)和方程(2)，对不同流速进行了考察。有两点需要注意：首先，实验中的分离流速为体积流量，需换算为线速度(除以截面积); 其次，假设FITC-DSA的扩散系数为5×10-11 m2/s。将线速度与保留时间值代入方程(1)(2)，得到一系列τ和Pe的值，列于表 2。
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| 流速Flow rate (μL/min) | 3 | 5 | 8 | 10 | 15 |
| τ | 6.23 | 4.18 | 2.87 | 2.51 | 1.81 |
| Pe (103) | 5.40 | 9.00 | 14.4 | 18.0 | 27.0 |
由表 2可知，Pe值始终满足条件，但τ值在高流速下逐渐偏离了远大于0.14的条件，因而对应流速下的实验结果置信度不高。若以20倍作为远大于的标准，选取流速为3、5和8 μL/min下的实验结果计算扩散系数D和水合半径r，得到平均扩散系数D=(4.11±0.78)×10-11 m2/s，平均水合半径r=(6.12±1.21) nm。
图 7A和7B分别为不同粒径的AuNPs与FITC-DSA混合后，Taylor弥散分析(TDA)和稳态荧光分析(SFA)的结果。由图 7可见，在微流控芯片内，不同粒径的AuNPs与FITC-DSA的作用不同：15和30 nm的AuNPs与FITC-DSA作用后，荧光强度降低，这与SFA结果一致; 50 nm的AuNPs与FITC-DSA作用后，荧光强度增加，与SFA结果相反。此外，15和30 nm的AuNPs与FITC-DSA作用后保留时间基本不变，且峰宽变小; 而50 nm的AuNPs保留时间变小，且峰宽变大。上述结果一方面证明了不同大小的AuNPs与蛋白质的作用不同; 另一方面表明了微观体系内AuNPs与FITC-DSA的作用方式与宏观体系不同。
本研究在微流控芯片中利用Taylor弥散分析(TDA)与激光诱导荧光检测(LIF)成功实现了FITC-DSA的高通量、实时检测，并通过理论模拟得到其水合半径为6.12±1.21 nm，扩散系数为(4.11±0.78)×10-11 m2/s。初步研究了不同粒径的AuNPs与FITC-DSA之间的相互作用特性, 一方面证明了不同大小的AuNPs与蛋白质的作用不同, 另一方面也发现了在微流控体系内AuNPs使FITC-DSA荧光增强的反常现象。本研究提出了一种研究纳米粒子与蛋白质相互作用的新方法，具有简单快速、仪器易集成、样品消耗量少、数据易处理等优点。本方法有助于深入了解纳米材料的毒性，推动安全纳米药物的发展。
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图 1 微流控芯片光刻掩膜设计图(A)及芯片通道尺寸表征：(B-a)通道横截面; (B-b)进样通道俯视图; (B-c)分离通道直线部分; (B-d)分离通道蛇形部分
Figure 1 Schematic representation of the mask designed in experiment (A) and polydimethylsiloxane (PDMS) replica viewed under microscope: (B-a) cross-section of channel; (B-b) top view of injection channel, (B-c) separation channel with line section and (B-d) spiral section.
图 2 样品驱动与检测过程
Figure 2 Schematic representation of sample driving and detection process. LIF, Laser-induced fluorescence
图 3 不同尺寸金纳米粒子的透射电镜表征照片：(A)15 nm; (B)30 nm; (C)50 nm。
Figure 3 Transmission electron micrographs (TEM) of gold nanoparticles (AuNPs) with diameter of 15 nm (A), 30 nm (B) and 50 nm (C)
图 4 实验条件优化：(A)LIF检测重现性; (B)FITC-DSA的进样时间优化; (C)分离流速优化。
Figure 4 Optimization of experimental conditions
(A) Repeatability of LIF determination with a same concentration of FITC-dog serum albumin (DSA) : 50 μg/mL; flow rate of loading: 5 μL/min; time of loading 10 s; flow rate of separation: 3 μL/min; (B) Optimization of injection time of FITC-DSA. Injection time: 3, 5, 8 and 10 s. Concentration of FITC-DSA: 50 μg/mL; flow rate of loading: 5 μL/min; flow rate of separation: 5 μL/min; (C). Effect of flow velocity on LIF signal. Flow velocity: 3, 5, 8, 10 and 15 μL/min. Concentration of FITC-DSA : 50 μg/mL; flow rate of loading: 5 μL/min; time of loading: 10 s.
图 5 荧光-时间数据的拟合曲线
Figure 5 Fitting curve of experimental data obtained by LIF. Concentration of FITC-DSA : 50 μg/mL; flow rate of loading: 5 μL/min; time of loading 3 s; flow rate of separation: 3 μL/min.
图 6 FITC-DSA的扩散系数(A)及水合半径(B)与分离流速关系图
Figure 6 (A) Fitted diffusion coefficient and (B) hydrated radius (r) of 50 μg/mL FITC-DSA as a function of flow rate
图 7 FITC-DSA和AuNPs相互作用后产物的荧光信号：(A)TDA法; (B)SFA法
Figure 7 Fluorescence intensity of complex of FITC-DSA and AuNPs measured by (A) Taylor dispersion analysis (TDA) method, (B) Steady-state fluorescence analysis (SFA) method
表 1 不同分离流速下得到的FITC-DSA的扩散系数(D)和水合半径(r)
Table 1. Fitted diffusion coefficient (D) and hydrated radius (r) of 50 μg/mL FITC-DSA with different flow rates
| 流速 Flow rate (μL /min) | 3 | 5 | 8 | 10 | 15 |
| D (10-11 m2/s) | 3.33 | 4.09 | 4.90 | 5.73 | 7.15 |
| r (nm) | 7.41 | 5.97 | 4.99 | 4.27 | 3.42 |
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表 2 不同分离流速下的τ值和Pe数
Table 2. τ and Pe of 50 μg/mL FITC-DSA at different flow rate
| 流速Flow rate (μL/min) | 3 | 5 | 8 | 10 | 15 |
| τ | 6.23 | 4.18 | 2.87 | 2.51 | 1.81 |
| Pe (103) | 5.40 | 9.00 | 14.4 | 18.0 | 27.0 |
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