English

• 1.   氟固相萃取简介

  人类对氟代有机化合物的合成与应用的研究始于19世纪末，但直到20世纪90年代，以全氟碳化合物为特征的氟化学技术才开始蓬勃发展起来。1993年，全氟烷烃和全氟三烷基胺作为惰性溶剂，首次被应用于有机合成^[1]。1994年，氟两相体系的概念被首次提出^[2]，以此为基础的液-液萃取技术受到了广泛认可，并得到了发展^[3]。基于与之类似的原理，氟固相萃取(Fluorous solid-phase extraction，FSPE)技术几乎是在同一时期发展起来，并被应用于有机合成领域^[4]。该技术的基本流程是先在目标化合物分子上键合氟标签(通常为直链饱和全氟烷烃)，然后通过高氟化固相吸附剂，利用氟-氟相互作用，实现目标分子的分离和纯化^[5]。作为一种液相反应结合固相萃取的合成与分离手段，氟固相萃取技术至今仍受到许多合成化学家的青睐^[6~10]。

  近十年来，氟固相萃取技术在有机合成领域的广泛引用也引起了许多分析与生物化学家们的注意，将氟固相萃取及其相关技术拓展到生物分离和分析领域成为了这一技术发展的热点。近年来，由于氟固相萃取和质谱技术之间良好的兼容性，越来越多基于这两者结合分析生物分子的科研成果被报道。为此，本综述将在简要介绍氟固相萃取技术的原理和发展趋势的基础之上，重点介绍基于氟固相萃取、针对目标生物分子的质谱分析新方法。

  2.   氟固相萃取技术的原理及发展趋势

  2.1   氟固相萃取技术的原理

  在自然界中，全氟烷烃是一类较为特殊的物质。从分子结构上来说，全氟烷烃是将普通烷烃中所有氢原子用氟原子取代而形成的(图 1A)。由于都是非极性分子，全氟烷烃和普通烷烃一样，都具有较高的疏水性。但和普通烷烃相比，全氟烷烃的疏水性更强，这主要是因为氟原子的原子半径大于氢原子，使得全氟烷烃的分子截面积更大。在与水分子接触时，虽然普通烷烃和全氟烷烃的固有疏水性相似，但由于全氟烷烃有着更大的疏水表面，因此展现出了更强的疏水性^[11]。另一方面，由于氟原子极化率低，全氟烷烃分子之间的范德华作用力弱于普通烷烃，导致其与普通烷烃之间的互溶性变差；在室温下，全氟烷烃也几乎不溶于常见的有机溶剂，如甲苯、四氢呋喃、丙酮等，体现出了良好的疏油性(图 1B)^{[12, 13]}。而与疏水性和疏油性相对的是，全氟烷烃与其它全氟化合物(如全氟胺、全氟醚等)之间有着良好的互溶性，同时也是理想的气体溶剂，能够溶解大量的氢气、氧气、氮气、二氧化碳等气体^{[11, 12]}。因此，全氟烷烃及其类似全氟化合物在有机合成和催化领域都有着广泛的应用。与此同时，其在材料领域的应用也十分普及，如日常生活中常见的“不粘涂层”就是聚四氟乙烯高分子。而氟固相萃取技术的基本原理，也正是基于上述全氟烷烃及其类似全氟化合物的特殊性质。

  图 1

  

  图 1.  (A) 普通烷烃和全氟烷烃分子结构示意图及(B)两者与水构成的三相体系^[13]

  Figure 1.  (A) Molecular structure of hydrocarbon and perfluorocarbon and (B) triphasic system established by mixing them with water^[13]

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  正如上文所述，氟固相萃取技术的基本流程是先在目标化合物上键合氟标签，然后再通过高氟化固相吸附剂，利用氟-氟相互作用，实现目标分子的分离和纯化。在有机合成领域，氟固相萃取更多的是用于合成中间体的去除或产物的分离纯化。而在化学和生物分析领域，氟固相萃取则常结合芯片技术、色谱技术、质谱技术等手段，用于目标分子的分离和检测。对于这一技术而言，最关键的两大因素是氟标签试剂和高氟化固相吸附剂的选取。

  全氟烷烃链的高化学稳定性使得氟标签试剂易于合成且家族成员众多，且可以依据其带有的氟标签部分以及活性官能团的不同进行分类。氟标签部分通常为直链饱和全氟烷烃链，含有7~20个氟原子。一般认为氟原子越多，用作氟标签进行分离的效果越好，但这并不意味着只有在较多氟原子存在的情况下，氟标签和高氟化固相吸附剂之间的氟-氟相互作用才存在。事实上，基于色谱方法的研究结果已经表明，即使分子中只有一个sp³杂化的碳原子上连接的所有氢原子被氟原子取代，该分子和高氟化固相吸附剂之间相互作用的改变就已足够明显^[14]。而根据氟标签试剂中含有的不同官能团(如氨基、羧基、碘乙酰胺基、羟基琥珀酰亚胺酯基等等)，分离的目标分子也不尽相同。种类繁多的氟标签试剂极大地促进了氟固相萃取技术的推广和应用。

  在高氟化固相吸附剂方面，现最常用的是全氟二氧化硅材料，即键合了全氟烷烃硅烷偶联剂的二氧化硅材料^{[15, 16]}。其中，商业化的氟固相萃取材料以Fluorous Technologies公司的Fluorous NuTips为代表。除了用于氟固相萃取，全氟二氧化硅还被广泛用作为液相色谱固定相。因为全氟烷烃链是非极性的，所以此类色谱柱的特性和常规的反相色谱柱类似。但和常规反相色谱不同的是，在全氟固定相色谱中，单个—CF₂—基团导致的分子保留时间的差异要大于单个—CH₂—基团导致的差异，而在常规的反相色谱中则恰恰相反。这一特性使得全氟固定相色谱更加适合含氟化合物的分离和分析^{[14, 17]}。为了区别于反向色谱中常用到的亲疏水性的概念，在氟固相萃取和全氟固定相色谱中，亲氟性和疏氟性常被用于描述特定分子和高氟化固相吸附剂之间相互作用的能力。

  2.2   氟固相萃取技术的发展趋势

  正如前文所述，氟固相萃取技术源于有机合成领域，是氟两相体系的一类衍生技术，经历了二十多年的应用和发展，至今仍受到许多合成化学家的青睐。近年来，更多结合氟固相萃取的化学与生物合成策略的发表，体现了这一技术在合成领域依然有着广阔的发展前景^[6~10]。另一方面，氟固相萃取技术在合成领域的应用，也推动了其在化学和生物分析领域的发展。2005年，这一技术首次被应用到蛋白质组学^[18]和单糖微阵列芯片的制备之中^[19]。此后，基于该技术的多功能蛋白探针^[20]、酶活检测芯片^[21]、小分子和药物芯片^[22]，以及代谢组^[23]、糖组^[24]研究策略也开始陆续发展起来。

  氟固相萃取技术在各个领域，尤其是生物分析领域的广泛应用，极大地推动了新型氟标签试剂和高氟化固相吸附剂的发展(图 2)。氟标签试剂方面，由于在分析科学中，氟标签试剂扮演的角色已不再只是用于纯粹的分子衍生和辅助分离，更需要辅助未知分子的定性与定量分析研究，因此具备高富集效率、高特异性反应官能团的氟标签试剂，或是多功能化的氟标签试剂的合成和应用，是主流发展趋势。而为了兼容各类分析方法，近年来，除了如具有光化学反应活性^[25]，或是同位素标记的氟标签试剂之外^[26]，具有光学特性以及良好生物兼容性的氟标签试剂的合成和应用亦有文献报道^[27]。在高氟化固相吸附剂方面，除了前面所提到的常规全氟二氧化硅之外，新材料的制备和应用也颇受关注，如对全氟二氧化硅进行改良设计，使其带上新的功能(如磁性全氟二氧化硅^[28~30])，便是高氟化固相吸附剂的一大发展方向。本课题组将氟化石墨这一高氟化碳类材料用于氟固相萃取，相比于商业化的氟固相萃取柱，氟化石墨不仅因为工艺较成熟而价格低廉，而且展现出更好的富集选择性、更低的富集检出限和更高的富集回收率，是商业化氟固相萃取柱的良好替代品。由于氟化石墨中很少含有杂原子，其含氟比例接近1:1(摩尔比，氟原子:碳原子)；同时，由于材料中的碳原子均为sp³杂化，其表面碳、氟原子构成的整体结构和常用氟标签试剂中的碳、氟原子结构十分相似，这些特点赋予了氟化石墨良好的氟固相萃取性能^[31]。除微粒状材料之外，将聚四氟乙烯滤膜用作高氟化固相吸附材料的工作亦有报道^[32]。而另一方面，基于氟标签的高疏水性，利用常规C₁₈小柱替代全氟二氧化硅小柱的策略，也为商业化氟固相萃取柱提供了可选的替代材料^[33]。近年来，在氟固相萃取参与的各类生物分析应用中，将其用于组学研究的相关技术发展最为迅速，这主要是因为氟固相萃取和生物质谱技术之间良好的兼容性。氟标签的引入不仅有助于目标分析物的分离富集(图 3A)，而且由于氟标签自身的疏水性，还能够提高目标分析物的质谱响应信号(图 3B)。另一方面，由于氟标签自身良好的稳定性，使得目标分析物分子在串级质谱碎裂过程中所产生的碎片离子更加容易被预测，不会因为标签部分的碎裂产生大量不规则的碎片离子，而且这些带有氟标签的特征碎片离子可以为目标分子的定性分析提供更多的分子结构信息(图 3C)^[34]。又由于氟-氟相互作用带有部分疏水作用的特征，氟固相萃取通常在较低有机相条件下上样和清洗，而在高有机相甚至纯有机相中进行洗脱，因此非常适合于质谱检测前的样品脱盐^{[24, 31]}。正因为这些特征，基于氟固相萃取的生物质谱分析新方法颇受相关领域研究者的关注。本综述的后半部分将对这些新方法及其应用领域做详细介绍。

  图 2

  

  图 2.  氟固相萃取可选用的商业化的高氟化固相吸附剂

  Figure 2.  Commercially available candidates of perfluorinated solid phases forfluorous solid-phase extraction (FSPE)

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  图 3

  

  图 3.  氟固相萃取与质谱技术之间的兼容性示意图

  Figure 3.  Illustration of compatibility between FSPE and mass spectrometry (MS) analysis

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  3.   基于氟固相萃取的生物质谱分析

  3.1   氟蛋白质组学

  氟固相萃取技术被引入生物分析之初，便被应用于蛋白质组学研究领域，并被视为生物素标签富集技术的良好替代品，在功能蛋白质组研究中具有广阔的应用前景。而氟蛋白质组学(Fluorous proteomics)的概念也是在这一时期被提出并被广泛接受的。相对于传统的生物素标签技术，氟标签不仅同样能够辅助目标分子的分离富集，同时具有更好的质谱兼容性和相对低廉的实验成本。通过带有不同官能团的氟标签试剂，结合高选择性的化学反应和特定的分析流程，利用氟固相萃取技术能够有效地从复杂样品中分离目标肽段或肽段子集，用于质谱检测。因为目标底物可以是带有特定氨基酸(如半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸等)的肽段，也可以是带有特定翻译后修饰基团(如磷酸化、泛素化等)的肽段，良好的普适性使得其在蛋白质组学领域中的应用从一开始就备受关注(图 4)^[18]。尽管早期的工作基于基质辅助激光解吸电离质谱(MALDI-MS)，只能分析较为简单的生物样品，但随着越来越多基于液质联用技术的工作被报道，氟固相萃取技术在复杂的蛋白质组样品分析方面的研究热度也在不断提升。

  图 4

  

  图 4.  氟蛋白质组学整体流程^[18]

  Figure 4.  Illustration of overall method of fluorous proteomics^[18]

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  在蛋白质组学研究领域中，翻译后修饰组学研究是一大热点。这是因为蛋白质的翻译后修饰与其功能有着密切的联系。由于蛋白质翻译后修饰大多数情况下是在蛋白质特定的氨基酸侧链上结合特定的化学基团，这些基团通常具独特的化学性质。因此，基于化学反应的蛋白质翻译后修饰研究方法被认为是一类十分有效的研究策略^[35]。由于氟固相萃取建立在氟标签试剂与底物之间特异性化学反应的基础上，故而氟蛋白质组学的一个重要发展方向便是其在蛋白质翻译后修饰研究领域中的应用。虽然氟蛋白质组学发展的早期已经有一些针对蛋白翻译后修饰的工作报道^{[18, 36]}，但真正将其应用到规模性的蛋白质翻译后修饰组研究中的工作始于2011年^[37], 研究者将这一技术应用到了酪氨酸硝基化的研究中(图 5A)，该方法的基本流程是先将胰酶酶解肽段的自由氨基封闭，并用连二亚硫酸钠将被修饰酪氨酸侧链上的硝基转变为氨基，然后再利用氟标签试剂特异性地反应新生成的氨基，最后通过氟固相萃取分离富集修饰肽段，用于质谱分析。研究者利用这一策略，成功地在人肝癌HuH-7细胞系裂解液中鉴定到了来自28个蛋白的28条酪氨酸硝基化肽段，并对这些肽段的串级质谱谱图进行了手工验证。该工作为蛋白质酪氨酸硝基化研究提供了可靠的研究方法，也为氟固相萃取技术在蛋白质翻译后修饰领域的应用提供了宝贵的参考。本课题组将氟固相萃取技术应用到了蛋白质4-羟基壬稀醛(4-Hydroxynonenal，HNE)修饰组的研究中^[38]。蛋白质的HNE修饰与许多心血管和神经性疾病息息相关，主要发生在蛋白质的半胱氨酸、组氨酸、赖氨酸以及少量的精氨酸上。蛋白质HNE修饰肽段的特征是其化学结构中含有醛基，为此选用了带有羟胺基团的氟标签试剂，利用肟点击化学反应，实现了HNE修饰肽段的高效氟标签衍生。氟标签的引入在辅助修饰肽段分离富集的同时，也有效地提高了修饰肽段的离子化效率和质谱信号，改善了串级谱图质量。利用氟固相萃取结合质谱分析的方法，我们成功地在经HNE小分子刺激的乳腺癌MCF-7细胞系裂解液中鉴定到了432个潜在HNE修饰蛋白，包含661条修饰肽段，对应于673个修饰位点。这是目前MCF-7细胞系中对HNE修饰研究的最大规模数据，也是氟固相萃取技术在单个蛋白质翻译后修饰研究中达到的最大规模数据。

  图 5

  

  图 5.  基于氟固相萃取的(A)酪氨酸硝基化修饰组^[37]和(B)4-Hydroxynonenal(HNE)修饰组研究策略^[38]

  Figure 5.  FSPE-based strategies for investigation of (A) tyrosine nitration^[37] and (B) protein 4-hydroxynonenal (HNE) modification proteome^[38]

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  由于氟标签试剂种类繁多，带有的功能基团选择也很多，因此，未来会有更多利用氟固相萃取的蛋白质组学研究技术——尤其是翻译后修饰蛋白质组学研究技术——被报道并取得良好的实际应用效果。又由于氟固相萃取利用氟-氟相互作用，其整体流程，包括偶联、清洗、洗脱所需用的实验条件均较为温和，不需要引入强酸、强碱或高温，因此在处理一些无法耐受苛刻条件的蛋白质组样品过程中具有潜在的应用优势，特别是针对原本较不稳定的翻译后修饰的研究。这些因素都必将使得氟蛋白质组学在未来一段时间内依然会是氟固相萃取技术发展和应用的重要方向之一。

  3.2   氟糖组学

  蛋白质糖基化在细胞的成长和分化、细胞识别，以及细胞内和细胞间的信号转导等生物学过程中都起着不可替代的作用，并且普遍被认为与炎症、肿瘤的发生机理息息相关^{[24, 39~41]}。哺乳动物中超过50%的蛋白质存在糖基化修饰^[42]。作为一种重要而广泛存在的蛋白质翻译后修饰，糖基化同时又是现今发现的结构最为复杂的修饰。除了修饰位点和连接方式的多样性(N-糖基化或O-糖基化)，糖链的微观不均一性(尤其是N-糖链)更是糖基化研究的主要难点之一^{[43, 44]}。在分子层面对糖链进行研究，生物质谱分析是一种十分有效的定性和定量方法。但由于糖链是多羟基化合物，亲水性较强，在质谱分析过程中离子化效率较低，因此在糖链研究过程中，为了得到较好的糖链质谱谱图，往往需要对生物样品中的糖链进行纯化或化学衍生，以减少样品中其他杂质的干扰并且提高糖链的质谱响应信号^{[45, 46]}。而氟固相萃取技术的特点，极好地契合了糖组学的研究需求。

  基于上述考虑，本课题组将氟固相萃取技术应用到了糖组学的研究，并实现了针对复杂生物样品N-糖组的研究^[24]。分析流程方面，本课题组使用了N-糖组研究中普遍采用的PNGase F酶切方法，将N-糖链从糖蛋白上释放下来；随后选用了带有氨基的氟标签试剂，利用还原胺化反应，对N-糖链的还原端进行了高效的氟标签衍生，进而利用商业化的氟固相萃取小柱实现了针对N-糖组的分离富集(图 6)。氟标签的衍生不仅提高了糖链的质谱信号，提升了糖链的检测灵敏度，而且也改善了糖链二级谱图的质量，提升了部分带有结构信息的碎片离子的信号，有助于一部分糖链同分异构体的鉴定；通过氟固相萃取，糖链能够有效地从复杂样品中被分离富集出来，消除了盐和蛋白对于分析检测的影响。利用这一流程，成功地对人血清N-糖组进行了分析，利用MALDI-MS共检测到了34条经过衍生后的N-糖链。Zhao等^[29]在这一工作的基础上，用新型介孔全氟二氧化硅磁性材料替代了商业化的氟固相萃取小柱，在进一步提升富集选择性的同时，简化了分析操作的流程，为高通量、高效率的氟糖组学技术发展提供了重要的研究参考。

  图 6

  

  图 6.  氟糖组学整体流程^[24]

  Figure 6.  Illustration of overall method of fluorous glycomics^[24]

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  糖链分析是蛋白质糖基化研究的重要方向，也是糖生物学发展的重要基础之一。随着越来越多糖链作为炎症、肿瘤标志物的研究工作被报道，糖组学新技术新方法的发展也将不断深入，将会有更多基于氟糖组学技术的糖链定性、定量方法被报道。尽管现有的氟糖组学方法还基于MALDI-MS分析，无法对实际生物样品中的糖链进行更为细致的结构分析，但由于氟标签自身的疏水性能够增强糖链在反相色谱中的保留^[47]，这一技术在糖组的液相色谱和质谱联用分析领域同样有着潜在的应用价值，这也将成为氟糖组学发展的一个重要方向。

  3.3   其它生物分子分析

  除了氟蛋白质组学和氟糖组学，氟固相萃取结合生物质谱的分析方法也为其他生物分子的研究提供了有效的手段，并受到了相关领域研究者的重视。

  在鞘糖脂的研究中，氟固相萃取结合生物质谱便被认为是一种有效的分析手段。鞘糖脂是糖脂的一类，由鞘氨醇、长链脂肪酸以及含有较短糖链的极性头部组成，是细胞膜的重要组成成分之一，在细胞黏附、生长、分化、信号传导等过程中发挥着重要作用。极性头部的多样性使得生物质谱成为了复杂样品中鞘糖脂分析的最佳手段，但是如何高效地纯化鞘糖脂一直都是这一研究领域中亟需解决的一个问题。Li等^[48]首次将氟固相萃取技术应用到了鞘糖脂的研究中，用于从复杂的脂质提取物中分离鞘糖脂用于质谱检测。在分析流程上，他们首先利用糖脂神经酰胺脱酰酶(SCDase)解离鞘糖脂上的脂肪酸，从而让鞘糖脂分子产生新的自由氨基，随后利用带有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯基的氟试剂衍生新产生的氨基，进而实现对鞘糖脂的分离富集。为了改善鞘糖脂分子的色谱分离和质谱响应信号，他们对分离后的鞘糖脂样品进行了进一步的全甲基化衍生。利用该方法成功地对天然牛脑组织中提取的神经节苷脂混合物中的糖鞘酯进行了分析研究。

  醛、酮类小分子化合物是生物体中另一类重要的内源分子，广泛参与细胞内各类代谢通路(尤其是糖类代谢)，被认为与糖尿病、癫痫等疾病相关，并且能够反映酗酒、厌食和营养不良等人体特征。生物质谱技术是一种能够系统性地对这类代谢分子进行研究的有效手段。但由于这些化合物在生物体中往往丰度较低，且多为极性化合物，常规的反相色谱结合质谱的分析方法较难于对这类分子进行定性、定量分析。为此，亟需一种既能分离富集，又能增强这类分子的反相色谱保留值的技术来辅助液质联用分析，从而实现对这类代谢分子的研究。Yuan等^[23]将氟固相萃取技术应用到了此类化合物的研究中，利用羟胺功能化的氟标签试剂，同样是通过肟点击化学的方式，实现了内源性醛、酮类化合物的高效衍生，进而通过氟固相萃取对这类化合物进行了分离富集。与此同时，由于氟标签的疏水性，这些极性分子在反相色谱中的保留值得到了提高，改善了色谱分离效果。利用该方法对不同浓度葡萄糖代谢条件下的人主动脉内皮细胞中的醛、酮类化合物进行了定性与定量分析，并进一步发现了色氨酸代谢的变化，验证了其与糖尿病及其并发症之间的关系。

  除此之外，氟固相萃取的技术还被应用到了内源性游离氨基酸^[49]、内源性高氟化合物^[50]等生物分子的研究中。正如前面所述，由于氟标签试剂的多样性，氟固相萃取技术将会被应用到更多生物分子的质谱和液相质谱联用分析中，这也将进一步推动此技术在多领域的应用。

  4.   展望

  从合成、催化到化学、生物分析，氟固相萃取在当代科学发展的过程中一直具有重要作用。另一方面，生物质谱是从分子层面研究动植物及人体中诸多内源性生物分子不可被替代的手段之一。由于氟固相萃取和生物质谱之间的良好兼容性，结合两者的生物分子分析新技术及新方法依然有较大的发展空间。这其中，新型氟试剂、高氟化固定相的合成及应用依然会是这一技术发展的重要方向，尤其是新型多功能氟试剂、高氟化固定相的出现，必将不断拓展这一技术在生物分析中的应用范围。而与此同时，不断拓展的分析对象及相关生物学功能的研究，也将为基于氟固相萃取的生物质谱技术在多个研究领域的推广起到积极的推动作用。可以相信，未来会有更多基于这一技术的优秀的科学研究工作，为生物化学研究填补更多的技术空白，也为现有的技术方法提供良好的替代或互补策略，从而推动相关研究领域的发展。

  
  
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  图 1  (A) 普通烷烃和全氟烷烃分子结构示意图及(B)两者与水构成的三相体系^[13]

  Figure 1  (A) Molecular structure of hydrocarbon and perfluorocarbon and (B) triphasic system established by mixing them with water^[13]

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  图 2  氟固相萃取可选用的商业化的高氟化固相吸附剂

  Figure 2  Commercially available candidates of perfluorinated solid phases forfluorous solid-phase extraction (FSPE)

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  图 3  氟固相萃取与质谱技术之间的兼容性示意图

  Figure 3  Illustration of compatibility between FSPE and mass spectrometry (MS) analysis

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  图 4  氟蛋白质组学整体流程^[18]

  Figure 4  Illustration of overall method of fluorous proteomics^[18]

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  图 5  基于氟固相萃取的(A)酪氨酸硝基化修饰组^[37]和(B)4-Hydroxynonenal(HNE)修饰组研究策略^[38]

  Figure 5  FSPE-based strategies for investigation of (A) tyrosine nitration^[37] and (B) protein 4-hydroxynonenal (HNE) modification proteome^[38]

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  图 6  氟糖组学整体流程^[24]

  Figure 6  Illustration of overall method of fluorous glycomics^[24]

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