碳纳米材料已成为21世纪科技创新的研究热点，其中零维碳材料碳点(Carbon dots，CDs)既具备传统碳材料良好的光学性能、热学性能、力学性能和机械性能，又具有良好旳水溶性、低毒性、易功能化、化学惰性、良好的生物相容性和抗光漂白性能[1]。碳点的制备可采用自上而下法，包括电弧光放电[2]、激光消融[3]、电化学[4]和化学氧化[5]法; 亦可采用自下而上法，包括支持法[6]、水热[7]和微波[8]等方法。不同的原料与合成方法可制得表面性质和光学性质不同的CDs。
血红蛋白(Hemoglobin，Hb)是红细胞中的主要蛋白质，约占红细胞蛋白质总量的90%，分子量约67000[9]。Hb的每个亚基由一条肽链和一个亚铁血红素分子构成，血红素中的铁有6个配位键，其中4个与血红素的环状结构相连，2个分别连接蛋白质和氧[9]。因此，Hb可以从肺部携带氧经由动脉血运送至组织，又能携带CO2经静脉血送到肺部。此外，Hb还具有调节血压、酶的性质以及抗菌功能[10~14]，对血红蛋白的研究在生命科学中具有重要意义。目前，Hb的定量分析方法主要有紫外-可见分光光度法[15]、电化学分析法[16]、荧光分析法[17]以及高效液相色谱法[18]等。
本研究建立了一种简单快速制备CDs的方法，以柠檬酸、硼酸、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)为原料，采用微波法一步制备硅和硼掺杂的碳点(SiBCDs)。在制备过程中加入钝化剂聚丙烯酸钠(PAAS)，可得到PAAS-SiBCDs，并可使荧光量子产率显著提高。血红蛋白的存在明显淬灭了PAAS-SiBCDs的荧光，据此建立了血红蛋白的检测方法。本方法可有效检测全血中的血红蛋白。
F-7000型荧光分光光度计(日本Hitachi公司)，狭缝宽度：5 nm; 激发波长：350 nm; 灯电压：600 V; U-3900型紫外-可见分光光度计(日本Hitachi公司); Nicolet-6700傅里叶红外光谱仪、ESCALAB 250光电子能谱仪(美国Thermo公司); MPDDY2094-X射线衍射仪(荷兰PANalytical公司); MOS-450圆二色光谱仪(法国Bio-Logic科学仪器公司)。
3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、葡萄糖(阿拉丁试剂有限公司); 硼酸、无水乙醇、硫酸奎宁、溴化钾、氯化血红素(国药集团化学试剂有限公司); 牛血红蛋白、牛血清白蛋白、肌红蛋白、细胞色素c(美国Sigma公司); 柠檬酸、HCl等试剂均为分析纯; 实验用水为二次去离子水(18 MΩ cm)。
取1000 mg柠檬酸和1000 mg硼酸加入烧杯中，加14 mL水溶解。在N2的保护下加入6 mL APTES，反应10 min后制得前驱体溶液。将前驱体溶液微波加热反应11 min(700 W，1 atm)，得到SiBCDs。加入15 mL二次去离子水溶解，过滤后用的透析袋(MWCO 100~500)透析3天，将透析袋内的溶液旋蒸浓缩，即得到纯净的SiBCDs。向前驱体中加入1000 mg PAAS，然后微波加热反应11 min(700 W，1 atm)，制得PAAS-SiBCDs，用去离子水清洗，透析并旋蒸浓缩后备用。采用硫酸奎宁参比法测定产物的荧光量子产率[19]。在满足吸光度A＜0.05的前提下，以硫酸奎宁溶液为参照，测得SiBCDs的荧光量子产率为20.1%，PAAS-SiBCDs的量子产率为34.6%。
10 μL SiBCDs溶液(42.6 mg/mL)或PAAS-SiBCDs溶液(50 mg/mL)分别加入490 μL不同浓度的Hb溶液中，采用10 mmol/L PBS将反应体系调整至pH 7.5，室温振荡均匀后，在350 nm激发波长下测其荧光强度。
图 1是SiBCDs和PAAS-SiBCDs的透射电镜图。从图 1A可见，SiBCDs为类球形，没有明显的聚集，自由分散在水溶液中，粒径范围4~8 nm。图 1B显示PAAS-SiBCDs为单分散的球形纳米颗粒，分散性更好，粒径更加均匀，其表面无任何聚合，这主要与PAAS-SiBCDs表面富含大量羧基相关，PAAS稳定了CDs表面的能量陷阱。PAAS-SiBCDs平均粒径为5.2 nm。
SiBCDs的X射线光电子能谱如图 2所示。SiBCDs有6个特征峰，分别为C1s峰(284.61 eV)、O1s峰(531.67 eV)、N1s峰(400.78 eV)、B1s峰(192.50 eV)和Si2s峰以及Si2p峰(101.94 eV)，说明SiBCDs已成功掺杂了硅原子和硼原子。C、N、Si、B和O的原子百分比分别为54.68%、8.09%、11.78%、0.66%和24.8%。
图 3为C1s、N1s、Si2p、B1s的高分辨XPS能谱图。其中SiBCDs的C1s峰可分为3个峰，其结合能分别为288.5、285.9和284.7 eV，分别对应C＝O、C—O/C—N和C—Si; N1s峰由401.45 eV的N—H和399.6 eV的C—N两个基团构成; Si2p峰主要在102.4和101.9 eV处，分别由Si—O键和Si—C键所产生[20, 21]; B主要以B—O键和B—C键的形式掺杂碳点中。Si和B掺杂的碳点可以有效改善碳点的电子特性，并提供更多的活性位点。上述实验结果表明，在SiBCDs中B主要以BO33－的形式存在，Si主要以Si—O键和Si—C键的形式存在。此结果与图 6b中红外光谱表征的结果吻合。
从PAAS-SiBCDs的XPS图谱(图 4)可见，其表现的特征峰分别为C1s峰(284.67 eV)、O1s峰(531.77 eV)、N1s峰(400.69 eV)、B1s峰(188.87 eV)、Si2s峰以及Si2p峰(01.89 eV)，且C、N、Si、B和O的原子百分比别为61.19%、4.7%、8.11%、0.40%和25.59%。与SiBCDs相比，各元素的含量均发生改变，说明PAAS成功修饰到SiBCDs中。被分解成片段的PAAS修饰到CDs表面后，使得PAAS-CDs表面含有大量羧基。从图 5可见，加入钝化剂PAAS前后，C和O的存在形式没有发生改变，只是各种化合键的百分含量有所变化。加入钝化剂PAAS后，C＝O的含量明显增加，羧基的含量也有所增加(表 1)。
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| C1s | O1s | ||||||
| C—Si/C＝C | C—O/C—N | C＝O | Si—O | C—O | C＝O | ||
| SiBCDs | 65.8% | 25.3% | 8.9% | 68.6% | 20.1% | 11.3% | |
| PAAS-SiBCDs | 63.0% | 25.1% | 11.9% | 21.2% | 29.5% | 49.3% | |
图 6A中虚线和实线分别代表SiBCDs和PAAS-SiBCDs的TG曲线。两条曲线共有两处相交，分别在135℃和277℃。温度低于135℃的质量变化(5.25%)由失水引起; 温度大于135℃时15.21%的质量损失是表面基团破坏所致; 而温度大于277℃的质量损失则由碳核分解引起[22]。
图 6B SiBCDs和PAAS-SiBCDs的红外光谱图中，3429 cm-1是O—H的伸缩振动峰，1631和1388 cm-1分别是COO—的不对称和对称伸缩振动峰，2929 cm-1是C—H键的伸缩振动峰，1128 cm-1是C—N的伸缩振动峰。这些数据表明SiBCDs表面含有大量—COOH和—OH官能团，大大增强了SiBCDs的水溶性，且有助于SiBCDs在生物分析中的应用。此外，1187 cm-1是B—O伸缩振动峰，1051和764 cm-1是Si—O弯曲振动吸收峰，说明Si和B已成功掺杂到CDs中[20, 23, 24]。PAAS-SiBCDs的红外光谱图表明PAAS-SiBCDs中的官能团种类与SiBCDs相比没有明显变化。从SiBCDs和PAAS-SiBCDs的X射线衍射谱(图 6C)可见，SiBCDs在22.8°处有一个很宽的衍射峰，此峰与碳的(002)晶面一致，说明SiBCDs和PAAS-SiBCDs晶格都有缺陷，均属于无定型碳点[21]。由SiBCDs和PAAS-SiBCDs的紫外-可见光谱(图 6D)可见，SiBCDs在200~600 nm范围内表现两个特征吸收峰，其中212 nm的吸收峰为CDs的sp2杂化区域的π-π*跃迁所致[25]，而334 nm的吸收峰是n-π*跃迁的贡献。
SiBCDs和PAAS-SiBCDs荧光光谱(图 7)表明二者的最大激发波长均为350 nm，最大发射波长为445 nm，在365 nm紫外灯照射下均发出蓝光。SiBCDs和PAAS-SiBCDs的激发波长分别在310~390 nm范围内时，随着激发波长的增加，最大发射波长位置几乎不发生改变。在不同激发光条件下，CDs的发射峰位置均未改变，只是荧光强度有所不同。造成这个现象的原因可能是透析处理后得到的SiBCDs和PAAS-SiBCDs粒径较为均匀，其表面的发射陷阱位点比较单一。
离子强度对SiBCDs和PAAS-SiBCDs荧光性能的影响如图 8A所示。当NaCl浓度高达2.0 mol/L时，SiBCDs和PAAS-SiBCDs仍然保持良好的稳定性，说明SiBCDs和PAAS-SiBCDs具有较好的抗盐能力，这将有利于其在生化分析检测方面的应用。
考察了体系pH值对SiBCDs和PAAS-SiBCDs荧光性能的影响(图 8B)。在pH 3时，SiBCDs的荧光强度略有降低，而在pH 4.0~11.0范围内，荧光强度趋于平稳; 而PAAS-SiBCDs在pH 3.0~11.0范围内荧光强度表现出良好的稳定性。
考察了SiBCDs和PAAS-SiBCDs的荧光强度连续光照1 h的变化情况(图 8C)。在350 nm激发光下连续照射下，SiBCDs和PAAS-SiBCDs的荧光强度均略有下降，下降幅度低于7%，可见SiBCDs和PAAS-SiBCDs作为荧光探针有较好的耐光性。
SiBCDs和PAAS-SiBCDs对不同浓度Hb的响应曲线如图 9所示，当Hb浓度在0~15.0 μmol/L范围内时，随着Hb浓度的增加，SiBCDs和PAAS-SiBCDs的荧光强度均逐渐降低。基于Hb对两种CDs荧光的猝灭效应，可建立Hb的荧光定量分析方法。以SiBCDs和PAAS-SiBCDs为荧光探针检测Hb，线性范围分别为0.45~3.73 μmol/L和0.21~5.22 μmol/L，检出限分别为0.14和0.06 μmol/L(S/N=3)。
为了探究两种荧光探针对Hb的选择性，进一步考察了氨基酸、蛋白质和Na+等血液中常见共存物质对基于SiBCDs和PAAS-SiBCDs传感方法分析血红蛋白的影响。结果表明，1 mmol/L甘氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、组氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、葡萄糖和抗坏血酸，10 μmol/L细胞色素c及5 μmol/L肌红蛋白和牛血清白蛋白对基于SiBCDs和PAAS-SiBCDs为探针传感分析2.2 μmol/L血红蛋白没有明显干扰，表明硅硼碳点对Hb具有较好的选择性。由于成人全血中血清白蛋白含量正常范围是35~50 mg/L(0.53~0.75 mmol/L)，Hb是110~160 g/L(1.64~3.29 mmol/L)，其它组分含量通常较低，因此，本传感体系所的选择性可以满足实际全血样品中血红蛋白含量的测定要求。
人全血样品由健康志愿者提供，样品经抗凝后取红细胞溶胀，然后释放出血红蛋白，于4℃储存备用[26]。处理好的血样用PBS缓冲溶液稀释，分别以SiBCDs和PAAS-SiBCDs为荧光传感探针进行检测，结果如表 3和表 4所示。血红蛋白的加标回收率均大于90%，说明硅硼碳点可以很好地用于全血样品中血红蛋白的测定。
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| 血样编号 No. | 抗凝剂 Anticoagulant | 测量值 Found (μmol/L) | 加标量 Spiked (μmol/L) | 回收率 Recovery (%) | 正常值 (稀释1000倍) Normal level (Diluted 1000 times) |
| 血样1 Blood sample1 | 肝素钠 EDTAk2 | 2.05±0.02 2.04±0.01 | 0.2 0.2 | 93±3 91±4 | 1.64~2.39 μmol/L (0.11~0.16 g/L) |
| 血样2 Blood sample2 | 肝素钠 EDTAk2 | 1.85±0.02 1.84±0.01 | 0.2 0.2 | 91±4 92±3 |
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| 血样编号 No. | 测量值 Found (μmol/L) | 加标量 Spiked (μmol/L) | 回收率 Recovery (%) | 正常值 (稀释1000倍) Normal level (Diluted 1000 times) |
| 血样1 Blood sample1 | 2.05±0.01 | 0.2 0.5 | 97±3 97±1 | 1.64~2.39 μmol/L (0.11~0.16 g/L) |
| 血样2 Blood sample 2 | 1.86±0.01 | 0.2 0.5 | 95±3 96±1 |
以柠檬酸、硼酸、APTES为原料，采用微波法一步制备Si、B掺杂的碳点(SiBCDs)，Si原子和B原子的掺杂提高了CDs量子产率并改善其荧光性能; 在SiBCDs的制备过程中直接加入PAAS，通过微波法一步制备出PAAS-SiBCDs。两种碳点的最大激发波长和最大发射波长分别为350和445 nm，量子产率分别为20.1%和34.6%。SiBCDs和PAAS-SiBCDs对Hb具有线性响应，据此建立了检测Hb的新方法，并成功应用于人全血中Hb的检测。
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图 1 (A) SiBCDs和(B)PAAS-SiBCDs的高分辨透射电镜照片
Figure 1 High resolution transmission electron microscopic (HRTEM) images of (A) silicon and boron dopped carbon dots (SiBCDs) and (B) Sodium polyacrylate wrapped-SiBCDs (PAAS-SiBCDs)
图 2 SiBCDs的X射线光电子能谱图
Figure 2 X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) pattern of SiBCDs
图 3 SiBCDs的(A) C1s、(B) N1s、(C) Si2p、(D) B1s X射线光电子能谱图
Figure 3 XPS pattern of the prepared SiBCDs (A) C1s, (B) N1s, (C) Si2p and (D) B1s
图 6 SiBCDs和PAAS-SiBCDs的热重曲线(A)、红外光谱图(B)、X-射线衍射谱(C)和紫外-可见吸收光谱(D)
Figure 6 Thermogravimetric (TG) analysis curve (A), Fourier transform-infrared (FT-IR) spectrum (B), X-ray diffraction pattern (XRD) (C) and UV-vis absorption spectra (D) of the as-prepared SiBCDs and PAAS-SiBCDs
图 5 SiBCDs的C1s(A)、O1s(B) XPS能谱图; PAAS-SiBCDs的C1s(C)、O1s(D) XPS能谱图
Figure 5 (A) C1s, (B) O1s XPS pattern of the prepared SiBCDs, and (C) C1s, (D) O1s XPS pattern of the prepared PAAS-SiBCDs
图 7 SiBCDs(A)和PAAS-SiBCDs(B)的激发、发射光谱。插图：SiBCDs和PAAS-SiBCDs在365 nm激发下的照片; SiBCDs(C)和PAAS-SiBCDs(D)在不同激发波长下的荧光光谱图
Figure 7 Fluorescence excitation and emission spectra of SiBCDs (A) and PAAS-SiBCDs (B). Inset: photographs of SiBCDs and PAAS-SiBCDs under 365 nm excitation. Fluorescence spectra of SiBCDs (C) and PAAS-SiBCDs (D) at different excitation wavelengths
图 8 SiBCDs和PAAS-SiBCDs的荧光强度随离子强度(A)、pH值(B)和光照时间的变化情况(C)
Figure 8 Dependence of fluorescence inetensity of SiBCDs and PAAS-SiBCDs on ionic strength (A), pH value (B) and irritating time (C)
图 9 SiBCDs(A)和PAAS-SiBCDs(B)传感血红蛋白的荧光线性关系图
Figure 9 Calibration curves for fluorescent sensing of Hb by using SiBCDs (A) and PAAS-SiBCDs (B) as probes
表 1 化合键的百分含量
Table 1. Percentage of chemical bonds
| C1s | O1s | ||||||
| C—Si/C＝C | C—O/C—N | C＝O | Si—O | C—O | C＝O | ||
| SiBCDs | 65.8% | 25.3% | 8.9% | 68.6% | 20.1% | 11.3% | |
| PAAS-SiBCDs | 63.0% | 25.1% | 11.9% | 21.2% | 29.5% | 49.3% | |
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表 3 SiBCDs测定全血中Hb的含量(n=3)
Table 3. Determination of Hb content in the whole blood with SiBCDs as probe (n=3)
| 血样编号 No. | 抗凝剂 Anticoagulant | 测量值 Found (μmol/L) | 加标量 Spiked (μmol/L) | 回收率 Recovery (%) | 正常值 (稀释1000倍) Normal level (Diluted 1000 times) |
| 血样1 Blood sample1 | 肝素钠 EDTAk2 | 2.05±0.02 2.04±0.01 | 0.2 0.2 | 93±3 91±4 | 1.64~2.39 μmol/L (0.11~0.16 g/L) |
| 血样2 Blood sample2 | 肝素钠 EDTAk2 | 1.85±0.02 1.84±0.01 | 0.2 0.2 | 91±4 92±3 |
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表 4 PAAS-SiBCDs测定全血中Hb的含量(n=3)
Table 4. Determination of Hb content in whole blood with PAAS-SiBCDs as probe (n=3)
| 血样编号 No. | 测量值 Found (μmol/L) | 加标量 Spiked (μmol/L) | 回收率 Recovery (%) | 正常值 (稀释1000倍) Normal level (Diluted 1000 times) |
| 血样1 Blood sample1 | 2.05±0.01 | 0.2 0.5 | 97±3 97±1 | 1.64~2.39 μmol/L (0.11~0.16 g/L) |
| 血样2 Blood sample 2 | 1.86±0.01 | 0.2 0.5 | 95±3 96±1 |
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