利用光学探针快速筛选和检测肿瘤细胞对疾病的早期诊断、早期治疗以及预后监测等具有重要的科学意义。自从在人卵巢癌细胞表面发现高表达的叶酸受体以来[1]，这种叶酸特异性结合蛋白就被作为一种重要的标志分子而应用于肿瘤的早期诊断和靶向治疗[2~4]。传统的放射性标记技术可以定量检测癌变组织和正常组织中叶酸受体的含量[5, 6]，但是该方法需要使用有害的放射性标记材料，且操作过程繁琐。近年来，荧光纳米探针因其高的灵敏度及可视化等特点，已经发展成为一种生物标记与成像的重要工具[7~10]。例如，叶酸功能化的量子点[11]、金纳米团簇[12]、碳点[13]、上转换纳米粒子[14]和荧光二氧化硅纳米粒子[15]等。其中，荧光二氧化硅纳米粒子不仅能够将大量的染料分子包裹在单个纳米颗粒中，而且其较大的表面积也易于进行生物分子的功能化修饰，从而大大提高检测的灵敏度[16, 17]。目前，这些叶酸功能化的荧光纳米探针基本上都是通过酰胺化反应制备的，其修饰过程需要复杂的活化过程，有可能会影响相应配体的生物学活性[18]。
点击化学以其原料易得、反应条件温和、产物收率高、分离提纯简单等优点，已被广泛应用于新化合物的合成[19]、表面修饰[20, 21]及化学生物传感[22, 23]等研究，其典型代表为叠氮基与端炔基的1, 3-偶极环加成反应。该反应一般采用Cu(Ⅰ)作为催化剂，常温条件下就能快速反应完全。近年来，这种点击化学共价偶联叶酸的策略已被尝试用于肿瘤靶向及治疗试剂的制备[24~26]。本研究将炔丙基叶酸衍生物通过点击化学反应偶联到叠氮化的荧光二氧化硅纳米粒子表面，制备成可选择性标记特定肿瘤细胞的靶向荧光纳米探针。通过选择不同的生物配体并结合点击化学高效的表面修饰特性，本方法有望发展成为一种制备多功能生物荧光纳米探针的通用方法。
Zeiss LSM 710荧光共聚焦显微镜(德国卡尔蔡司公司)；Cary Eclipse荧光光谱仪、Agilent Q-TOF 6540质谱仪(美国安捷伦公司)；Bruker 400 MHz Ultrashield核磁共振仪(瑞士布鲁克公司)；JEOL-2100F透射电子显微镜(日本电子株式会社)；Nicolet iS10红外光谱仪(美国赛默飞世尔公司)。
钌联吡啶(Rubpy)、氨水(30%)、正硅酸四乙酯(TEOS)、四丁基溴化铵、叠氮化钠、无水Na2SO4、CuSO4、抗坏血酸、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、N, N-二环己基碳二亚胺(DCC)、乙醇、丁酮、甲苯、二氯甲烷、二甲亚砜(国药集团化学试剂有限公司)；叶酸、(3-氯丙基)三乙氧基硅烷、吖啶橙(AO)、丙炔胺(Sigma-Aldrich公司)；人宫颈癌细胞(HeLa)、人肺癌细胞(A549)由中国科学院细胞库提供；其它试剂均为分析纯，实验用水为超纯水(18.2 MΩ cm)。
根据文献[27]报道的方法进行制备。首先将2.31 g (3-氯丙基)三乙氧基硅烷、20 mg四丁基溴化铵、3.12 g叠氮化钠、25 mL丁酮依此加入到100 mL三口瓶中，通入纯氮气，并加热回流50 h。反应结束后，利用硅藻土过滤并真空蒸发溶剂，将得到的产物溶于150 mL二氯甲烷中，用20 mL水洗涤两次，通过分液漏斗分离出有机相并用无水Na2SO4干燥，最后蒸发溶剂得到汁状产物(产率71%)。HR-MS (ESI, m/z): [M－H]-＝246.13。1HNMR (CDCl3, 300 MHz): δ3.74 (q, 6H, —OCH2), 3.19 (t, 2H, —CH2N3), 1.73~1.51 (m, 2H, —CH2CH2N3), 1.16 (t, 9H, —OCH2CH3), 0.63~0.51 (m, 2H, —CH2Si)。
采用Stöber法[28]进行制备。将25 mL乙醇、1.5 mL氨水、0.5 mL 0.5 mg/mL RuBpy混合，室温下磁力搅拌5 min，然后加入2 mL TEOS和5 mL乙醇的混合溶液，反应1 h后，用无水乙醇离心、洗涤3次，于真空干燥箱烘干，备用。
取4 g制备的RSiNPs，将其分散于20 mL无水甲苯中，然后加入1 g Az-PTES，加热回流12 h。反应结束后，用无水乙醇和水离心洗涤数次后，重新分散在超纯水中，于室温暗处储存，备用。
将0.5 g叶酸溶于10 mL二甲亚砜中，加入130 mg NHS和247 mg DCC, 室温搅拌30 min，然后加入62 mg丙炔胺，继续搅拌24 h。反应结束后加入250 mL水，经过搅拌、抽滤、丙酮洗涤后，于真空中进行干燥处理(产率92%)。HR-MS (ESI, m/z) : [M－H]-＝477.17。1HNMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ8.64 (s, 1H, PtC7H), 8.28~8.26 (d, 1H, PtC6-CH2NH-Ph), 8.00~87.96 (d, 1H, —CONHCHCO2H), 7.68~7.64 (d, 2H, Ph-C2H and Ph-C6H), 6.93 (br s, 2H, NH2), 6.65~6.63 (d, 2H, Ph-C3H and Ph-C5H), 4.50~4.48 (d, 2H, PtC6-CH2NH-Ph), 4.32~4.30 (m, 1H, —CONHCHCO2H), 3.85~3.82 (m, 2H, CONH—CH2C≡CH), 3.06~3.05 (t, 1H, CONH—CH2C≡CH), 2.89 (s, 1H, CONH—CH2C≡CH), 2.73 (br s, 1H, OH), 2.33~2.30 (m, 2H, —CH2CO2H), 2.07 (m, 1H, —CHCH2CH2), 1.88~1.85 (m, 1H, —CHCH2CH2)。产物溶解于二甲亚砜中，于4℃保存，备用。
将1 g RSiNPs-N3加入到60 μL 0.02 mol/L CH≡C~FA的二甲亚砜溶液，再依次加入50 μL 0.1 mol/L Cu2SO4和50 μL 0.2 mol/L抗坏血酸溶液，室温条件下反应8 h。反应结束后，用无水乙醇和水离心洗涤数次后，将粒子重新分散于超纯水中，于4℃保存，备用。
HeLa细胞和A549细胞均用DMEM培养基(10%胎牛血清)于5% CO2、37℃的培养箱中培养。首先将贴壁细胞分别用胰蛋白酶消化并将其转移到新的培养皿中，培养24 h后，用PBS缓冲液(pH 7.4)洗涤两次，重悬于2 mL新鲜培养基中。将RSiNPs-Folate(1 mg/mL)加入到培养皿中，置于5% CO2、37℃的培养箱中孵育1 h，然后用PBS缓冲液洗涤3次，再加入2 mL PBS缓冲液并进行共聚焦荧光成像(激发波长为488 nm)。叶酸竞争性结合实验为预先用50 μL 1 mmol/L叶酸处理HeLa细胞，再加入等量的RSiNPs-Folate。混合细胞成像实验为将HeLa细胞和AO染色的A549细胞共培养后，再加入等量的RSiNPs-Folate。
图 1是叶酸受体靶向荧光纳米探针(RSiNPs-Folate)的制备示意图。荧光二氧化硅纳米粒子RSiNPs是通过在前驱体TEOS的乙醇溶液中添加Rubpy并用Stöber法合成的。带正电荷的RuBpy分子与带负电荷的二氧化硅之间存在强的静电作用，可以有效避免二氧化硅网络结构中染料分子的泄漏[17, 29]。与反相微乳液法相比，这种一步反应法也无需使用有毒的有机试剂及表面活性剂，更适合用于细胞的标记和成像。进一步，用叠氮化的硅烷偶联剂对粒子进行表面改性，获得叠氮基修饰的荧光二氧化硅纳米粒子RSiNPs-N3。最后，利用点击化学反应将炔丙基叶酸衍生物(CH≡C~FA)偶联到粒子表面。其中，所用的Cu(Ⅰ)催化剂为抗坏血酸还原硫酸铜体系。这种叶酸功能化的荧光纳米探针RSiNPs-Folate，可通过细胞膜上叶酸受体的介导途径，选择性地靶向叶酸受体呈阳性的肿瘤细胞。
采用透射电镜对制备的RSiNPs-N3和RSiNPs-Folate进行了表征，如图 2A和2B所示，RSiNPs-N3和RSiNPs-Folate都有非常均一的尺寸，粒径约60 nm，且RSiNPs-Folate在水溶液中具有很好的单分散性(与RSiNPs-N3相比)。图 2C分别给出了RSiNPs-N3和RSiNPs-Folate的荧光发射光谱(激发波长均为458 nm)，其发射峰位置均为601 nm，说明点击化学偶联叶酸基本上不影响粒子的荧光发射光谱。在紫外灯的照射下，可以用肉眼观察到RSiNPs-Folate明亮的桔红色荧光。此外，RSiNPs-Folate在4℃保存时以及细胞孵育过程中均表现出较好的稳定性。这种具有较强荧光且稳定性好的功能化纳米探针为高灵敏的细胞标记和成像奠定了基础。
为了进一步证明叠氮基团以及炔丙基叶酸衍生物已被成功修饰在荧光纳米粒子表面，采用红外光谱分别对制备的RSiNPs、RSiNPs-N3和RSiNPs-Folate进行了表征(图 3)。与RSiNPs相比，RSiNPs-N3在2105 cm-1左右出现了叠氮基的反对称伸缩振动峰；但RSiNPs-Folate未出现该特征峰，表明粒子表面的叠氮基已经完全与炔基反应生成了反式的三氮唑结构[30]。
考察了HeLa细胞与RSiNPs-Folate、RSiNPs-N3和RSiNPs之间的相互作用及其荧光成像。由图 4可见，当RSiNPs-Folate与HeLa细胞共同孵育1 h后，即可观察到其表面明亮的红色荧光(图 4B1和图 4C1)。然而，RSiNPs-N3与HeLa细胞共同孵育后，仅在极个别细胞表面观察到微弱的荧光，这可能是由于RSiNPs-N3在培养基中分散性较差所导致(图 4B2和图 4C2)。此外，RSiNPs与HeLa细胞共同孵育后，其表面也未观察到明显的荧光(图 4B3和4C3)。上述结果表明，RSiNPs-Folate可特异性地靶向结合叶酸受体呈阳性的HeLa细胞，而RSiNPs-N3和RSiNPs与HeLa细胞之间无明显的非特异性吸附。
为进一步证实RSiNPs-Folate是通过叶酸受体介导的途径靶向肿瘤细胞的，采用过量的叶酸对HeLa细胞进行预处理，然后加入相同浓度的RSiNPs-Folate进行孵育及荧光成像。由图 5可见，这种经过叶酸预处理的HeLa细胞表面也未观察到明显的荧光(图 5B1和5C1)。在相同的实验条件下，叶酸受体呈阴性的A549细胞也几乎没有荧光信号(图 5B2和5C2)。
初步考察了RSiNPs-Folate对混合体系中HeLa的识别与荧光成像。为了精确区分HeLa和A549细胞，A549细胞预先用AO进行核染色处理。如图 6所示，未用AO染色的HeLa细胞表面可以观察到明亮的红色荧光(图 6B)，而用AO染色的A549细胞表面未观察到红色荧光(图 6C)。明场和荧光叠加图像再次清晰地表明了RSiNPs-Folate可以在混合细胞体系里选择性地识别HeLa细胞(图 6D)。因此，RSiNPs-Folate有望作为一种有效的标记探针，用于HeLa等叶酸受体高表达肿瘤细胞的识别与荧光成像。
本研究建立了基于点击化学偶联策略制备叶酸受体靶向荧光纳米探针的方法，结合共聚焦成像技术实现了对人宫颈癌HeLa细胞的选择性识别和成像。本研究为纳米探针的生物功能化修饰提供了一种简单、普适、高效的方法。
Coney L R, Tomassetti A, Carayannopoulos L, Frasca V, Kamen B A, Colnaghi M I, Zurawski V R Jr. Cancer Res., 1991, 51(22):6125-6132
Masafumi T, Naomi T, Takahiro M. Chem. Lett., 2017, 46(7):944-946 doi: 10.1246/cl.170198
Wu X X, Luo L Q, Yang S G, Ma, X H, Li Y L, Dong C, Tian Y C, Zhang L E, Shen Z Y, Wu A G. ACS Appl. Mater. Interfaces, 2015, 7(18):9965-9971 doi: 10.1021/acsami.5b02276
Oseledchyk A, Andreou C, Wall M A, Kircher M F. ACS Nano, 2017, 11(2):1488-1497 doi: 10.1021/acsnano.6b06796
Parker N, Turk M J, Westrick E, Lewis J D, Low P S, Leamon C P. Anal. Biochem., 2005, 338(2):284-293 doi: 10.1016/j.ab.2004.12.026
Ross T L, Honer M, Müller C, Groehn V, Schibli R, Ametamey S M. J. Nucl. Med., 2010, 51(11):1756-1762 doi: 10.2967/jnumed.110.079756
Lei K P, Sun M T, Du L B, Zhang X J, Yu H, Wang S H, Hayat T W, Alsaedi A. Talanta, 2017, 170:314-321 doi: 10.1016/j.talanta.2017.04.004
Xu S Y, Huang S, He Q, Wang L Y. TrAC-Trends Anal. Chem., 2015, 66:72-79 doi: 10.1016/j.trac.2014.11.014
廖晓燕, 梁淑彩, 刘羽萍, 张静雅, 鄢国平.分析化学, 2017, 45(5):747-753 doi: 10.11895/j.issn.0253-3820.160757LIAO Xiao-Yan, LIANG Shu-Cai, LIU Yu-Ping, ZHANG Jing-Ya, YAN Guo-Ping. Chinese J. Anal. Chem., 2017, 45(5):747-753. doi: 10.11895/j.issn.0253-3820.160757
Feng D, Song Y C, Shi W, Li X H, Ma H M. Anal. Chem., 2013, 85(13):6530-6535 doi: 10.1021/ac401377n
Zhou S, Huo D Q, Hou C J, Yang M, Fa H B, Xia C, Chen M. Anal. Methods, 2015, 7(22):9649-9654 doi: 10.1039/C5AY01760B
Li H C, Cheng Y Q, Liu Y, Chen B. Talanta, 2016, 158:118-124 doi: 10.1016/j.talanta.2016.05.038
Liu Q L, Xu S H, Niu C X, Li M F, He D C, Lu Z L, Ma L, Na N, Huang F, Jiang H, Ouyang J. Biosens. Bioelectron., 2015, 64:119-125 doi: 10.1016/j.bios.2014.08.052
Yang X J, Xiao Q Q, Niu C X, Jin N, Ouyang J, Xiao X Y, He D C. J. Mater. Chem. B, 2013, 1(21):2757-2763 doi: 10.1039/c3tb00575e
Wang X H, Morales A R, Urakami T, Zhang L F, Bondar M V, Komatsu M, Belfield K D. Bioconjugate Chem., 2011, 22(7):1438-1450 doi: 10.1021/bc2002506
Peng J F, Wang K M, Tan W H, He X X, He C M, Wu P, Liu F. Talanta, 2007, 71(2):833-840 doi: 10.1016/j.talanta.2006.05.064
陈敏艳, 陈泽忠, 王维, 朱链, 唐宏武, 庞代文.分析化学, 2014, 42(3):326-331 doi: 10.3724/SP.J.1096.2014.30849CHEN Min-Yan, CHEN Ze-Zhong, WANG Wei, ZHU Lian, TANG Hong-Wu, PANG Dai-Wen. Chinese J. Anal. Chem., 2014, 42(3):326-331. doi: 10.3724/SP.J.1096.2014.30849
Gole A, Murphy C J. Langmuir, 2008, 24(1):266-272 doi: 10.1021/la7026303
安伟, 张华承, 孙涛, 李祥军, 郝爱友.有机化学, 2011, 31(3):275-285AN Wei, ZHANG Hua-Cheng, SUN Tao, LI Xiang-Jun, HAO Ai-You. Chinese J. Org. Chem., 2011, 31(3):275-285.
Schieber C, Bestetti A, Lim J P, Ryan A D, Nguyen T L, Eldridge R, White A R, Gleeson P A, Donnelly P S, Williams S J, Mulvaney P. Angew. Chem. Int. Ed., 2012, 51(42):10523-10527 doi: 10.1002/anie.201202876
White M A, Johnson J A, Koberstein J T, Turro N J. J. Am. Chem. Soc., 2006, 128(35):11356-11357 doi: 10.1021/ja064041s
Zhang Y F, Li B X, Xu C L. Analyst, 2010, 135(7):1579-1584 doi: 10.1039/c0an00056f
Zhou Y, Wang S X, Zhang K, Jiang X Y. Angew. Chem. Int. Ed., 2008, 47(39):7454-7456 doi: 10.1002/anie.v47:39
Hayashi K, Moriya M, Sakamoto W, Yogo T. Chem. Mater., 2009, 21(7):1318-1325 doi: 10.1021/cm803113e
De P, Gondi S R, Sumerlin B S. Biomacromolecules, 2008, 9(3):1064-1070 doi: 10.1021/bm701255v
Santra S, Kaittanis C, Grimm J, Perez J M. Small, 2009, 5(16):1862-1868 doi: 10.1002/smll.v5:16
Ortega-Muñoz M, Lopez-Jaramillo J, Hernandez-Mateo F, Santoyo-Gonzaleza F. Adv. Synth. Catal., 2006, 348(16-17):2410-2420 doi: 10.1002/(ISSN)1615-4169
Rossi L M, Shi L F, Quan F H, Rosenzweig Z. Langmuir, 2005, 21(10):4277-4280 doi: 10.1021/la0504098
Santra S, Zhang P, Wang K M, Tapec R, Tan W H. Anal. Chem., 2001, 73(20):4988-4993 doi: 10.1021/ac010406+
Ranjan R, Brittain W J. Macromol. Rapid Commun., 2008, 29(12-13):1104-1110
图 1 点击功能化荧光二氧化硅纳米探针(RSiNPs-Folate)的制备示意图
Figure 1 Schematic illustration of preparation of click-functionalized fluorescent silica nanoprobes (RSiNPs-Folate)
图 2 (A) RSiNPs-N3的透射电镜照片；(B)RSiNPs-Folate的透射电镜照片；(C)RSiNPs-N3和RSiNPs-Folate的荧光发射光谱(插图为300 nm紫外灯下RSiNPs-Folate的光学照片)。
Figure 2 (A) Transmission electron microscopy (TEM) image of RSiNPs-N3; (B) TEM image of RSiNPs-Folate; (C) fluorescence emission spectra of RSiNPs-N3 and RSiNPs-Folate (inset is optical photo of RSiNPs-Folate under 300 nm UV lamp).
图 3 RSiNPs及其表面功能化修饰的红外光谱: a, RSiNPs; b, RSiNPs-N3; c, RSiNPs-Folate。
Figure 3 Fourier transformation infrared (FT-IR) spectra of the RSiNPs and RSiNPs after surface functionalization: a, RSiNPs; b, RSiNPs-N3; c, RSiNPs-Folate.
图 4 RSiNPs-Folate、RSiNPs-N3和RSiNPs分别用于HeLa细胞的荧光成像。(A)明场成像，(B)荧光成像，(C) A与B的叠加图。
Figure 4 Fluorescent images of HeLa cells using RSiNPs-Folate, RSiNPs-N3 and RSiNPs, respectively. (A) Bright-field images; (B) fluorescent images; (C) merged images of (A) and (B).
图 5 RSiNPs-Folate用于叶酸预处理的HeLa细胞以及A549细胞的荧光成像。(A)明场成像，(B)荧光成像，(C) A与B的叠加图。
Figure 5 Fluorescent images of HeLa cells pretreated with FA and A549 cells using RSiNPs-Folate. (A) Bright-field images; (B) fluorescent images; (C) merged images of (A) and (B).
图 6 RSiNPs-Folate用于混合细胞(HeLa和A549)的荧光成像。(A)明场成像，(B)荧光成像(RSiNPs-Folate通道)，(C)荧光成像(AO通道), (D) A，B与C的叠加图。
Figure 6 Fluorescent images of mixing cells (HeLa and A549) using RSiNPs-Folate. (A) Bright-field image; (B) fluorescent image (RSiNPs-Folate channel); (C) fluorescent image (AO channel); (D) merged image of (A), (B) and (C).
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