English

• 1.   引言

  脂类在生物系统中发挥着多方面的重要作用，如作为细胞膜的支撑载体、储存能量以及信号传导的媒介^[1~3]。脂类的组成、浓度及在时间/空间上的分布情况可作为生物系统功能的反应指标，在疾病标志物发现^[4]、代谢水平分析^[5]、癌症组织成像^[6]和系统生物学方面^[7]有着重要作用。因此，对脂类进行灵敏的定量分析，甚至是特定分子结构的分析^[8]，有助于揭开脂类化合物在体内平衡的机理和关系网络。最近的研究表明，脂类中双键的位置会影响脂和细胞膜上的胆固醇之间的相互作用^[9]、与蛋白的结合^[10]以及在癌症和疾病中的一些积极和消极的作用^[11~13]。近年来，随着电喷雾质谱技术和基于碰撞诱导解离的二级质谱技术的发展，几乎所有的甘油磷脂的种类都可以被鉴定，包括脂肪酰基的分子组成^[14]。然而，由于脂类结构的复杂性，商业质谱系只能鉴定到这些物质的结构，如极性端基脂的种类、脂肪酰基/烷基的种类^{[14, 15]}，但很少可以鉴定脂中更为精细的C＝C的位置的信息。因此，需要发展一些方法鉴定双键的位置。

  目前，已有两大类基于质谱的方法可鉴定出C＝C的位置，但各有不足。第一种方法是在质谱分析前，使用化学衍生试剂使双键直接断裂，如臭氧裂解分析^[16]，或将C＝C转化为官能基团(烷硫基化^[17]或甲氧汞化作用^[18])，这些官能团可以在离子化时裂解，或者通过低能碰撞诱导解离的方式发生断裂产生碎片离子。这种方法所需样品量大，若分析复杂样品，还需经过色谱分离。第二种方法通过不同气相诱导裂解的方式使双键或其周围化学键断裂。常见的方法有电荷转移裂解^[19]、臭氧诱导解离^[20]和自由基引发解离^[21]。Poad等^[22]构建了高压臭氧诱导解离装置，使用较多的臭氧，在一定程度上加快了反应的进行，可得到较多的可以用于确定C＝C位置的产物离子。这些方法有望用于混合物分析，但通常需要搭建比较特殊的质谱仪器装置，而不是直接使用商业化的质谱装置，因此并不具有普适性。

  本研究基于Ma等^[23]在2014年发展的一种基于在线光化学反应(Paternò-Büchi，PB反应)和低能碰撞裂解(Low-energy collision dissociation，CID)的二级质谱(MS/MS)的方法，精确鉴定C＝C的位置和双键异构体的相对含量。本方法提出一种新的PB反应物二苯甲酮(Benzophenone，BP)，由于PB产物比原来的磷脂分子量增加182 Da，因此磷脂的PB产物与磷脂在谱图上明显分离，同时两对检测离子相差较大(150 Da)，可避免一些检测离子相互重合。在质谱分析时, 采用Wei等^[24]发展的一种非接触式的脉冲直流电喷雾离子化(Pulsed directed current electrospray，pulsed-dc-ESI)的质谱电离方法，电极不接触样品，避免了溶液中的样品发生氧化还原反应。同时这种电离方法流速低，少量样品便可得到持续较长时间的信号，在很大程度上节约了样品用量。本研究结合在线光化学反应和基于脉冲直流电喷雾的二级质谱方法(PB-pulsed-dc-ESI-MS/MS)，对癌细胞MCF-7和正常细胞MCF-10A中的不饱和卵磷脂的双键位置及双键异构体的相对含量进行了检测，并发现了一些含量的差异，拓展了不同细胞状态和疾病状态的辨别的方法。

  2.   实验部分

  2.1   仪器、试剂与材料

  ZF-7A手提式紫外分析仪(上海光豪分析仪器有限公司); 3H16RI智能高速冷冻离心机(湖南赫西仪器设备有限公司); DZF-6020真空干燥箱(南京科尔仪器设备有限公司); XW-80A旋涡混合器(上海青浦沪西仪器厂); IX73倒置显微镜系统(日本Olympus公司); P-2000激光微电极拉制仪(美国Sutter公司); Microloader^®毛细管微量进样器(德国Eppendorf公司); 6530B Q-TOF四极杆-飞行时间串联质谱(美国Agilent公司)。

  卵磷脂PC 18:1(9Z)/18:1(9Z)(梯希爱(上海)化成工业发展有限公司); 卵磷脂PC 18:1(6Z)/18:1(6Z)(美国Avanti Polar Lipids公司); 甲醇、氯仿、乙腈(色谱纯，美国Sigma Aldrich公司); 二苯甲酮(分析纯，美国Sigma Aldrich公司); 冰乙酸(色谱纯)和油胺(分析纯)均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。实验用水为超纯水(电阻率≥18 MΩ·cm，美国Millipore公司)。

  BF 100-50-10硼硅酸盐玻璃(美国Sutter公司); 喷针拉制：由P-2000拉针仪以固定程式拉制而成，参数设定如下：HEAT＝450，FIL＝4，VEL＝30，DEL＝200，PUL＝0。拉制后得到尖端直径为1~2 μm的喷针。

  2.2   细胞培养与前处理

  人乳腺癌细胞MCF-7和人正常乳腺上皮细胞MCF-10A均购自北纳创联生物技术有限公司。MCF-7和MCF-10A细胞培养所用的培养基均为不完全RPMI-1640，并添加了10%(V/V)的胎牛血清和1%(V/V)的双抗(青霉素/链霉素)。细胞培养在直径为35 mm的培养皿中。

  参考文献[25]的三相萃取法提取细胞中的脂类，并略有改进：用于实验的细胞经特定段时间培养后，弃去培养基，用1 mL 0.9% NaCl溶液冲洗细胞3遍，弃去多余的NaCl溶液。本研究未使用PBS缓冲溶液，因为在后续的质谱分析中，会产生大量磷酸盐峰，抑制低丰度的细胞相关物质的峰。加入400 μL -20℃的甲醇和400 μL 0℃的水，用移液枪反复吸取培养皿里的甲醇-水吹打培养皿底部，使细胞胀破，尽可能将贴壁的细胞都吹打下来。将得到的细胞裂解液转移到装有400 μL -20℃的氯仿的1.5 mL色谱小瓶中，涡旋混合1 min，4℃ 14000 g离心10 min。

  离心后得到三相溶液，最上层的甲醇中包含极性代谢物，中间层为来自细胞的大分子、蛋白、核酸等，最底层的氯仿中含有非极性代谢物和脂类。弃去最上层的溶液和中间层的溶液，将最底层的溶液放进真空干燥箱中干燥12 h。干燥后，加入80 μL氯仿重新溶解，质谱分析前，取20 μL加入200 μL预先配制的0.01994 mol/L二苯甲酮溶液(甲醇-乙腈，50:50，V/V，含1%冰乙酸)，-20℃保存备用。

  2.3   PB-pulsed-dc-ESI-MS/MS实验装置及条件

  如图 1所示，用毛细管微量进样器将1 μL样品溶液灌入拉制好的电喷雾玻璃喷针中，用254 nm的紫光灯照射灌有溶液的喷针前端区域25 s，然后将喷针放在质谱口前端约10 mm处，将金属丝插入喷针中，由于样品仅1 μL，而实验中使用的金属丝长度并不是很长，保证金属丝与溶液不发生接触。

  图 1

  

  图 1.  实验装置示意图

  Figure 1.  Schematic diagram of experimental setup. Pulsed-dc-ESI: pulsed directed current electrospray

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  在实验前，需先将商业ESI源卸掉。实验中选择正离子模式进行检测，干燥气温度300℃; 干燥气流速2 L/min; 雾化器压力0 Psig; 毛细管电压1500 V; 毛细管出口电压175 V; 锥孔电压65 V; 八极杆电压750 V; 数据采集速率1 spectrum/s。二级信号采用Targeted MS/MS模式，保留时间0 min; 电荷数1;四极杆分辨率选择Narrow 1.3 m/z; 碰撞能量选择25 eV。

  3.   结果与讨论

  3.1   利用PB-pulsed-dc-ESI-MS/MS鉴定脂双键位置以及双键异构体相对含量的原理

  如图 2所示，选择BP作为PB反应的反应物，在254 nm紫外光照射下，不饱和卵磷脂中的C＝C与BP中的羰基发生环加成反应，生成四元环的氧杂丁烷，磷脂的分子量增加了182 Da (即BP(C₁₃H₁₀O)的分子量)，在质谱图中，PB产物与反应物磷脂很好地分离。此PB产物在经CID得到的二级质谱中会得到两个分子量在原来磷脂基础上分别增加1个O原子和C₁₃H₁₀分子量的子离子，即得到两个相差150的子离子，可以避免一些产物离子的相互重合。当样品中有两种双键异构体的不饱和卵磷脂时，BP发生PB反应得到的产物经CID会得到两对分子量相差150的子离子，每对相差150的子离子作为检测离子，这两对检测离子的强度与样品中双键异构体的相对含量存在线性关系。将总浓度为25.45 μmol/L、不同比例的卵磷脂(Phosphatidylcholines，PC)标准品PC 18:1(6Z)/18:1(6Z)和PC 18:1(9Z)/18:1(9Z)系列溶液溶于0.01994 mol/L二苯甲酮溶液中(甲醇-乙腈，1:1，V/V, 含1%冰乙酸)，光照25 s，PB产物m/z 968进行二级质谱分析。对异构体18:1(6Z)的PB产物进行二级串联质谱分析，得到m/z 634和784，二者的强度和定义为I₆; 对异构体18:1(9Z)的PB产物进行二级串联质谱分析，会得到m/z 676和806，二者的强度和定义为I₉。图 3A和3B分别为PC 18:1(6Z)/18:1(6Z)和PC 18:1(9Z)/18:1(9Z)浓度比为1:1和7:1时的PB产物离子m/z 968进行CID得到的二级谱图，其子离子634、784和676、826的强度和有明显差异。做了一系列不同浓度比的PB产物的二级质谱分析，以I₆/I₉对异构体的浓度比(C₆/C₉)作图，得到的回归方程为y=0.799x－0.100，线性相关系数(R²)为0.9946，线性关系良好，如图 3C所示。

  图 2

  

  图 2.  以二苯甲酮作为PB反应物, 利用在线光化学反应-脉冲直流电喷雾串联质谱鉴定不饱和卵磷脂双键位置的示意图

  Figure 2.  Schematic diagram of coupling Paterno-Büchi (PB) reaction with pulsed-dc-ESI-MS/MS for C＝C position of an unsaturated phosphatidylcholines (PCs) with benzophenone (BP) as a PB reactant

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  图 3

  

  图 3.  定量分析脂中不同双键双键异构体相对含量的原理：(A, B)PC 18:1/18:1(6Z)/(9Z)分别为1:1和7:1时PB产物的二级质谱图; (C)以I₆/I₉对异构体的浓度比(c₆/c₉)进行线形回归

  Figure 3.  Principle of PB-pulsed-dc-ESI-MS/MS for identification C＝C location and releative quantitation of unsaturated PCs isomers: (A, B)PB-pulsed-dc-ESI-MS/MS of m/z 968 formed in a 1:1 and 7:1 mixture of PC 18:1/18:1(6Z) and PC 18:1/18:1(9Z); (C)Linear relationship established between diagnostic ion ration(I₆/I₉) and molar ratio(c₆/c₉) of the PC 18:1/18:1 C＝C location isomers

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  3.2   不饱和卵磷脂的脂肪酰基的碳原子个数和不饱和度

  在指认不饱和卵磷脂的双键位置之前，必须确定卵磷脂的碳原子个数和不饱和度。卵磷脂通过低能碰撞裂解可以得到一些特征的碎片离子信息^[14]，据此可鉴定脂的种类和原子个数及不饱和度，基于此原理，Kind等^[26]结合一些计算方法建立了生物信息学的串联质谱数据库，用于脂类鉴定。他们分析了脂类的母离子及其二级产物离子的信息后，发现脂的二级串联质谱有一定的规律，是可以预测的。在正模式下，脂主要失去极性头部，也会有失去酰基/烷基链的产物离子(M-sn1和M-sn2)和一些酰基阳离子(R₁CO⁺和R₂CO⁺)。对于典型的含有两个脂肪酰基的卵磷脂，质子化的[M+H]⁺会产生磷酸胆碱离子m/z 184、脱水离子[M+H－18]⁺、失去三甲胺的[M+H－59]⁺、失去磷酸胆碱的[M+H－183]⁺, 以及失去酰基的[M+H－R₁CH＝CO]⁺/[M+H－R₁CH＝CO－18]⁺或[M+H－R₂CH＝CO]⁺/[M+H－R₂CH＝CO－18]⁺离子和少量酰基阳离子R₁CH₂CO⁺和R₂CH₂CO⁺。但这种质子化离子的二级谱图上并不能准确判断脂肪酰基的位置，因此本实验中所鉴定的卵磷脂，并未对其脂肪酰基的位置做进一步的判断，以“_”连接两个脂肪酸，例如sn1_sn2，表示脂肪酰基在甘油位置上的不确定性^[27]。对MCF-7和MCF-10A的6种PC和2种LPC(Lysophosphatidylcholines)的质子化离子做CID，从二级谱图中的特征碎片离子中可得到脂肪酰基的碳原子个数和不饱和度，结果如表 1所示，可以判定这8种卵磷脂分别为PC 34:1(16:0_18:1)、PC 34:2(16:0_18:2/16:1_18:1)、PC 36:1(18:0_18:1)、PC 36:2(18:1_18:1/18:0_18:2)、PC 32:1(16:0_16:1/14:0_18:1)、PC 32:2(16:1_16:1/16:0_16:2)、LPC(18:1)和LPC(16:1)。

  表 1

  

  表 1  8种卵磷脂的特征碎片以及对应的碳原子个数和不饱和度

  Table 1.  Characteristic fragment ions and the number of carbons/degree of unsaturation of fatty acyl chains for 8 PCs

  下载: 导出CSV

  序号 No.	质荷比 m/z	特征碎片离子 Characteristic fragment ions	脂肪酰基的碳原子个数及不饱和度 The number of carbons/degree of unsaturation of the fatty acyl chains
  1	760.58	184.07, 478.33/496.34, 504.35/522.35, 577.52, 701.47	34:1(16:0_18:1)
  2	758.57	184.07, 476.30/494.32, 478.33/496.34, 502.33/520.34, 504.35/522.35, 575.49, 699.48	34:2(16:0_18:2/16:1_18:1)
  3	788.61	184.07, 504.34/522.35, 506.35/524.36, 605.54	36:1(18:0_18:1)
  4	786.59	184.07, 504.35/522.35, 524.31, 603.53, 727.52	36:2(18:0_18:2/18:1_18:1)
  5	732.55	184.07, 237.22, 239.24, 450.30/468.31, 476.30/494.32, 478.33/496.34, 504.34/522.35	32:1(16:0_16:1/14:0_18:1)
  6	730.53	184.07, 476.30/494.32, 478.33, 547.46, 671.46	32:2(16:1_16:1/16:0_16:2)
  7	522.35	184.07, 258.11, 504.34	18:1
  8	494.32	184.07, 258.11, 476.31	16:1

  3.3   鉴定双键位置以及双键异构体相对含量

  在确定了脂肪酰基的碳原子个数和不饱和度后，在254 nm紫外光照射下，进行PB-pulsed-dc-ESI-MS/MS分析。总体而言，这8种卵磷脂的检测结果可分为两类：PC 34:2、PC 32:1、PC 32:2、LPC 16:1只能鉴定到双键的位置，检测结果见表 2，除了LPC 16:1的双键位置是确定的，其它3种PC存在双键异构体，但由于检测离子存在重合，并不能对双键异构体进行定量分析; PC 34:1、PC 36:1、PC 36:2、LPC 18:1不仅可以鉴定双键位置，还对双键异构体的相对含量进行了检测，检测结果见表 3和图 4。双键异构体主要集中在来自18:1的脂肪酰基的Δ9和Δ11，双键异构体的相对含量在这两种细胞中存在一些差异。PC 16:0_18:1中Δ9异构体的含量在两种细胞中差异不明显，PC 18:0_18:1和PC 18:1_18:1中Δ9异构体的含量略有差异，在MCF-7和MCF-10A中PC 18:0_18:1的Δ9分别占79.0% ± 1.6%、84.1% ± 0.4%，在MCF-7和MCF-10A中PC 18:1_18:1的Δ9分别占74.5% ± 0.4%、78.2% ± 1.0%，而LPC 18:1中Δ9异构体的含量在两种细胞中差异比较明显，在MCF-7和MCF-10A中Δ9分别占56.0% ± 1.3%、71.7% ± 6.8%。

  表 2

  

  表 2  4种卵磷脂PC 34:2、PC 32:1、PC 32:2、LPC 16:1的PB产物离子及其对应的检测离子对和双键位置

  Table 2.  PB product ions, detection of ion pairs and C＝C location of PC 34

  下载: 导出CSV

  序号 No.	PB产物离子 PB product ion (m/z)	检测离子对 Detection of ion pairs (m/z)	双键位置 C＝C location
  34:2(16:0_18:2/16:1_18:1)	940.65	648/798, 676/826, 676/826 650/800, 690/840	16:1(9)_18:1(9) 16:1(9)_18:1(11) 16:0_18:2(9, 12)
  32:1(16:0_16:1/14:0_18:1)	914.64	622/772, 650/800, 678/828	16:0_16:1(7/9/11) 14:0_18:1(9/11/13)
  32:2(16:1_16:1/16:0_16:2)	912.63	620/770, 648/798 622/772, 648/798	16:1(7)_16:1(7) 16:1(9)_16:1(9) 16:0_16:2(7, 9)
  16:1	676.46	412/438	16:1(9)

  表 3

  

  表 3  MCF-7和MCF-10A中4种卵磷脂PC 34:1、PC 36:1、PC 36:2、LPC 18:1对应的检测离子对的强度和双键异构体18:1中Δ9的相对含量

  Table 3.  Intensity of diagnostic ions and Percentage content of the Δ9 in C18:1 acyl chains of PC 34:1, PC 36:1, PC 36:2, LPC 18:1 in MCF-7 and MCF-10A

  下载: 导出CSV

  	卵磷脂 PC	检测离子的强度 Intensity of diagnostic ions (C18:1(9), a.u.)		检测离子的强度 Intensity of diagnostic ions (C18:1(11), a.u.)		18:1(9)%
  MCF-7	PC	m/z 650	m/z 800	m/z 678	m/z 828
  	16:0_18:1	911.58 808.03 1684.15	505.78 539.54 964.85	324.19 360.75 602.08	196.16 301.58 449.74	73.15 67.05 71.58
  	942.64					平均值Average 70.6 标准偏差STD 3.2
  	PC	m/z 678	m/z 828	m/z 706	m/z 856
  	18:0_18:1	87.52 110.76 250.61	85.25 105.59 146.71	31.11 24.91 57.85	18.10 26.33 52.74	77.83 80.85 78.23
  	970.67					平均值Average 79.0 标准偏差STD 1.6
  	PCm/z 676	m/z 826	m/z 704	m/z 854
  	18:1_18:1	3459.38 1899.24 2323.96	2070.29 1041.14 1427.74	1122.75 634.74 800.00	746.65 356.10 515.90	74.73 74.80 74.03
  	968.67					平均值Average 74.5 标准偏差STD 0.4
  	LPC	m/z 412	m/z 562	m/z 440	m/z 590
  	18:1	23.60 13.54 18.83	24.69 17.83 27.85	16.39 18.20 22.39	20.25 8.05 13.39	56.86 54.44 56.61
  	704.54					平均值Average 56.0 标准偏差STD 1.3
  MCF-10A	PC	m/z 650	m/z 800	m/z 678	m/z 828
  	16:0_18:1	436.05 808.65 320.00	231.41 529.06 184.73	165.97 268 113.33	98.71 250.42 103.71	71.60 72.07 69.93
  	942.64					平均值Average 71.2 标准偏差STD 1.1
  	2	PC	m/z 678	m/z 828	m/z 706	m/z 856
  	18:0_18:1	118.68 85.17 106.33	60.49 47.03 61.19	14.46 10.23 12.89	20.59 14.2 18.27	83.64 84.40 84.32
  	970.67					平均值Average 84.1 标准偏差STD 0.4
  	PC	m/z 676	m/z 826	m/z 704	m/z 854
  	18:1_18:1	1878.88 1796.77 802.98	1023.4 1001.02 517.78	466.42 495.54 221.92	381.24 294.5 121.96	77.40 77.98 79.34
  	968.67					平均值Average 78.2 标准偏差STD 1.0
  	LPC	m/z 412	m/z 562	m/z 440	m/z 590
  	18:1	88.87 38.33 51.26	78.98 17.71 15.72	26.20 15.05 17.23	17.07 10.64 15.53	79.50 68.57 67.15
  	704.54					平均值Average 71.7 标准偏差STD 6.8

  图 4

  

  图 4.  MCF-7和MCF-10A细胞中的4种卵磷脂中脂肪酰基为C18:1的Δ9和Δ11双键异构体相对含量

  Figure 4.  Percentage content of the Δ9 and Δ11 C＝C isomers for PCs containing C18:1 acyl chains in MCF-7 and MCF-10A

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  上述结果对于不同疾病状态的辨别有指导意义，因在疾病恶化或减轻的过程中，会伴随不饱和磷脂的一些变化^[12]。有研究表明，碳碳双键异构体的组成，尤其是ω-3和ω-6脂肪酸的比例在一些慢性疾病的发展过程中有比较重要的影响，如摄入高比例的亚麻酸18:3 ω-3会阻止心血管疾病的发生，而摄入高比例的亚麻酸18:3 ω-6则会恶化心血管疾病^[28]。

  4.   结论

  本研究提出一种新的光化学反应的反应物BP，建立了乳腺细胞中不饱和卵磷脂双键位置和双键异构体相对含量的在线光化学反应-脉冲直流电喷雾串联质谱(PB-pulsed-dc-ESI-MS/MS)的检测方法。以BP为光化学反应的衍生试剂，可使PB产物在质谱图中与原来的反应物磷脂很好地分离，且得到的检测离子相差比较大(150 Da)，可避免一些检测离子重合。结合了脉冲直流电喷雾法，避免了电极与溶液的接触，且流速较低，可节约样品量，同时又不会降低灵敏度。分析了癌细胞MCF-7和正常细胞MCF-10A中8种不饱和卵磷脂的双键位置及其中4种双键异构体的相对含量，并发现了一些含量的差异。本方法可以快速准确分析双键位置以及双键异构体相对含量，拓展了不同细胞状态和疾病状态的辨别方法。

  
  
• 1. [1]

     Griffin J L, Shockcor J P. Nat. Rev. Cancer, 2004, 4(7):551-561 doi: 10.1038/nrc1390

  2. [2]

     Corda D, de Matteis M A. FEBS J., 2013, 280(24):6280 doi: 10.1111/febs.12604

  3. [3]

     Wymann M P, Schneiter R. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2008, 9(2):162-176 doi: 10.1038/nrm2335

  4. [4]

     Pastural É, Ritchie S, Lu Y, Jin W, Kavianpour A, Khine Su-Myat K, Heath D, Wood P L, Fisk M, Goodenowe D B. Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids, 2009, 81(4):253-264 doi: 10.1016/j.plefa.2009.06.003

  5. [5]

     Lagarde M, Bernoud-Hubac N, Guichardant M. Mol. Membr. Biol., 2012, 29(7):222-228 doi: 10.3109/09687688.2012.689378

  6. [6]

     Eberlin L S, Dill A L, Golby A J, Ligon K L, Wiseman J M, Cooks R G, Agar N Y R. Angew. Chem. Int. Ed., 2010, 49(34):5953-5956 doi: 10.1002/anie.201001452

  7. [7]

     Ejsing C S, Sampaio J L, Surendranath V, Duchoslav E, Ekroos K, Klemm R W, Simons K, Shevchenko A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2009, 106(7):2136-2141 doi: 10.1073/pnas.0811700106

  8. [8]

     Zhang Y M, Rock C O. Nat. Rev. Microbiol., 2008, 6(3):222-233 doi: 10.1038/nrmicro1839

  9. [9]

     Martinez-Seara H, Rog T, Pasenkiewicz-Gierula M, Vattulainen I, Karttunen M, Reigada R. Biophys. J., 2008, 95(7):3295-3305 doi: 10.1529/biophysj.108.138123

  10. [10]

      Shinzawa-Itoh K, Aoyama H, Muramoto K, Terada H, Kurauchi T, Tadehara Y, Yamasaki A, Sugimura T, Kurono S, Tsujimoto K, Mizushima T, Yamashita E, Tsukihara T, Yoshikawa S. EMBO J., 2007, 26(6):1713-1725 doi: 10.1038/sj.emboj.7601618

  11. [11]

      Odegaard A O, Pereira M A. Nutr. Rev., 2006, 64(8):364-372 doi: 10.1111/nure.2006.64.issue-8

  12. [12]

      Kelley N S, Hubbard N E, Erickson K L. J. Nutr., 2007, 137(12):2599-2607

  13. [13]

      Bordoni A, Lopez-Jimenez J A, Spanò C, Biagi P, Horrobin D F, Hrelia S. Mol. Cell. Biochem., 1996, 157(1):217-222

  14. [14]

      Hsu F F, Turk J. J. Chromatogr. B, 2009, 877(26):2673-2695 doi: 10.1016/j.jchromb.2009.02.033

  15. [15]

      Pulfer M, Murphy R C. Mass Spectrom. Rev., 2003, 22(5):332-364 doi: 10.1002/(ISSN)1098-2787

  16. [16]

      Harrison K A, Murphy R C. Anal. Chem., 1996, 68(18):3224-3230 doi: 10.1021/ac960302c

  17. [17]

      Francis G W. Chem. Phys. Lipids, 1981, 29(4):369-374 doi: 10.1016/0009-3084(81)90070-0

  18. [18]

      Blomquist G J, Howard R W, McDaniel C A, Remaley S, Dwyer L A, Nelson D R. J. Chem. Ecol., 1980, 6(1):257-269 doi: 10.1007/BF00987544

  19. [19]

      Tomer K B, Crow F W, Gross M L. J. Am. Chem. Soc., 1983, 105(16):5487-5488 doi: 10.1021/ja00354a055

  20. [20]

      Thomas M C, Mitchell T W, Harman D G, Deeley J M, Nealon J R, Blanksby S J. Anal. Chem., 2008, 80(1):303-311 doi: 10.1021/ac7017684

  21. [21]

      Pham H T, Ly T, Trevitt A J, Mitchell T W, Blanksby S J. Anal. Chem., 2012, 84(17):7525-7532 doi: 10.1021/ac301652a

  22. [22]

      Poad B L J, Green M R, Kirk J M, Tomczyk N, Mitchell T W, Blanksby S J. Anal. Chem., 2017, 89(7):4223-4229 doi: 10.1021/acs.analchem.7b00268

  23. [23]

      Ma X, Xia Y. Angew. Chem. Int. Ed., 2014, 53(10):2592-2596 doi: 10.1002/anie.201310699

  24. [24]

      Wei Z, Xiong X, Guo C, Si X, Zhao Y, He M, Yang C, Xu W, Tang F, Fang X, Zhang S, Zhang X.Anal. Chem., 2015, 87(22):11242-11248 doi: 10.1021/acs.analchem.5b02115

  25. [25]

      Sapcariu S C, Kanashova T, Weindl D, Ghelfi J, Dittmar G, Hiller K. METHODSX, 2014, 1(1):74-80

  26. [26]

      Kind T, Liu K H, Lee D Y, DeFelice B, Meissen J K, Fiehn O. Nat. Methods, 2013, 10(8):755-758 doi: 10.1038/nmeth.2551

  27. [27]

      Liebisch G, Vizcaíno J A, Köfeler H, Trötzmüller M, Griffiths W J, Schmitz G, Spener F, Wakelam M J O. J. Lipid Res., 2013, 54(6):1523-1530 doi: 10.1194/jlr.M033506

  28. [28]

      Simopoulos A P. Exp. Biol. Med. (Maywood), 2008, 233(6):674-688 doi: 10.3181/0711-MR-311

• 

  图 1  实验装置示意图

  Figure 1  Schematic diagram of experimental setup. Pulsed-dc-ESI: pulsed directed current electrospray

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  图 2  以二苯甲酮作为PB反应物, 利用在线光化学反应-脉冲直流电喷雾串联质谱鉴定不饱和卵磷脂双键位置的示意图

  Figure 2  Schematic diagram of coupling Paterno-Büchi (PB) reaction with pulsed-dc-ESI-MS/MS for C＝C position of an unsaturated phosphatidylcholines (PCs) with benzophenone (BP) as a PB reactant

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  图 3  定量分析脂中不同双键双键异构体相对含量的原理：(A, B)PC 18:1/18:1(6Z)/(9Z)分别为1:1和7:1时PB产物的二级质谱图; (C)以I₆/I₉对异构体的浓度比(c₆/c₉)进行线形回归

  Figure 3  Principle of PB-pulsed-dc-ESI-MS/MS for identification C＝C location and releative quantitation of unsaturated PCs isomers: (A, B)PB-pulsed-dc-ESI-MS/MS of m/z 968 formed in a 1:1 and 7:1 mixture of PC 18:1/18:1(6Z) and PC 18:1/18:1(9Z); (C)Linear relationship established between diagnostic ion ration(I₆/I₉) and molar ratio(c₆/c₉) of the PC 18:1/18:1 C＝C location isomers

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  图 4  MCF-7和MCF-10A细胞中的4种卵磷脂中脂肪酰基为C18:1的Δ9和Δ11双键异构体相对含量

  Figure 4  Percentage content of the Δ9 and Δ11 C＝C isomers for PCs containing C18:1 acyl chains in MCF-7 and MCF-10A

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  表 1  8种卵磷脂的特征碎片以及对应的碳原子个数和不饱和度

  Table 1.  Characteristic fragment ions and the number of carbons/degree of unsaturation of fatty acyl chains for 8 PCs

  序号 No.	质荷比 m/z	特征碎片离子 Characteristic fragment ions	脂肪酰基的碳原子个数及不饱和度 The number of carbons/degree of unsaturation of the fatty acyl chains
  1	760.58	184.07, 478.33/496.34, 504.35/522.35, 577.52, 701.47	34:1(16:0_18:1)
  2	758.57	184.07, 476.30/494.32, 478.33/496.34, 502.33/520.34, 504.35/522.35, 575.49, 699.48	34:2(16:0_18:2/16:1_18:1)
  3	788.61	184.07, 504.34/522.35, 506.35/524.36, 605.54	36:1(18:0_18:1)
  4	786.59	184.07, 504.35/522.35, 524.31, 603.53, 727.52	36:2(18:0_18:2/18:1_18:1)
  5	732.55	184.07, 237.22, 239.24, 450.30/468.31, 476.30/494.32, 478.33/496.34, 504.34/522.35	32:1(16:0_16:1/14:0_18:1)
  6	730.53	184.07, 476.30/494.32, 478.33, 547.46, 671.46	32:2(16:1_16:1/16:0_16:2)
  7	522.35	184.07, 258.11, 504.34	18:1
  8	494.32	184.07, 258.11, 476.31	16:1

  下载: 导出CSV

  表 2  4种卵磷脂PC 34:2、PC 32:1、PC 32:2、LPC 16:1的PB产物离子及其对应的检测离子对和双键位置

  Table 2.  PB product ions, detection of ion pairs and C＝C location of PC 34

  序号 No.	PB产物离子 PB product ion (m/z)	检测离子对 Detection of ion pairs (m/z)	双键位置 C＝C location
  34:2(16:0_18:2/16:1_18:1)	940.65	648/798, 676/826, 676/826 650/800, 690/840	16:1(9)_18:1(9) 16:1(9)_18:1(11) 16:0_18:2(9, 12)
  32:1(16:0_16:1/14:0_18:1)	914.64	622/772, 650/800, 678/828	16:0_16:1(7/9/11) 14:0_18:1(9/11/13)
  32:2(16:1_16:1/16:0_16:2)	912.63	620/770, 648/798 622/772, 648/798	16:1(7)_16:1(7) 16:1(9)_16:1(9) 16:0_16:2(7, 9)
  16:1	676.46	412/438	16:1(9)

  下载: 导出CSV

  表 3  MCF-7和MCF-10A中4种卵磷脂PC 34:1、PC 36:1、PC 36:2、LPC 18:1对应的检测离子对的强度和双键异构体18:1中Δ9的相对含量

  Table 3.  Intensity of diagnostic ions and Percentage content of the Δ9 in C18:1 acyl chains of PC 34:1, PC 36:1, PC 36:2, LPC 18:1 in MCF-7 and MCF-10A

  	卵磷脂 PC	检测离子的强度 Intensity of diagnostic ions (C18:1(9), a.u.)		检测离子的强度 Intensity of diagnostic ions (C18:1(11), a.u.)		18:1(9)%
  MCF-7	PC	m/z 650	m/z 800	m/z 678	m/z 828
  	16:0_18:1	911.58 808.03 1684.15	505.78 539.54 964.85	324.19 360.75 602.08	196.16 301.58 449.74	73.15 67.05 71.58
  	942.64					平均值Average 70.6 标准偏差STD 3.2
  	PC	m/z 678	m/z 828	m/z 706	m/z 856
  	18:0_18:1	87.52 110.76 250.61	85.25 105.59 146.71	31.11 24.91 57.85	18.10 26.33 52.74	77.83 80.85 78.23
  	970.67					平均值Average 79.0 标准偏差STD 1.6
  	PCm/z 676	m/z 826	m/z 704	m/z 854
  	18:1_18:1	3459.38 1899.24 2323.96	2070.29 1041.14 1427.74	1122.75 634.74 800.00	746.65 356.10 515.90	74.73 74.80 74.03
  	968.67					平均值Average 74.5 标准偏差STD 0.4
  	LPC	m/z 412	m/z 562	m/z 440	m/z 590
  	18:1	23.60 13.54 18.83	24.69 17.83 27.85	16.39 18.20 22.39	20.25 8.05 13.39	56.86 54.44 56.61
  	704.54					平均值Average 56.0 标准偏差STD 1.3
  MCF-10A	PC	m/z 650	m/z 800	m/z 678	m/z 828
  	16:0_18:1	436.05 808.65 320.00	231.41 529.06 184.73	165.97 268 113.33	98.71 250.42 103.71	71.60 72.07 69.93
  	942.64					平均值Average 71.2 标准偏差STD 1.1
  	2	PC	m/z 678	m/z 828	m/z 706	m/z 856
  	18:0_18:1	118.68 85.17 106.33	60.49 47.03 61.19	14.46 10.23 12.89	20.59 14.2 18.27	83.64 84.40 84.32
  	970.67					平均值Average 84.1 标准偏差STD 0.4
  	PC	m/z 676	m/z 826	m/z 704	m/z 854
  	18:1_18:1	1878.88 1796.77 802.98	1023.4 1001.02 517.78	466.42 495.54 221.92	381.24 294.5 121.96	77.40 77.98 79.34
  	968.67					平均值Average 78.2 标准偏差STD 1.0
  	LPC	m/z 412	m/z 562	m/z 440	m/z 590
  	18:1	88.87 38.33 51.26	78.98 17.71 15.72	26.20 15.05 17.23	17.07 10.64 15.53	79.50 68.57 67.15
  	704.54					平均值Average 71.7 标准偏差STD 6.8

  下载: 导出CSV
•