English

• 1.   引 言

  孔雀石绿(Malachite green，MG，图 1)是三苯甲烷类工业染料，从1933年起作为杀菌剂、防腐剂被广泛用于预防与治疗水产动物养殖中的水霉病、鳃霉病和小瓜虫病等^{[1, 2]}。但是，孔雀石绿及其代谢物隐性孔雀石绿具有潜在“三致”作用，可能对人类健康与环境造成危害^[3~6]。因此，美国、加拿大、欧盟等国家都禁止在水产养殖中使用孔雀石绿，我国于2002年将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单中》^{[7, 8]}。然而，由于孔雀石绿杀菌、防腐效果好，且价格低廉，致使一些生产者受利益驱动在水产品养殖、运输及贮存中违规使用情况依然存在^{[9, 10]}。因此，研究孔雀石绿快速检测方法显得尤为重要^[11]。

  图 1

  

  图 1  孔雀石绿及其结构类似物结构式

  Figure 1.  The chemical structures of MG and its structural analogues

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  目前，检测孔雀石绿的方法主要有高效液相色谱法(HPLC)^{[12, 13]}、拉曼光谱法^[14]、液/质联用分析法(LC-MS)^{[15, 16]}和免疫学方法等^[17-22]。仪器分析方法多数需要昂贵的检测仪器，检测成本高，对操作人员技术要求高，难以满足基层量大面广的现场快速筛查需求; 有些仪器方法为增强信号需要将LMG氧化为MG再测定MG含量^[14]。免疫分析方法具有灵敏度好、特异性高、操作简便、检测成本低、适合现场筛选等特点^[20]，已成为食品、药品等领域快速检测技术的重要组成部分。近年来,关于孔雀石绿抗体制备和免疫检测方法建立的研究报道主要是通过羧基化^{[17, 18, 21]}、氨基化^[19]衍生合成半抗原,并制备孔雀石绿抗体，但该方法重复性较差，本课题组多次重复均无法制备出孔雀石绿的抗体。另外，Yang等^[17]制备出孔雀石绿多克隆抗体，虽然检测限达0.05 μg/L，但鉴于多克隆抗体存在制备周期长、批间重复性差等不足，不利于批量生产和应用; Oplatowska等^[18]通过制备孔雀石绿单克隆抗体建立了免疫检测方法，但检测灵敏度不理想(检测限为0.27 μg/L)。因此，本研究在前期研究基础^{[23, 24]}上，采用羧乙氧基手臂半抗原新策略，开展了孔雀石绿单克隆抗体稳定制备及高灵敏度间接竞争酶联免疫检测方法(icELISA)研究，方法检测限可达0.05 μg/L，经HPLC-MS/MS方法比对验证，本方法检测准确、稳定，整体性能优于现有文献报道，可以满足孔雀石绿的实际检测需求。

  2.   实验部分

  2.1.   仪器与试剂

  U-3010A 紫外-可见分光光度计(日本Hitachi公司); Multiskan-MK3 多功能酶标仪和Wellwash-MK2 洗板机(美国Thermo公司); API3000液相色谱三重四极杆质谱仪(美国Perkin-Elmer公司); DRX-400/600 核磁共振仪(德国Burker公司)。

  N,N-二甲基苯胺(AR，中国亭新化工试剂厂); 羧基苯甲醛、羟基苯甲醛、氯乙酸钠、孔雀石绿、孔雀绿(98%，Alfa Aesar公司); 隐孔雀石绿(91%，上海安谱科学仪器有限公司); 氘代孔雀石绿(D5-MG，>99.0%，Dr. Ehrenstorfex公司); 铁粉(>95%，AR级，天津市科密欧化学试剂开发中心); 卵清蛋白(98%)、弗氏完全佐剂与不完全佐剂(99%)、N-羟基琥珀酰亚胺(99%)、二环己基碳二亚胺(98.6%)和牛血清蛋白(98%)(Sigma 公司); HRP 标记羊抗鼠IgG抗体(武汉博士德生物工程有限公司); BCA(Bicinchoninic acid)蛋白浓度测定试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司); 小鼠单克隆抗体亚类鉴定试剂盒(Sigma公司); 包被液(pH 9.6、0.1 mol/L碳酸盐缓冲液)、洗涤液(含0.05%吐温-20、pH 7.4的0.01 mol/L 磷酸盐缓冲液)、封闭液(5%的脱脂奶粉磷酸盐溶液)，稀释液为磷酸盐缓冲液(0.2 g/L KH₂PO₄,2.9 g/L Na₂HPO₄·12H₂O,0.2 g/L KCl,8.5 g/L NaCl,0.05% Tween-20); 其它试剂均为国产分析纯或色谱纯，鱼、虾等样品购于广州本地超市。

  SPF级Balb/c雌性小鼠、普通级雌性昆明鼠均购自广东省医学动物实验中心(广东佛山)，鼠骨髓瘤细胞SP2/0(来自中山医科大学，本实验室保藏)。

  2.2.   实验方法

  2.2.2.   人工抗原的合成和鉴定

  采用活泼酯法^[27]将半抗原MGH与载体蛋白BSA和OVA 分别偶联，合成系列不同偶联比人工抗原，采用Bicichoninic acid(BCA)法^[28]测定蛋白或偶联物浓度，采用紫外光谱法^[29]对偶联产物进行鉴定。

  2.2.1.   孔雀石绿半抗原的合成、纯化和鉴定

  参考Burgstahler等^[25]方法,合成半抗原MGH: 于烧瓶中加入6.1 g羟基苯甲醛，10 mL 5mol/L NaOH溶液，5.8 g氯乙酸钠和40 mL蒸馏水，60℃下加热搅拌反应2～3 h。反应结束后用浓HCl调pH=2左右，NaHCO₃调碱，二氯甲烷萃取; 水相用浓HCl调至沉淀析出，抽干得中间产物1。参考文献^[26]方法，取N,N－二甲基苯胺2.50 g于烧瓶中，加入5.0 g Aberlyst 15 Resin，搅拌下加等摩尔当量的中间产物1，氮气回流加热搅拌过夜。反应完成后，加入1.0 mol/L 的NaHCO₃溶液，乙酸乙酯萃取、饱和NaCl 洗涤、无水硫酸钠除水，减压旋蒸得中间产物2。称取5g中间产物于圆底烧瓶中，加10 mL蒸馏水，加5g PbO₂，滴加1 mL 浓盐酸，室温搅拌反应过夜后产物用甲醇洗脱，硅藻土柱层析纯化，硅胶柱层析纯化得孔雀石绿半抗原MGH，合成路线见下式：

  图 ${contentEle.labelText}

  

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  半抗原纯化后采用ESI/APCI-MS 或¹H-NMR鉴定。

  2.2.6.   HPLC-MS/MS方法验证

  采用内标法，在测定样品中加入10 μg/kg的氘代MG标准液做内标，样品前处理方法同2.2.5 节。使用HPLC-MS/MS进行方法比对，色谱条件如下：色谱柱为Agilent Zorbax Eclipse PlusC₁₈(150 mm×4.6 mm,5 μm); 流动相由乙腈(A)和5 mol/L乙酸铵(B)组成，梯度洗脱参数为: 0 min：70% A,30% B; 3~14 min：95% A,5% B; 流速：0.5 mL/min; 柱温：25℃; 进样量： 20 μL。质谱条件：电喷雾离子源(ESI)正离子扫描，采用多反应监测(MRM)模式; 电喷雾电压5500 V，辅助气压力70 psi，雾化气压力60 psi，气帘气压力20 psi，离子源温度350℃; 孔雀石绿：定性离子对(m/z)329.2/208.2、331.2/315.2，定量离子对(m/z)329.2/208.2，去簇电压60V，碰撞气能量48 eV，碰撞室出口电压为15V; 氘代孔雀石绿内标：定性离子对(m/z)334.2/318.3、334.2/213.2，定量离子对(m/z)334.2/318.3，去簇电压65V，碰撞气能量51eV，碰撞室出口电压13V。

  2.2.5.   添加回收率的测定

  孔雀石绿标准品稀释成不同浓度的标准溶液; 鱼肉样品：新鲜鱼(去皮剔骨)、虾(虾去头脱壳)，将肉剁碎成肉末，于-20℃冷冻保存，待用。阴性样品测定：称取2 g鱼、虾肉于15 mL离心管中，加入1.2 mL、1 mol/L的对甲苯磺酸溶液，加入2.8 mL蒸馏水或标准品稀释液。剧烈振荡5 min，4000 r/min离心10 min，取上清，重复上述操作，合并两次上清，加入1 mL 正己烷，震荡1 min，3000 r/min离心5min，取下层溶液进行icELISA检测; 添加回收率测定：实验前称取鱼、虾肉样品，添加浓度分别为0,1,3,5 μg/kg的MG，震荡均匀，避光放置于4℃冰箱过夜，前处理方法同阴性样品测定方法所述。

  2.2.3.   单克隆抗体的制备和鉴定

  参照文献^[30]的方法对Balb/c雌鼠进行动物免疫，采用间接ELISA和间接竞争ELISA方法对免疫血清进行效价和特异性鉴定; 参照文献^[31]的方法进行小鼠脾细胞与SP 2/0 瘤细胞的细胞融合与筛选; 采用小鼠腹腔诱导腹水制备单克隆抗体^[32]，以饱和硫酸铵沉淀法纯化单克隆抗体蛋白^[33]; 采用间接ELISA 鉴定抗体亚类，按Sigma 公司鼠单克隆抗体分类试剂盒说明书操作; 采用间接ELISA 测定亲和常数(K_a)。

  2.2.4.   icELISA方法的建立

  根据文献^[37]所述操作步骤，棋盘滴定法确定最佳抗体稀释倍数及包被原浓度; 通过单因素实验，优化包被抗原种类、浓度和二抗浓度的最佳条件。以MG浓度的常用对数值为横坐标，以B/B₀为纵坐标(其中，B₀为不加药物时的吸光值A_{450 nm}，B为药物浓度为x时的A_{450 nm})，B/B₀为0.5所对应的浓度即为IC₅₀值。以A_max/IC₅₀的比值作为评价各影响因素的标准，比值越大，则代表灵敏度越高^[34]。选取最佳的反应条件，使用Origin 9.0 软件，按照四参数对数拟合绘制标准曲线。

  3.   结果与讨论

  3.1.   孔雀石绿半抗原的设计与合成

  小分子化合物抗体制备关键在于合理结构半抗原的设计合成，通常引入3～6个碳原子长度的空间间隔臂有利于目标结构“暴露”于载体表面，易被机体免疫系统识别，增加产生特异性抗体的可能性^{[35, 36]}。本研究基于孔雀石绿三苯环结构，在前期半抗原制备和抗体特异性反应研究结果基础上^{[24, 37]}，设计合成基于羧乙氧基手臂的高质量孔雀石绿半抗原，经质谱与核磁技术分析，半抗原MGH合成成功(图 2)。MS(APCI positive)m/z: 403.1 [M]⁺。¹H NMR (600 MHz,CDCl₃,TMS): δ7.36 (d,J=8.7 Hz,4H),7.27 (d,J=10.2 Hz,2H),7.12 (d,J=8.3 Hz,2H),6.88 (d,J=8.6 Hz,4H),4.76 (s,2H),3.31 (s,12H)。

  图 2

  

  图 2  半抗原MGH的离子质谱图(A)和核磁氢谱图(B)

  Figure 2.  Mass spectrum (A) and H¹-NMR spectrum (B) of hapten MGH

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  3.2.   人工抗原的合成与鉴定

  一般来说，不同偶联比的抗原对抗体特性有一定影响，有研究认为每100 kDa载体蛋白上连接10~30个半抗原分子较有利于抗体产生^[38]。同时，不同偶联比的包被抗原也对抗体的竞争识别灵敏度产生影响。因此，本实验通过控制半抗原和载体蛋白偶联时的不同投料摩尔比，合成系列不同偶联比的人工抗原A1~A6(表 1)。以BSA载体基人工抗原A1和OVA载体基人工抗原A4为例，UV-Vis光谱图显示，抗原同时具备了MG和载体蛋白的吸收特征，表明人工抗原合成成功(图 3)。同时，参照Fedenko^[29]的方法测定了抗原偶联比在7:1~34:1之间(表 1)。

  表 1

  

  表 1  紫外可见吸收光谱法测定人工抗原偶联比结果

  Table 1.  The coupling ratio of artificial antigen determined by UV-vis absorption spectroscopy

  下载: 导出CSV

  抗原 Antigen	半抗原 Hapten	载体蛋白 Carrier protein	投料摩尔比 Molar ratio	半抗原浓度/半抗原分子量 Hapten concentration/ Hapten molecular weight (μg/mL)/Da	抗原蛋白浓度/蛋白分子量 Antigen concentration/ Protein molecular weight (mg/mL)/Da	偶联比 Coupling ratio
  A1	MGH	牛血清白蛋白 BSA	100:1	0.024/374	0.13/68000	34:1
  A2			50:1	0.063/443	0.37/68000	26:1
  A3			20:1	0.038/403	0.56/68000	12:1
  A4		卵清蛋白 OVA	50:1	0.052/403	0.34/45000	17:1
  A5			20:1	0.037/403	0.33/45000	13:1
  A6			10:1	0.041/403	0.64/45000	7:1

  图 3

  

  图 3  孔雀石绿人工抗原紫外-可见吸收光谱图

  Figure 3.  UV-vis spectra of artificial antigen of MG

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  3.3.   不同偶联比抗原对抗血清识别性能的影响

  免疫抗原的半抗原偶联比及载体蛋白，通常会对诱导动物机体产生的抗体识别性能产生影响。为此，实验分别选择了BSA和OVA两种载体蛋白，采用高、低两种偶联比抗原(A1,A3,A4,A6)免疫动物，对不同偶联比人工抗原免疫的12只小鼠采取尾部取血，4000 r/min离心取血清，采用icELISA考察了抗血清的亲和力和特异性。 同时，考虑到抗原偶联比对抗体竞争识别灵敏度产生影响，实验考察了BSA和OVA两种载体蛋白的6种不同偶联比包被抗原条件下抗血清的识别性能(图 4,图 5)。结果表明：以BSA为载体的高偶联比(34:1)抗原A1免疫获得的抗血清效价(图 4a)显著优于低偶联比抗原A3免疫获得的抗血清效价(图 4b)，且低偶联比抗原A3的抗血清对MG无特异性识别(图 4b); 以OVA为载体的不同偶联比抗原(A4、A6)免疫获得的抗血清效价整体高于BSA载体基抗原的血清(OVA：32000~64000，BSA：1000~32000)，且基于不同偶联比免疫抗原A4(图 5a)和A6(图 5b)获得的抗血清对MG均有特异性识别(图 5)，其中抗原A4的抗血清(图 5a)对MG的识别性能最佳，灵敏度IC₅₀为2.34 μg/mL、抗血清效价达1:64000。因此，选择抗原A4免疫小鼠进行单克隆抗体的制备。

  图 4

  

  图 4  不同偶联比BSA载体基免疫原对抗血清的影响

  Figure 4.  Effect on antiserum of BSA carrier-based immunogen with different coupling ratios

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  图 5

  

  图 5  不同偶联比OVA载体基免疫原对抗血清的影响

  Figure 5.  Effect on antiserum of OVA carrier-based immunogen with different coupling ratios

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  3.4.   单克隆抗体的制备与鉴定

  参照文献^[29]方法进行细胞融合与筛选。培养10天后，显微镜观察细胞融合率达35.6%，杂交瘤细胞克隆长至目镜可视面积的1/4~1/3时，对有杂交瘤细胞的上清液用icELISA检测，检测结果有2孔呈阳性，阳性率为4%，且用icELISA进行检测，均可被MG抑制。选择A_{450 nm}值高、对MG 抑制好的阳性细胞孔进行亚克隆，获得一株稳定分泌抗MG抗体的细胞株(命名为MG-DA4-C7)，抗体亚型为IgM、轻链为κ型，抗体亲和力常数(K_a)为7.19×10⁹ L/mol。

  3.5.   MG单克隆抗体icELISA方法的建立

  基于前期半抗原制备和抗体特异性反应研究结果^{[24, 36]}，以A_max/IC₅₀值为判断标准^[35]，对包被原浓度、抗体稀释倍数、二抗稀释倍数、缓冲溶液pH值进行优化。确定最佳工作条件如下：包被抗原为A5，包被浓度为0.5 μg/mL，抗体稀释倍数为50000倍(2.68×10^-5 mg/mL)，二抗稀释倍数为6000倍(1.67×10^-4 mg/mL)，缓冲体系为0.05% Tween-20、pH=6.4的PBST 溶液。

  根据上述优化条件，实验建立了孔雀石绿酶联免疫检测方法的标准曲线(图 6)，方法半抑制浓度(IC₅₀)为0.96 μg/L，检测范围(IC₂₀~IC₈₀)为0.1~8.1 μg/L，LOD(IC₁₀)=0.05 μg/L，线性回归方程为y=-0.3274lgx+0.4698(R²=0.9891)。

  图 6

  

  图 6  icELISA法检测孔雀石绿标准曲线(n=3)

  Figure 6.  Standard curve for detection of malachite green by icELISA (n=3)

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  3.6.   方法特异性分析

  以交叉反应率(Cross-reactivity,CR)评价icELISA方法的特异性，CR越高，特异性越差^[35]。计算公式如下：

  选择与孔雀石绿结构相似的三苯甲烷类药物以及一些次级结构药物进行方法特异性评价，结果如表 2所示，基于孔雀石绿单克隆抗体建立的icELISA方法特异性较好，与结晶紫、灿烂绿交叉反应率分别为18.1%和26.5%，与隐孔雀石绿、隐性结晶紫交叉反应率分别为0.035%和0.04%，与其它次级结构无交叉反应。

  表 2

  

  表 2  基于单克隆抗体建立的ic-ELISA方法对MG及其结构类似物的交叉反应率

  Table 2.  Cross-reactivity of monoclonal antibody against MG and its analogs by the icELISA

  下载: 导出CSV

  交叉反应物 Competitive compound	结构式 Chemical structure	半抑制浓度 IC50(μg/L)	交叉反应率 Cross-reactivity (%)
  孔雀石绿 Malachite green，MG		0.96	100
  隐性孔雀石绿 Leuco-malachite green，LMG		2730	0.035
  隐性结晶紫 Leuco-crystal violet，LCV		2407	0.04
  结晶紫 Crystal violet，CV		5.29	18.1
  孔雀石绿carbinol malachite green carbinol，MGc		16.24	5.91
  副品红 Pararosoniline，PA		4431	2.17
  亚甲基蓝 Methylene blue，MB		138.58	6.92
  隐性灿烂绿 Leuco-brilliant green，LBG		>10000	＜0.01
  灿烂绿 Brilliant green，BG		3.62	26.5
  N,N-二甲基苯胺 N,N-Dimethylaniline		>10000	＜0.01
  N,N-二乙基苯胺 N,N-Diethylaniline		>10000	＜0.01
  苯甲醚 Anisole		>10000	＜0.01
  甲苯 Methylbenzene		>10000	＜0.01

  3.7.   添加回收实验

  实验选用所购鱼虾样品，先用HPLC-MS/MS法准确测定空白样品中MG的含量，在此基础上添加已知浓度的MG，采用icELISA进行检测，扣除空白样品MG含量后计算添加MG的回收率。结果表明方法平均添加回收率为87.3%~107.3%之间。通过HPLC-MS/MS对方法的准确度进行评价，由表 3中数据可知：所建立的icELISA方法对实际样品检测结果与HPLC-MS/MS检测结果，两者相关系数达0.999，表明所建立的icELISA方法能够准确筛选出阳性样品，满足现有实际检测需求。

  表 3

  

  表 3  icELISA法和HPLC-MS/MS 法测定样品添加回收结果比对(n=3)

  Table 3.  Recoveries of fish sample fortified with MG by icELISA and HPLC-MS/MS method (n=3)

  下载: 导出CSV

  样品 Sample	添加浓度 Added (μg/kg)	icELISA				HPLC-MS/MS
  		测量浓度 Measured value (μg/kg)	回收率 Recovery (%)	相对标准偏差 RSD (%)		测量浓度 Measured value (μg/kg)	回收率 Recovery (%)	相对标准偏差 RSD (%)
  多宝鱼 Turbot	0.0	0	－	－		0	－	－
  	0.5	0.51±0.03	101.9	5.0		0.49±0.02	98.1	4.1
  	1.0	0.94±0.06	93.6	2.6		0.96±0.05	95.6	5.2
  	3.0	3.07±0.12	102.2	3.9		2.88±0.07	96.0	2.4
  鲈鱼 Weever	0.0	0	－	－		0	－	－
  	0.5	0.44±0.02	87.3	4.1		0.46±0.03	92.0	6.5
  	1.0	0.96±0.07	96.2	7.0		0.93±0.04	93.1	4.3
  	3.0	2.98±0.07	99.3	2.3		2.91±0.07	97.2	2.4
  桂花鱼 Mandarin fish	0.0	0	－	－		0	－	－
  	0.5	0.46±0.02	91.4	3.2		0.47±0.03	94.0	6.4
  	1.0	0.94±0.06	93.6	2.6		0.97±0.05	96.7	5.2
  	3.0	3.07±0.12	102.2	3.9		2.95±0.08	98.3	2.7
  虾 Shrimp	0.0	0	－	－		0	－	－
  	0.5	0.47±0.04	94.3	8.1		0.48±0.03	96.0	6.2
  	1.0	1.07±0.06	107.3	5.8		0.97±0.05	97.1	5.7
  	3.0	2.94±0.07	98.1	2.5		2.96±0.07	98.7	2.4
  平均值 Average		97.3				96.1

  3.8.   精密度实验

  按本实验建立的方法，制备icELISA法检测MG试剂盒。采用3个批次的试剂盒分别测定0.5,1.0和3.0 μg/kg浓度添加空白鲈鱼样品，每个浓度样品做3个重复，计算样品添加回收率和批内相对标准偏差，统计3个批次试剂盒的批间相对标准偏差。表 4数据表明，试剂盒批(板)内相对标准偏差＜10%，批(板)间相对标准偏差＜5%，完全可以满足实际样品中MG残留的快速检测需求。

  表 4

  

  表 4  icELISA 试剂盒检测鲈鱼样品中MG的精密度(n=3)

  Table 4.  Detection precision of malachite green spiked to weever sample by icELISA kit (n=3)

  下载: 导出CSV

  样品 Sample	浓度 Added (μg/kg)	批次 Batch	测定值 Measured (μg/kg)	回收率 Recovery (%)	相对标准偏差 RSD(%)
  					批内 Intra-batch	批间 Inter-batch
  鲈鱼 Weever	0.5	1	0.44±0.02	87.3	4.1	3.4
  		2	0.46±0.03	92.4	6.5
  		3	0.43±0.04	86.0	9.3
  	1.0	1	0.96±0.07	96.2	7.3	2.6
  		2	0.93±0.06	93.2	6.4
  		3	0.98±0.06	98.1	6.1
  	3.0	1	2.98±0.07	99.3	2.3	1.0
  		2	2.92±0.11	97.5	3.8
  		3	2.95±0.12	98.4	4.1

• 1. [1]

     Alderman D J. J. Fish Dis., 1985, 8(3): 289-298

  2. [2]

     Alderman D J, Clifton-Hadley R S. J. Fish Dis., 1993, 16(4): 297-311

  3. [3]

     Culp S J, BelandFA. J. Am. Coll. Toxicol., 1996, 15(3): 219-238

  4. [4]

     Fessard V, Godard T, HuetS, Mourot A, Poul J M. J. Appl. Toxicol., 1999, 19(6): 421-430

  5. [5]

     Culp S J, Beland F A, Heflich R H, Benson R W, Blankenship L P, Webb P J, Trotter R W, Shelton S D, Greenlees K J, Manjanatha M G. Mutat. Res., 2002, 506-507: 55-63

  6. [6]

     Mittelstaedt R A, Mei N, Webb P J, Shaddock J G, Dobrovolsky V N, McGarrity L J, Morris S M, Chen T, Beland F A, Greenlees K J, Heflich R H. Mutat. Res., 2004, 561(1-2): 127-138

  7. [7]

     Commission Decision2004/25/EC, Off. J. Eur. Commun. L6, 2004: 38-39

  8. [8]

     Ministry of Agriculture Bulletin No. 193, 2002《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》, 中华人民共和国农业部公告193号, 2002

  9. [9]

     ZENG Yu-Mei, LU Jia-Ming, DONG Xin. Chin. J. Food Hyg., 2015, 27(1): 79-81曾玉梅, 卢嘉明, 董欣. 中国食品卫生杂志, 2015, 27(1): 79-81

  10. [10]

      Veterinary Residues Committee's Annual Report on surveillance for Veterinary Residues in Food in UK for 2001 to 2010. Available fromhttp://www.vmd.defra.gov.uk/vrc/Reports/annual.htm

  11. [11]

      Chu Y L, Chimeddulam D, Sheen L Y, Wu K Y. Food Chem. Toxicol., 2013, 62: 770-776

  12. [12]

      Xie J, Peng T, Chen D D, Zhang Q J, Wang G M, Wang X, Guo Q, Jiang F, Chen D, Deng J. J. Chromatogr. B, 2013, 913-914: 123-128

  13. [13]

      HU Jiang-Tao, YU Ling-Yun, YU Gang, SHUAI Pei-Qiang, ZHANG Ying, WU Meng-Ru, ZHANG Qin. China Measurement & Test, 2016, 42(4): 49-64胡江涛, 俞凌云, 于刚, 帅培强, 张莹, 吴孟茹, 张琴. 中国测试, 2016, 42(4): 49-64

  14. [14]

      Zhang Y Y, Yu W S, Pei L, Lai K Q, Rasco B, Huang Y Q. Food Chem., 2015, 169: 80-84

  15. [15]

      Schneider M J, Andersen W C. J. AOAC Int., 2015, 98(3): 658-670

  16. [16]

      ZHOU Yan, ZHAO Yong-Gang, ZHANG Bei-Bei, ZHANG Yong, CHEN Guo-Song. Chinese J. Anal Chem., 2014, 42(3): 367-374周岩, 赵永刚, 张蓓蓓, 章勇, 陈国松. 分析化学, 2014, 42(3): 367-374

  17. [17]

      Yang M C, Fang J M, Kuo T F. J. Agri. Food Chem., 2007, 55(22): 8851-8856

  18. [18]

      Oplatowska M, Connolly L, Stevenson P, Stead S, Elliott C T. Anal. Chim. Acta, 2011, 698(1-2): 51-60

  19. [19]

      Xing W W, He L, Yang H, Sun C J, Li D W, Yang X M, Li Y, Deng A P. J.Sci Food Agri., 2009, 89: 2165-2173

  20. [20]

      Lequin R M. Clin. Chem., 2005, 51(12): 2415-2418

  21. [21]

      LI Xiao-Li, CHEN Xue-Lan, LIU Chun-Mei, XIONG Yong-Hua. Food Sci., 2009, 30(24): 283-286李晓丽, 陈雪岚, 刘春梅, 熊勇华. 食品科学, 2009, 30(24): 283-286

  22. [22]

      LI Zhao-Hui, JIANG Pan-Pan, HE Ji-Guo. Food Sci., 2009, 30(13): 223-226李招慧, 姜盼盼, 何计国. 食品科学, 2009, 30(13): 223-226

  23. [23]

      Shen Y D, Deng X F, Xu Z L, Wang Y, Lei H T, Wang H, Yang J Y, Xiao Z L, Sun Y M. Anal. Chim. Acta, 2011, 707(1-2): 148-154

  24. [24]

      XIE Huan-Long, WANG Yu, XU Zhen-Lin, YANG Jin-Yi, XIAO Zhi-Li, WANG Hong, LEI Hong-Tao, SUN Yuan-Ming, SHEN Yu-Dong. Mod. Food Sci. Technol., 2015, 31(12): 325-330谢焕龙, 王宇, 徐振林, 杨金易, 肖治理, 王弘, 雷红涛, 孙远明, 沈玉栋. 现代食品科技, 2015, 31(12): 325-330

  25. [25]

      Burgstahler A W, Worden L R. Coumarone. Org. Synth. Coll., 1973, 5: 251; 1966, 46: 28

  26. [26]

      Cho B P, Yang T L, Blankenship L R, Moody J D, Churchwell M, Beland F A, Culp S J. Chem. Res. Toxicol., 2003, 16: 285-294

  27. [27]

      Langone J J, Vunakis H V. Methods Enzymol., 1982, 84: 628-640

  28. [28]

      Brenner A J, Harris E D. Anal. Biochem., 1995, 226(1): 80-84

  29. [29]

      Fedenko V S. Chem. Nat. Compd., 1989, 25(5): 590-592

  30. [30]

      WANG Yu, SHEN Yu-Dong, XU Zhen-Lin, LEI Hong-Tao, WANG Hong, SUN Yuan-Ming. Chinese J. Anal. Chem., 2010, 38(3): 313-317王宇, 沈玉栋, 徐振林, 雷红涛, 王弘, 孙远明. 分析化学, 2010, 38(3): 313-317

  31. [31]

      Köhler G, Milstein C. Nature, 1975, 256: 495-497

  32. [32]

      Gosling J P. Immunoassays A Practical Approach. America: Oxford University Press, 2000: 41

  33. [33]

      Wengatz I, Stoutamire D, Gee S J, Hammock B D. J. Agri. Food Chem., 1998, 46(6): 2211-2221

  34. [34]

      Liang C Z, Jin R Y, Gui W J, Zhu G N. Environ. Sci. Technol., 2007, 41(19): 6783-6788

  35. [35]

      Kim Y J, Cho Y A, Lee H S. Anal. Chim. Acta, 2003, 475(1-2): 85-96

  36. [36]

      CHENG Jian-Xin, CHEN Mei-Ying, ZHAO Hui-Jie. Immunology Technique in PlantScience. Beijing: China Agricultural University Press, 1998: 45陈新建, 陈梅英, 赵会杰. 免疫学技术在植物科学中的应用, 北京: 中国农业大学出版社, 1998: 45

  37. [37]

      SHEN Yu-Dong, WANG Yu, SUN Yuan-Ming, LEI Hong-Tao, WANG Hong, XIAO Zhi-Li. Food Sci., 2008, 29(7): 263-266沈玉栋, 王宇, 孙远明, 雷红涛, 王弘, 肖治理. 食品科学, 2008, 29(7): 263-266

  38. [38]

      Hennion M C, Barcelo D. Anal.Chim.Acta, 1998, 362(1): 33-34

• 

  Figure 1  The chemical structures of MG and its structural analogues

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  Figure 2  Mass spectrum (A) and H¹-NMR spectrum (B) of hapten MGH

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  Figure 3  UV-vis spectra of artificial antigen of MG

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  Figure 4  Effect on antiserum of BSA carrier-based immunogen with different coupling ratios

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  Figure 5  Effect on antiserum of OVA carrier-based immunogen with different coupling ratios

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  Figure 6  Standard curve for detection of malachite green by icELISA (n=3)

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  Table 1.  The coupling ratio of artificial antigen determined by UV-vis absorption spectroscopy

  抗原 Antigen	半抗原 Hapten	载体蛋白 Carrier protein	投料摩尔比 Molar ratio	半抗原浓度/半抗原分子量 Hapten concentration/ Hapten molecular weight (μg/mL)/Da	抗原蛋白浓度/蛋白分子量 Antigen concentration/ Protein molecular weight (mg/mL)/Da	偶联比 Coupling ratio
  A1	MGH	牛血清白蛋白 BSA	100:1	0.024/374	0.13/68000	34:1
  A2			50:1	0.063/443	0.37/68000	26:1
  A3			20:1	0.038/403	0.56/68000	12:1
  A4		卵清蛋白 OVA	50:1	0.052/403	0.34/45000	17:1
  A5			20:1	0.037/403	0.33/45000	13:1
  A6			10:1	0.041/403	0.64/45000	7:1

  下载: 导出CSV

  Table 2.  Cross-reactivity of monoclonal antibody against MG and its analogs by the icELISA

  交叉反应物 Competitive compound	结构式 Chemical structure	半抑制浓度 IC50(μg/L)	交叉反应率 Cross-reactivity (%)
  孔雀石绿 Malachite green，MG		0.96	100
  隐性孔雀石绿 Leuco-malachite green，LMG		2730	0.035
  隐性结晶紫 Leuco-crystal violet，LCV		2407	0.04
  结晶紫 Crystal violet，CV		5.29	18.1
  孔雀石绿carbinol malachite green carbinol，MGc		16.24	5.91
  副品红 Pararosoniline，PA		4431	2.17
  亚甲基蓝 Methylene blue，MB		138.58	6.92
  隐性灿烂绿 Leuco-brilliant green，LBG		>10000	＜0.01
  灿烂绿 Brilliant green，BG		3.62	26.5
  N,N-二甲基苯胺 N,N-Dimethylaniline		>10000	＜0.01
  N,N-二乙基苯胺 N,N-Diethylaniline		>10000	＜0.01
  苯甲醚 Anisole		>10000	＜0.01
  甲苯 Methylbenzene		>10000	＜0.01

  下载: 导出CSV

  Table 3.  Recoveries of fish sample fortified with MG by icELISA and HPLC-MS/MS method (n=3)

  样品 Sample	添加浓度 Added (μg/kg)	icELISA				HPLC-MS/MS
  		测量浓度 Measured value (μg/kg)	回收率 Recovery (%)	相对标准偏差 RSD (%)		测量浓度 Measured value (μg/kg)	回收率 Recovery (%)	相对标准偏差 RSD (%)
  多宝鱼 Turbot	0.0	0	－	－		0	－	－
  	0.5	0.51±0.03	101.9	5.0		0.49±0.02	98.1	4.1
  	1.0	0.94±0.06	93.6	2.6		0.96±0.05	95.6	5.2
  	3.0	3.07±0.12	102.2	3.9		2.88±0.07	96.0	2.4
  鲈鱼 Weever	0.0	0	－	－		0	－	－
  	0.5	0.44±0.02	87.3	4.1		0.46±0.03	92.0	6.5
  	1.0	0.96±0.07	96.2	7.0		0.93±0.04	93.1	4.3
  	3.0	2.98±0.07	99.3	2.3		2.91±0.07	97.2	2.4
  桂花鱼 Mandarin fish	0.0	0	－	－		0	－	－
  	0.5	0.46±0.02	91.4	3.2		0.47±0.03	94.0	6.4
  	1.0	0.94±0.06	93.6	2.6		0.97±0.05	96.7	5.2
  	3.0	3.07±0.12	102.2	3.9		2.95±0.08	98.3	2.7
  虾 Shrimp	0.0	0	－	－		0	－	－
  	0.5	0.47±0.04	94.3	8.1		0.48±0.03	96.0	6.2
  	1.0	1.07±0.06	107.3	5.8		0.97±0.05	97.1	5.7
  	3.0	2.94±0.07	98.1	2.5		2.96±0.07	98.7	2.4
  平均值 Average		97.3				96.1

  下载: 导出CSV

  Table 4.  Detection precision of malachite green spiked to weever sample by icELISA kit (n=3)

  样品 Sample	浓度 Added (μg/kg)	批次 Batch	测定值 Measured (μg/kg)	回收率 Recovery (%)	相对标准偏差 RSD(%)
  					批内 Intra-batch	批间 Inter-batch
  鲈鱼 Weever	0.5	1	0.44±0.02	87.3	4.1	3.4
  		2	0.46±0.03	92.4	6.5
  		3	0.43±0.04	86.0	9.3
  	1.0	1	0.96±0.07	96.2	7.3	2.6
  		2	0.93±0.06	93.2	6.4
  		3	0.98±0.06	98.1	6.1
  	3.0	1	2.98±0.07	99.3	2.3	1.0
  		2	2.92±0.11	97.5	3.8
  		3	2.95±0.12	98.4	4.1

  下载: 导出CSV
•