English

• 1.   引 言

  探索脑神经生理和病理的物质基础一直是多学科交叉的前沿研究领域,建立这些生理活性分子活体、实时、动态分析方法,将为脑神经生理和病理过程物质基础的研究奠定基础。电化学方法具有高灵敏度、低成本和易于微型化的特点^[1],且具有高的时空分辨,是原位实时探测脑内物质的重要分析方法。安培分析法是电分析化学中重要的分析方法之一,由于它可以连续实时检测在活体分析中备受青睐。然而,目前的检测通常是采用商用仪器,使用有线方式进行测量,这不仅会限制动物的自由活动,而且会对实验测量带来一定的噪音干扰^[2],测得的数据很难反映动物的真实状态^[3]。随着科学技术的发展,生物遥测技术已应用于自由活动动物的脑神经化学分析^[4]、活体内物质浓度^[5]以及生理信号监测^[6]等方面,比有线数据采集系统具有更大的优势和更多大的发展空间。到目前为止,生物遥测技术已实现了脑内多巴胺^[7]、抗坏血酸^[8]、葡萄糖、乳酸^[10]等物质的分析,然而,为了进一步减轻对动物的干扰,微型化和低功耗的生物遥测系统的研制仍然迫在眉睫。

  在本研究组的前期研究中,曾自主发展了基于遥测技术的电位型分析方法^[7]。为了进一步满足安培分析法的需求,本研究研制了一种结构简单、性能可靠以及价格低廉的遥测系统,结合在线电化学检测平台检测在脑缺血的情况下脑内抗坏血酸水平的变化,测试了遥测系统的性能。实验结果表明,遥测系统对三电极传感器施加的电位稳定性好、精确度高,且电流分辨率高,抗干扰能力强。

  2.   实验部分

  2.1.   仪器与试剂

  发送端微控制芯片ADuCM360(美国模拟器件公司),运算放大器AD8606(美国模拟器件公司),多路复用器ADG839(美国模拟器件公司),接收端微控制芯片STC11F02E(中国深圳宏晶科技有限公司)；无线数据传输芯片nRF24L01+(挪威Nordic公司),协议转换芯片CH340T(中国江苏沁恒股份有限公司)；电平转换芯片CAT6219-330TD-GT3(美国安森美半导体公司),表贴高精度电阻(0.1%),贴片电容和钽电容。

  人工脑脊液(aCSF)由NaCl(126 mmol/L)、KCl(2.4 mmol/L)、KH₂PO₄(0.5 mmol/L)、MgCl₂(0.85 mmol/L)、NaHCO₃(27.5 mmol/L)、Na₂SO₄(0.5 mmol/L)配制,pH 7.4；新配抗坏血酸盐溶液；单壁碳纳米管(SWNTs,平均直径< 2 nm,长度0.5～50 μm)；玻碳电极(上海辰华仪器有限公司)；微透析探针(透析长度：4 mm；直径：0.24 mm)；实验用超纯水(18.2 MΩ·cm)。

  2.2.   系统总体设计

  遥测系统结构如图 1所示,主要由数据采集发送端、接收端和计算机3个部分组成。计算机通过接收端以无线数据传输的方式向数据采集发送端发送指令,可以控制其工作状态。数据采集发送端采集三电极电化学传感器产生的电流响应信号,经过处理转换成电压信号,然后把电压信号转换为数字量,最后通过无线数据传输的方式把转换后的数字量发送给数据接收端。接收端收到信号后,进行协议转换,通过 USB 串口发送给计算机；计算机通过上位机软件对数字信号重新编码,将采集的电流通过图像和数值两种方式显示在屏幕上,并可以完成数据存储和传输等功能。

  图 1

  

  图 1  系统结构示意图(RE：参比电极；WE：工作电极；CE：对电极)

  Figure 1.  Schematic illustration of system (RE: Reference electrode ; WE: Working electrode; CE: Counter electrode)

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  2.3.   数据采集发送端硬件设计

  数据采集发送端硬件电路图如图 2所示,包括以下几个部分：(1)微处理器模块：控制数模转换器(DAC)产生预定电压,实现模数转换器(ADC)采样,控制无线模块的接收和发送；(2)恒电位电路：为电化学传感器提供一个恒定的工作电压；(3)电流检测模块：将电化学传感器反应产生的电流信号进行信号处理,然后送入ADC进行采集；(4)无线模块：实现无线数据传输的功能；(5)电源模块：为各个模块提供+3.3 V稳定电压。

  图 2

  

  图 2  数据采集发送端电路图

  Figure 2.  Circuit diagram of the transmitter unit

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  微控制器ADuCM360的内核为低功耗ARM Cortex-M3处理器,自带一个片内32 kHz振荡器和一个内部16 MHz高频振荡器。ADuCM360是完全集成的3.9kSPS、24位数据采集系统,在单芯片上集成了双核高性能多通道Σ-Δ型24位模数转换器(ADC),用来采集电压信号具有很小的量化误差,均可在全差分和单端模式下工作,可采用内部+1.2 V基准电压源作为模数转换基准。ADuCM360还提供了一个单通道带缓冲的电压输出DAC,其分辨率在正常模式下为12位,当采用内部基准电压1.2 V时,DAC输出范围为0～1.2 V。ADuCM360专为要求低功耗工作的电池供电应用而设计,可以直接通过程序控制配置为多种低功耗工作模式。

  恒电位电路是整个电化学分析系统的核心,主要将外部激励信号准确地施加于传感器上,同时测量工作电极产生的电流。微控制器控制DAC输出电压V_DAC,运放AD8606A构成电压跟随器,根据运算放大器的“虚短”特性,参比电极的电位与输出电压V_DAC相等,运放AD8606B将工作电极(WE)的电位钳制在0.5 V,电化学传感器的工作电位为

  1 \begin{document} $E=0.5-{{V}_{DAC}}$ \end{document}

  工作电极(WE)产生的电流I_WE经过电流检测电路中的反馈电阻转换成电压信号,根据运算放大器的“虚断”特性,输出电压V_out与电流的关系为

  2 \begin{document} ${{V}_{OUT}}=0.5-{{I}_{WE}}\cdot {{R}_{f}}$ \end{document}

  其中, R_f为反馈电阻。本遥测系统设计的电流检测范围为[-1 μA,1 μA],最小分辨率为0.2 nA,其电流范围可达4个数量级,为了精确测量各个数量级的电流,通过微控制器数字控制多路模拟开关转换到不同的反馈电阻实现增益的自动可调,微控制器的ADC为24位,分辨率比较高,可采用两个反馈电阻,反馈电阻均为0.1%的精密电阻,在反馈电阻上并联一个电容起到低通滤波的作用^[13],确定低通滤波的截止频率F_cut-off的值,再通过公式(3)可以计算出电容值C_F。在实际检测中,遥测系统的带宽为2 Hz,采样频率为5 Hz。

  3 \begin{document} ${{C}_{F}}=1\left( {{F}_{OUT-OFF}}2\pi {{R}_{f}} \right)$ \end{document}

  ADuCM360的封装为LFCSP,48个引脚,外形尺寸仅为7 mm×7 mm,且其内部集成了高精度的24位ADC和12位的DAC,这样使得原本设计中比较复杂的ADC电路和DAC电路得到了简化。为了进一步减小数据采集发送端的体积,采用了可工作在2.4 GHz频段的nRF24L01+芯片,经测试表明,10 m之内可以可靠地传输数据。在制作电路板时,为减小射频部分对电路干扰,将无线数据传输模块nRF24L01+放置在副板上,其余芯片放置在主板上。主板采用6层板设计,减小了电路板的面积,主印制电路板设计尺寸为24 mm × 13 mm × 1.6 mm。数据采集发送端所用电池容量80 mAh,电压标称值3.7 V。

  2.4.   数据接收端设计

  相比数据采集发送端,接收端的体积要求不严格,采用了文献^[10]的设计。微控制器采用的是STC11F02E芯片,无线数据传输芯片采用与发送端相同的nRF24L01+,数据采集发送端ADuCM360和接收端STC11F02E都可以通过程序控制各自的nRF24L01+实现自动高速切换收发模式,实现数据的接收和发送。微控制器STC11F02E读取nRF24L01+接收到数据,经过CH340T进行协议转换,通过USB直接与计算机连接,由上位机软件处理接受到数据,上位机软件还可以通过无线方式控制电化学传感器的工作电位。

  2.5.   软件设计

  系统软件部分包括数据采集发送端程序的编写和上位机软件两个部分。ADuCM360微处理器采用C语言编程,采集发送端程序采用模块化编程思想进行设计,主要包括接收上位机命令配置DAC产生电压、ADC采集经电流-电压转换后的电压数据以及数据无线发送。系统上位机软件采用LabVIEW(美国National Instruments公司)图形化编程语言,开发了一套用户界面直观友好、灵活性强,操作简便的电化学测试平台。上位机可以设置参数对下位机进行配置,通信需要通过驱动程序VISA实现,其中下位机的配置主要包括采样间隔、工作电位等参数。上位机软件通过算法将接受的数字量转换为相应的电流值,在计算机上实时显示电流-时间曲线,同时用户还可以设置存储路径保持数据,将数据以文本的方式保存,方便数据的后期处理。

  2.6.   实验方法

  2.6.2.   制备工作电极

  首先把玻碳电极在砂纸上抛光,然后经1和0.05 μm的Al₂O₃粉末抛光,最后在超纯水中超声10 min。将单壁碳纳米管分散在二甲基甲酰胺中,得到2 mg/mL的悬浊液,取4 μL悬浊液滴涂到玻碳电极的表面,在室温下干燥后,得到单壁碳纳米管修饰的玻碳工作电极,固定在薄层电化学流动池中,用来实时检测抗坏血酸。

  2.6.1.   电学性能测试

  采用图 3所示的方法进行电流测量,选用安捷伦B2912A作为高精度电压源V_Ideal,电压源分辨率为100 nA,通过一个阻值精确测量的电阻R_Ideal向工作电极提供输入电流。对不同的测量档位进行校准时,可根据高精度电压源V_Ideal的输出范围选择不同阻值的电阻R_Ideal。以最小电流测量档为例进行校准,精确电阻R_Ideal的阻值为100 MΩ,安捷伦B2912A高精度电压源V_Ideal的取值为-1～1 V,以0.1 V为步长,共计21个数据点,输入电流I_Ideal＝V_Ideal/R_Ideal。

  图 3

  

  图 3  电流测试电路图

  Figure 3.  Generation of testing current

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  2.6.3.   实验过程

  实验采用SD雄性大鼠(230 g),用水合氯醛(350 mg/kg)对其进行麻醉,然后将其固定在脑立体定位仪上进行手术。根据大鼠脑图谱将微透析导管植入SD雄性大鼠海马中(AP=-4.4 mm,L=-3.0 mm,V=2.5 mm),再将3个螺钉固定在颅骨上,最后用牙科水泥将螺钉和导管固定在大鼠颅骨上。在整个手术过程中,用加热垫使动物的体温维持在37℃。在微透析采样和双侧颈总动脉的缺血手术前,实验前SD大鼠要恢复至少24 h。在进行双侧颈总动脉缺血手术,将小鼠麻醉后仰卧于手术台上,颈部正中进行切口,分离暴露颈部血管,将双侧颈动脉结扎。 用在线电化学方法持续检测鼠脑细胞外抗坏血酸的变化,采用薄层电解池三电极体系,单壁碳纳米管修饰的玻碳电极修饰的碳纳米管电极作为工作电极,电解池出口的不锈钢管作为对电极,Ag/AgCl作为参比电极,工作电极电压为30 mV,灌注透析液为人工脑脊液。在整个实验过程中,电极的稳定性及对抗坏血酸的高选择性是实验数据可信的主要因素之一。前期的研究已经表明,利用碳纳米管对抗坏血酸的电化学催化作用所建立的抗坏血酸的在线电化学分析方法在脑缺血过程中有很好的稳定性和选择性,从而保证了实验数据的可靠性。

  3.   结果与讨论

  3.1.   遥测系统的性能

  遥测系统电学测试结果如图 4所示,遥测系统电流测量值与输入电流I_Ideal的线性方程为y=0.9999x+0.0042,相关系数R²=0.9999,在41组不同数值的对照测试中,遥测系统电流测量值与输入电流最大偏差为0.13 nA。

  图 4

  

  图 4  遥测系统电流测量值与输入电流I_ideal的相关性对比

  Figure 4.  Comparison of current measurement value of telemetry system and input current value I_ideal

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  3.2.   校准单壁碳纳米管修饰的薄层玻碳电极

  在进行SD雄性大鼠缺血模型之前需对单壁碳纳米管修饰的薄层玻碳电极进行校准,实验所用微量注射泵为CMA100,微透析管的进液端与微量泵相连,出液端与玻碳电极相连,将50、100、200和300 μmol/L的抗坏血酸溶液由微量注射器经微透析管路以3 μL/min的速度泵进薄层电解池内,通过遥测系统测出各自的电流响应。图 5为接收端得到的抗坏血酸浓度变化时的电流响应曲线。图 6给出了抗坏血酸浓度与电流的校准曲线,工作电极抗坏血酸的电流响应与其浓度呈良好的线性关系,线性方程为I(nA)=2.98C_AA(μmol/L)－137.39,线性相关系数R²=0.984。

  图 5

  

  图 5  工作电位30 mV下,抗坏血酸浓度变化时的电流响应曲线

  Figure 5.  Current response curve of ascorbic acid with different concentrations

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  图 6

  

  图 6  抗坏血酸浓度与电流校准曲线

  Figure 6.  Calibration curve between ascorbic acid concentration and current

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  3.3.   活体在线检测脑缺血过程中抗坏血酸的变化

  如图 7所示,利用本系统可以实现在线实时的检测缺血过程中抗坏血酸浓度的变化。根据图 6的校准曲线计算得到抗坏血酸基线水平的浓度为51.78 μmol/L,在双侧颈动脉缺血40 min后,抗坏血酸浓度开始升高,60 min后抗坏血酸浓度达到61.44 μmol/L。在缺血100 min后,抗坏血酸浓度开始下降,20 min后抗坏血酸浓度降到44.26 μmol/L,这与本研究前期用商品化仪器检测到的结果一致^[14],充分说明本系统在活体动物实验中的适用性。

  图 7

  

  图 7  抗坏血酸测量的电流响应

  Figure 7.  Typical current-time responses recorded of ascorbic acid

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  4.   结 论

  设计了一种可用于三电极电化学传感器便携式遥测系统,采用高集成度单芯片ADuCM360为微处理器,大大提高了电路板模块的集成度,采用可充电锂离子电池供电,具有体积小、功耗低、便携性好等优点,其应用前景十分广泛。应用遥测系统进行活体在线检测脑缺血过程中抗坏血酸的变化,说明本系统可用于缺血模型中脑内生理物质的无线检测。本研究为发展低功耗高性能的无线遥测系统提供了新的思路。

• 1. [1]

     Cheng H J, Wang X Y, Wei H. Anal. Chem., 2015, 87(1): 8889-8895

  2. [2]

     Kagohashi M, Nakazato T, Yoshimi K, Moizumi S, Hattori N, Kitazawa S. Neurosci. Res., 2008, 60(1): 120-127

  3. [3]

     Fenton A A, Muller R U. J. Neurosci. Methods. , 1996, 70(2): 211-227

  4. [4]

     LIN Nan-Sen, WANG Li, WANG Mi-Xia, XU Sheng-Wei, YU Wei-Dong, CAI Xin-Xia. Chinese J. Anal. Chem., 2015, 43(1): 93-97林楠森, 王力, 王蜜霞, 徐声伟, 禹卫东, 蔡新霞. 分析化学, 2015, 43(1): 93-97

  5. [5]

     Rocchitta G, Secchi O, Alvau M D, Migheli R, Calia G, Bazzu G, Farina D, Desole M S, O'Neill R D, Serra P A. Anal. Chem., 2012, 84(16): 7072-7079

  6. [6]

     Valdastri P, Rossi S, Menciassi A, Lionetti V, Bernini F, Recchia F A, Dario, P. Sen. Actuators A, 2008, 142(1): 369-378

  7. [7]

     Michael A C, Borland L M. Electrochemical Methods for Neuroscience. Boca Raton F L: CRC Press, 2006: 544

  8. [8]

     Rocchitta G, Secchi O, Alvau M D, Farina D, Bazzu G, Calia G, Migheli R, Desole MS, O'Neill RD, Serra P A. Anal. Chem., 2013, 85(21) : 10282-10288

  9. [9]

     Calia G, Rocchitta G, Migheli R, Puggioni G, Spissu Y, Bazzu G, Mazzarello V, Lowry J P, O'Neill R D, Desole M S, Serra P A. Sensors, 2009, 9(4) : 2511-2523

  10. [10]

      Guiseppi-Elie A. Anal. Bioanal. Chem., 2011, 399(1) : 403-441

  11. [11]

      QIN Tai-Chun, LI Xiao-Gang, HAO Jie, YU Ping, MAO Lan-Qun. Chinese J. Anal. Chem., 2015, 43(3):457-462秦泰春, 李晓钢, 郝洁, 于萍, 毛兰群. 分析化学, 2015, 43(3): 457-462

  12. [12]

      ADuCM360/ADuCM361 Data sheet (Rev A).2012, http:www.analog.com

  13. [13]

      Serra P A, Rocchitta G, Bazzu G, Manca A, Puggioni G M, Lowry J P, O'Neill R D. Sens. Actuators, B, 2007, 122(1): 118-126

  14. [14]

      Liu K, Yu P, Lin Y, Wang Y, Ohsaka T, Mao L. Anal. Chem., 2013, 85(23): 9947-9954

• 

  Figure 1  Schematic illustration of system (RE: Reference electrode ; WE: Working electrode; CE: Counter electrode)

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  Figure 2  Circuit diagram of the transmitter unit

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  Figure 3  Generation of testing current

  WE： 工作电极(Working electrode)； V_ideal： B2912A电压值(Potential)； R_ideal： 电阻值(Resistance)。

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  Figure 4  Comparison of current measurement value of telemetry system and input current value I_ideal

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  Figure 5  Current response curve of ascorbic acid with different concentrations

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  Figure 6  Calibration curve between ascorbic acid concentration and current

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  Figure 7  Typical current-time responses recorded of ascorbic acid

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
•