English

• 1.   引 言

  酶能够催化多种生理生化反应，是维持机体正常运转不可或缺的重要因素。尽管对酶的研究由来已久，但是人们一直持有疑问：酶在催化时如何动态变化？同种酶的不同个体之间是否存有差异？酶与底物如何相互作用？采用传统的测定方法很难回答这些问题，因为传统方法只能测定溶液中无数个酶分子的平均值，是一个共性的表达，故而不能够反映单个酶分子的个性。20世纪90年代，科研人员开始尝试在室温条件下进行单分子成像等技术的研究^[1~7]，此后不断发展完善的监测方法、成像技术以及单分子操纵手段等最终为室温条件下在单分子尺度上探索酶的功能提供了条件。基于荧光显微镜的单分子酶学研究可观测到单个酶在催化时的动态波动，因而可以从更深层次上挖掘酶的功能信息。近年来的单分子酶学的研究证实了在催化过程中酶自身结构是动态变化的。这就提出了一个新的问题，为什么酶结构会波动变化？众所周知，酶是由氨基酸链构成的，而氨基酸链必须折叠成特定的构象才能够发挥酶的正常功能。然而在热运动情况下，酶为了维持特定的构象就必定会造成氨基酸链的波动^[8]，而氨基酸链的波动也必定诱导酶的构象在一定程度上发生波动变化。这就解释了为什么酶会有不同的构象，并且每种构象都具有特定的活性。同时，酶的能级相图(Energy landscape)决定了酶热力学和动力学上可达到构象的个数、不同构象之间的比例以及构象之间相互转换的速率，酶可能在同一构象中翻转多次后才会向着在催化活性较低的构象改变，这就是酶在催化过程中产生记忆效应的原因。

  利用荧光显微镜在单分子尺度上对某种酶的催化反应进行监测已成为一个重要的研究方向。通用的策略是首先通过某种方式将酶分子疏松地固定在界面上，然后加入反应溶液，利用荧光显微镜实时记录酶催化过程中所产生的某种荧光信号的变化，最后提取单个酶催化的荧光强度随时间变化的轨迹并进行数学分析，得出酶催化时的动态过程。采用此方法研究酶的催化时需要长时间测定荧光状态的变化，由于受到测定方法的限制，因而选择研究体系时可从以下几方面入手：(1)酶自身荧光活性状态在催化过程中能够发生改变；(2)酶可以催化无荧光的底物生成荧光产物；(3)底物易于标记荧光，酶在催化底物后生成荧光状态不同的产物；(4)酶自身或酶与底物标定FRET对，研究酶与底物的相互作用；(5)酶在催化反应前后受构象影响导致荧光强度变化巨大。单分子荧光显微镜可同时独立记录多个酶分子催化过程中荧光信号变化，通过统计学分析建立数学模型，可以得到单个酶分子在催化过程中的动态波动，为人们深入理解某个特定的催化体系提供具有统计学意义的理论支持。本文对蛋白质酶以及核酸酶的单分子研究进展进行了简单概述，以期加深读者对单分子酶学领域的理解。

  2.   单分子酶学研究进展

  2.1.   单分子蛋白质酶研究进展

  利用X-射线晶体衍射等物理方法，人们能够高效解析酶的结构。尽管越来越多的酶的结构被解析出来，人们却一直抱有疑问：在催化过程中，酶究竟是如何工作的？它的功能与结构究竟有着怎样的关系？而在1998年，Xie课题组^[9]报道了单分子水平上对胆固醇氧化酶(Cholesterol oxidase,COx)催化的研究后，这个谜题被揭开了一角。胆固醇氧化酶活性中心包含一个黄素腺嘌呤二核苷酸基团(Flavin adenine dinucleotide,FAD)，其氧化形式可以自发荧光,而其还原形式不具有荧光活性。在胆固醇氧化酶催化底物生成产物的过程中，活性中心的FAD基团被还原成还原型黄素腺嘌呤二核苷酸(Reduced flavin adenine dinucleotide，FADH₂)，而后被氧气重新氧化生成FAD进行新一轮的反应(图 1A)。他们利用荧光显微镜对单个胆固醇氧化酶催化过程中荧光强度的变化进行实时采集 (图 1B)，发现荧光强度随时间呈现上升-下降(On-off)的波动，而每一个On-off代表着一个完整催化循环(Turnover)。作者将整个催化过程分为两个部分,以利于对一系列的On-time与off-time进行数学分析。为了验证不同酶分子之间催化是否存在差异，还利用胆固醇类似物替代胆固醇，使产物生成成为反应的限速步骤。结果如图 1C所示，On-time的分布呈现单指数递减的特征，并且多个酶分子的催化速率常数呈现很宽的分布。这一结果证实了酶在催化中具有静态异相性(Static disorder)^[10]，即不同酶分子之间的催化速率是不相同的。在传统的分析测定中，酶的催化反应被认为是一个Markovian的过程，酶催化的相邻反应之间没有相互影响,且其催化反应速率不变。然而，他们发现相邻On-time对之间具有记忆效应 (图 1D)。同时利用自相关方程(r)对其进行定量分析(图 1E)，发现r(m)呈现指数递减，证实了酶在催化过程中的速率常数呈现缓慢波动，因而从单分子角度上讲，酶并没有一个特定的催化速率常数。作者认为产生这种现象的原因是酶在催化反应中的构象发生了变化，即酶具有动态异相性(Dynamic disorder)。后续研究中，该课题组利用电子转移作为响应距离变化的探针，进一步验证了单个酶在催化过程中的构象波动变化是普遍存在的现象^[11]。在整体平均水平的测定中，这种现象是难以发觉的，而单分子实验使得酶构象的波动以一种可分析的速率波动的形式展示出来。该方法为研究不同酶的各种催化过程奠定了基础。

  图 1

  

  图 1  (A) 胆固醇氧化酶(Cholesterol oxidase,COx)催化底物生成产物，其活性中心的黄素腺嘌呤二核苷酸基团(Flavin adenine dinucleotide,FAD)被还原成为还原型黄素腺嘌呤二核苷酸(Reduced flavin adenine dinucleotide,FADH₂)，随后又被氧气氧化为FAD，并伴随着荧光状态的改变。(B) 单个胆固醇氧化酶分子在催化反应中荧光强度随时间的变化轨迹。(C) 单个胆固醇氧化酶的On-times呈现指数递减的分布。(D) 相邻及距离10个turnover的On-time对的概率密度分布，相邻的turnover对之间呈现记忆效应。(E)单个胆固醇氧化酶On-times的自相关分析证实了酶构象的缓慢波动。(F)酶催化反应过程中构象波动的简单模型。图 1已得到文献^[9]许可转载，版权1998 美国科学促进会。

  Figure 1.  (A) Scheme of cholesterol oxidase (COx) catalysis. When COx catalyzing its substrate to generate product,the flavin adenine dinucleotide (FAD) containing in active site is reduced to the reduced flavin adenine dinucleotide,FADH2,then re-oxidized by O₂,corresponding changes of its fluorescent state. (B) Single molecule COx fluorescence emission intensity changes with time. (C) On-time distribution of single COx with 2 mmol/L substrate. (D) The 2D conditional probability distribution of On-time separated by certain numbers of turnovers. (E) The autocorrelation analysis of On-time. (F) Proposed simple model of enzyme catalysis.Fig. 1 was reproduced with permission from Ref ^[9],Copyright 1998 The American Association for the Advancement of Science.

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  研究单分子蛋白酶学体系时，还包括能够催化无荧光底物(或荧光底物)生成荧光产物(无荧光产物)的酶分子体系。与COx这类酶分子不同，这种酶的本身并不具有荧光活性，其荧光的信号完全来自于产物或底物，每一次荧光强度的变化都代表着一个底物分子被催化生成产物。尽管这两种酶的荧光变化来源具有一定差异，但其荧光变化都代表了酶与底物或者产物的相互作用，因而可以利用类似的单分子手段进行研究。以辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)为例(图 2A)，1999年Edman等^[12]将生物素(Biotin)化的HRP固定在链酶亲和素(Streptavidin)修饰的玻片上，利用荧光显微镜并结合荧光相关光谱对单个HRP催化Dihydrorhodamine 6G生成荧光产物的反应进行了研究。与胆固醇氧化酶类似，他们发现单个HRP在催化过程中活性也呈现波动变化，并认为在一定时间范围内热力学波动导致酶的构象发生变化，进而影响了酶的活性。Lu课题组^[13]采用马来酰亚胺活化的HRP固定在巯基硅烷化的玻片表面，并在荧光显微镜的基础上增加了荧光各向异性以及寿命分析(图 2B)，利用HRP催化生成荧光产物的反应，进一步研究酶催化单个Turnover时的构象变化。作者发现在产物从活性中心释放过程中，HRP构象也在松散与紧缩的状态之间相互改变。80%的产物直接在HRP松散的活性中心释放，而另外近20%的产物伴随着HRP构象的缩紧从HRP的活性位点离开。Lu课题组^[14]利用自主搭建的全内反射-磁镊成像系统，构建了一种调控酶构象及活性的研究方案。其实验原理如图 2C所示，他们将HRP一端与玻璃表面连接，另一端与磁珠相连，通过调控力的大小以影响HRP的构象，并且通过监测HRP催化Amplex red生成荧光产物的反应以得到酶活性变化的动态信息。作者发现在外力的作用下，尽管酶的构象发生变性，其活性仍有所保留。酶的构象是波动变化的，外力的干预并不能改变酶的这一特性，因此尽管外力导致酶变性，构象的波动仍可以导致酶在某一时刻内重新回到易于与底物结合的构象，这意味着，底物与酶的结合促使部分未折叠或变性的酶重新折叠成具有活性的天然构象，进而发生催化反应。

  图 2

  

  图 2  (A) 辣根过氧化物酶 (horseradish peroxidase,HRP) 活性波动研究：a，HRP固定方案；b，单个HRP催化产物生成荧光强度变化相关性分析；(B) HRP催化产物分子释放的研究：a，HRP固定方案；b，单个HRP催化底物Amplex Red生成产物的荧光寿命、各向异性及荧光强度的相关性分析。c) 两种产物释放的理论模型。(C) 利用磁镊荧光显微镜观测并调控单个HRP的构象： a，实验设计方案；b，外力作用下HRP活性发生改变；c，外力作用导致酶构象发生变化的原理模型。

  Figure 2.  (A) Scheme for study of horseradish peroxidase (HRP) activity fluctuation： a,immobilization scheme of HRP；b,correlation analysis of fluorescence intensity changes of single HRP catalysis； (B) Product release process study of HRP： a,scheme for immobilization of HRP; b,Correlation plots of the lifetime,anisotropy,and intensity on single HRP-catalyzed Amplex Red fluorogenic assay; c,Theory model of two kinds of product releasing processes; (C) Conformational manipulation of HRP through single molecule magnetic microscopy: a,the conceptual scheme of the experimental system; b,the catalytic rates changes under external force; c,conceptual scheme of conformational fluctuation of single enzyme protein when being deformed by external force. Fig. 2(A) was reproduced with permission from Ref ^[12],copyright 1999 Elsevier Limited. Fig. 2(B) was reproduced with permission from Ref ^[13],copyright 2014 American Chemical Society. Fig. 2(C) was reproduced with permission from Ref ^[14],copyright 2015 National Academy of Sciences.

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  然而，对酶进行修饰及固定必然会影响酶自身的状态及活性，人为地造成催化的静态异相性。为了保持酶的天然活性状态，人们使用微小的纳米容器包裹单个酶分子进行单分子酶学研究。仍旧以HRP为例，Cornelissen课题组^[15]于2007年提出利用病毒衣壳包裹HRP，实现天然状态的酶在一个局限的空间尺度上的单分子研究。如图 3A所示，溶液中的底物可以通过衣壳上的小孔进入内腔，随后被HRP催化生成荧光产物。作者发现这个过程可以用一个简单的扩散模型进行拟合，然而该工作并未对HRP催化机理进行深入探索。2010年Walt课题组^[16]利用玻璃纤维束排列而成的阵列作为反应室包裹单个HRP，通过单分子实验对HRP催化机制进行深入探讨(图 3B)。作者发现单个HRP在被包裹于局限的小室内后，其催化反应速率与整体测定相比下降了10倍。作者认为HRP在催化Amplex red过程中首先经两步反应生成了两个自由基，两个自由基经过不依赖于酶的歧化反应最终生成产物。而当HRP固定在小室后，自由基与室壁碰撞产生消耗，因而造成催化速率的下降。2012年Haran课题组^[17]提出用磷脂膜包裹HRP进行单分子实验。如图 3C所示，由于磷脂不带电，而HRP催化Amplex red生成的产物带有电荷，因而不能透过磷脂膜流出。产物在磷脂膜内不断累积导致了一个有趣的现象，即当产物累积达到一定浓度时会抑制酶的活性。随后溶液中和单分子的实验表明产物是酶的非竞争性抑制剂，并且酶催化反应的初始速率与酶达到完全抑制所需要的产物的个数呈现很宽的分布,并且具有相关性动态变化，该工作证实了HRP的活性位点与别构位点是同步波动的。但是由于产物无法从磷脂膜中流出，他们无法对单个HRP催化单个Turnover的行为进行探索。当然，不仅局限于HRP，一些同样能够催化生成稳定荧光产物的酶也采用类似的方法进行单分子研究，如乳酸脱氢酶^{[10, 18]}、碱式磷酸酶^{[19, 20]}、β-半乳糖苷酶等^[21]。

  图 3

  

  图 3  (A) 病毒衣壳包裹单个HRP催化研究：a,底物进入病毒衣壳后被HRP催化生成产物;b,HRP催化反应的自相关分析。(B) HRP催化自由基歧化理论的研究：a,HRP被固定在纳米光纤排布的阵列中，催化Amplex Red生成荧光产物;b,单分子水平上HRP催化反应的速率;c,溶液总体水平上HRP催化反应的速率。 (C) HRP催化过程中产物别构抑制的研究：a，HRP被固定在脂质体中，催化Amplex Red生成产物;b,单个脂质体中HRP催化底物生成的荧光强度随时间的变化曲线; c,非竞争性抑制模型，以及酶催化反应的初始速率与酶达到完全抑制所需要的产物的个数的相关性方程。

  Figure 3.  (A) A virus-based study of HRP catalysis: a,experiment scheme for HRP capsuled in virus capsid,substrates diffuse into the cavity of the virus capsid,and are catalyzed by HRP; b,autocorrelation analysis of HRP catalysis. (B) Study of HRP catalysis revealing a two-step radical dismutation reaction mechanism: a,scheme for glass optical fiber bundle confined single HRP catalysis study; b,averaged catalysis turnover rate for single HRP detection; c,averaged catalysis turnover rate in bulk measurement. (C) Allosteric inhibition study of product generated by HRP: a,scheme for HRP trapped by liposome; b,a typical time trace of fluorescence intensity from HRP catalyzing product formation inside single liposome vesicle as a function of time; c,simple model for noncompetition inhibition and the correlation function between initial reaction rate of individual HRP and the number of product molecules needed for completely inhibition.Fig. 3(A) was reproduced with permission from Ref ^[15],copyright 2007 Nature Publishing Group. Fig. 3(B) was reproduced with permission from Ref ^[16],copyright 2010 American Chemical Society. Fig. 3(C) was reproduced with permission from Ref ^[17],copyright 2012 National Academy of Sciences.

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  此外，对底物进行荧光标记，利用酶催化底物前后荧光强度的变化同样是常用的进行单分子研究的方法。Iversen等将鸟苷三磷酸酶Ras固定在磷脂膜上，研究了其被Son of Sevenless(SOS)别构激活的过程^[22]。实验原理如图 4A所示，单个SOS酶分子标记atto-647，而Ras携带atto-488标记GTP被固定在磷脂双分子层上，单个SOS催化GTP水解激活Ras蛋白，产生的GDP随之释放，而溶液中未标记荧光的GTP重新与Ras结合，因此随着催化的进行，可明显看到atto-488荧光逐渐减少。他们发现SOS的催化速率呈现很宽的分布，即酶在多种构象中随机波动。此篇文章的一个重要发现是Ras-GTP调控着SOS波动变化为高活性的状态，这说明小部分的酶分子速率的动态波动能够影响整体的功能。Krischner课题组^[23]将荧光标记的底物固定在界面上，同时对后期促进复合体(Anaphase-promoting complex，APC)及泛素标记不同的荧光，研究了泛素与APC-底物的作用过程(图 4B)。他们发现APC介导的底物泛素化包括一个快速对单个底物标记多个泛素的过程，这增加了随后反应中底物与APC结合的亲和力。作者推测这些正反馈促使包含了短的识别区域的底物在复杂细胞内环境中具有很高的特异性。Krischner课题组^[24]进一步研究了蛋白酶体识别底物的过程(图 4C)。作者将蛋白酶体固定在玻片表面，并构建了不同构象的泛素链并与底物相连(其中每一个泛素上都标记荧光分子)，蛋白酶体催化底物降解是可观测到玻片表面产生明显的荧光亮点，而底物被完全降解后，荧光亮点消失。作者发现底物泛素化的程度影响蛋白酶体与底物的相互作用，而链状的泛素结构能够影响底物进入蛋白酶体通道的过程，这两个因素在很大程度上决定了蛋白酶体对底物的降解。

  图 4

  

  图 4  (A) Son of Sevenless (SOS)激活Ras蛋白研究：a，带有荧光标记的GTP的Ras被固定在界面上，被SOS水解，荧光GDP随之被释放;b,随着SOS催化Ras激活的进行，GTP被逐渐消耗，荧光强度逐渐下降。(B) 后期促进复合体 (APC) 识别底物研究：a，荧光标记的底物固定在界面上，同时对泛素及APC标记不同的荧光，利用荧光显微镜观测APC与底物相互作用; b,底物泛素化增强APC与底物的亲和性。(C) 蛋白酶体对底物降解的研究：a,构建不同构象的泛素链标记的底物。b,单分子研究策略，蛋白酶体被固定在界面上，降解不同结构泛素标记的底物。

  Figure 4.  (A) Ras activation by Son of Sevenless: a,ras loaded with fluorescent labeled GTP is trapped on to supported bilayer,after catalyzed by SOS,the resulted fluorescent GDP is released to solution. (B) Specific interaction of anaphase-promoting complex (APC) and substrate: a,fluorescent labeled substrate is fixed onto the interface,meanwhile ubiquitin and APC are also fluorescently labeled,and the interaction of APC and substrate are monitored by fluorescence microscopy; b,processive affinity amplification enhances the specificity of APC. (C) Substrate degradation by the proteasome: a,construction of substrate with different ubiquitin configurations; b,single molecule study strategy,the proteasome is trapped on the coverslips,the substrate is conjugated with different ubiquitin conformers,and when the substrate interacting with proteasome,fluorescent spot could be recorded.(A) was reproduced with permission from Ref ^[22],copyright 2014The American Association for the Advancement of Science. (B) was reproduced with permission from Ref ^[23],copyright 2015 The American Association for the Advancement of Science. (C) was reproduced with permission from Ref ^[24],copyright 2015The American Association for the Advancement of Science.

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  对于不同的酶而言，尽管其催化机制可能不同，但相同的一点是酶的构象在催化过程具有波动变化。然而在包含有无数个酶分子的溶液中，单个酶的活性及动力学波动并不十分重要，因而在溶液总体测定中，平均值就足以代表酶的特征。而在细胞内，可能一种酶只含有一个或几个拷贝，此时波动就会产生随机性的结果。同时，大多数的单分子酶学实验都是在控制底物不变的非平衡态下的进行的，而在活细胞中单分子才是常见的现象，胞外与胞内环境有显著差距，因此研究活细胞内单分子酶在真实拥挤环境下的动力学行为更能够反映酶催化的真实信息。

  2.2.   单分子核酸酶研究进展

  虽然大多数的酶是蛋白质酶，但少数RNA也具有催化功能，并在基因剪切、翻译等一系列的生物进程中起着至关重要的作用。对于不依赖于蛋白的核酶(Ribozyme)而言，由于其催化活性直接取决与其天然结构，因而被认为是研究酶分子结构与功能相互关系的理想简化模型系统。核酶的研究由来已久，2000年Zhuang等^[25]利用单分子荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)探讨了Tetrahymena 核酶的催化与结构的折叠。如图 5A所示，Zhuang等^[25]利用一条同时标定Cy5与Biotin的固定链与核酶延伸链杂交，从而将核酶固定在Streptavidin修饰的基底表面。作者同时对底物标记Cy3，当核酶与底物相互作用，Cy3-Cy5可以产生FRET效应，并且其效率直接反应了供体-受体间距的变化。作者首先测定出固定在界面的核酶其催化效率与溶液中的未经修饰及固定的核酸酶并没有区别，说明了固定及修饰并不会影响核酶的正常折叠与催化活性。随后作者发现核酶与底物形成的双螺旋P1可以可逆地停留在核酸酶的活性中心上，这就提出了一个疑问：是否在这种可逆转化的过程中P1与活性中心形成三级结构？由于之前有文献报道P1停留在活性中心时，其上的U-3上的羟基基团可与核酶形成三级接触^{[26, 27]}，作者用甲氧基替换羟基，验证了P1与核酶的三级接触发生在其停留在核酶的活性中心之后。随后作者发现核酶折叠成天然状态至少需要3种途径，并且每种途径都需要至少一个决速的过渡态。而在其中一条途径中，核酶需要结合底物而进行快速的折叠，这是以往所没有观测到的新现象,同时，该工作所建立的单分子荧光方法为研究核酶的构象与催化打下了坚实的基础。2002年Zhuang等同样利用单分子FRET进一步研究了核酶动力学与功能的相互关系^[28]。如图 5B所示，作者发现结构最简单的发夹结构核酶在与底物作用时也具有复杂的结构变化。当底物处于核酶活性中心位置时，二者能够形成了4种具有不同稳定性的活性状态。有趣的是，类似于酶催化具有的记忆效应，当核酶处于某种状态时，在一段时间内很难向其它活性状态改变。而核酶在对底物进行切割时伴随着多种构象之间可逆的相互转换，这说明了即使是结构最简单的发夹核酶，其催化过程也十分复杂。并且类似于蛋白酶，在核酶中也普遍存在异相催化的现象。随后Rueda研究了修饰对核酶催化的影响^[29]。作者对距离活性位点不同间距的核苷酸分别进行修饰，与未经修饰的核酶相比，不同位点修饰后的核酶与底物相互作用的动力学呈现异相性变化(图 5C)，并且对底物进行切割的速率也受其影响呈现出很大的差别，这说明末端修饰对核酶的催化产生了影响。作者认为耦合分子运动所形成的网络将核酶活性位点与其距离较远的位点联系起来，这同样说明核酶也具有类似于蛋白酶类的功能。这是非常有趣的现象，为核酶的研究打开了新的思路。随着研究的深入，人们开始在体外模拟细胞内环境以此来研究拥挤环境对核酶的催化动力学的影响。如图 5D，Paudel等^[30]利用聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)作为分子内拥挤试剂发现随着PEG浓度的增加，PEG促使核酶减少了其他的异相构象，而向着更为紧凑的构象转化。并且PEG的存在促使Mg²⁺诱导的核酶折叠减少，同时增加了核酶切割底物的活性，减少了异相的催化反应。从某种意义上，这说明了在细胞内的环境中，核酶也可以适应条件的变化进而更好地行使自己的功能。

  图 5

  

  图 5  (A) 核酸酶催化及折叠的单分子研究：(a) 核酸酶的结构及实验方案。(b) P1与活性中心作用的模型。(c) 核酸酶折叠成天然构象的时间图谱。(B) 核酸酶结构动力学与功能相关性研究：(a) 单分子与溶液总体水平下酶活性的测定。(b) 数据拟合底物与核酸酶作用存在四种活性状态。(c) 活性状态具有记忆效应。(C) 不同距离修饰对核酸酶催化影响的研究：(a) 未修饰及修饰后的核酸酶与底物作用的荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)曲线。(b) 未修饰与修饰后的核酸酶实验与理论的模拟。(D) 拥挤试剂对核酸酶催化的影响研究：(a)PEG促使核酸酶向活性状态转变。(b) PEG降低了Mg²⁺诱导的核酸酶折叠。c) 聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)加速了核酸酶的催化切割活性，降低了异相反应。

  Figure 5.  (A) Single-molecule study of ribozyme catalysis and folding:a,structural model of ribozyme and experimental scheme;b,the model of P1 interaction with the active center of ribozyme; c,time histogram of folding into native structure. (B) Study of structural dynamics and function: a,single-molecule and bulk solution measurements of enzymatic activities; b,the undocking kinetics is complex,suggesting four docked states of distinct stabilities. c,Docked states have a strong memory effect. (C) Study of modification showing impacts on catalysis: a,exemplary single-molecule FRET time trajectories of the major subpopulations of the WT and variant hairpin ribozyme-noncleavable substrate analog complexes;b,experimental and simulated cleavage time courses of WT and variant ribozymes. (D) Molecular crowding Accelerates Ribozyme Docking and Catalysis: a,PEG stabilizes the docked conformation of the hairpin ribozyme; b,PEG helps the ribozyme fold in near physiological conditions; c,PEG accelerates ribozyme cleavage.(A) was reproduced with permission from Ref ^[25],copyright 2000,The American Association for the Advancement of Science. (B) was reproduced with permission from Ref ^[28],copyright 2002,The American Association for the Advancement of Science. (C) was reproduced with permission from Ref ^[29],copyrights 2004,National Academy of Sciences. (D) was reproduced with permission from Ref ^[30],copyright 2014 American Chemical Society.

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  核酶催化的研究仍主要集中在探讨其结构与功能相互关系的阶段。由于核酶标记较为简单，并且其催化活性的改变直接反应了酶构象的变化，因而采用单分子FRET能够直接测定核酶与底物的相互作用，是进行单分子核酶催化研究的常用方法。同样，对于核酶的研究，也逐渐向更接近细胞内环境的方向发展。而现有的结果表明，核酶存在与蛋白质酶类似的功能，它在催化过程中具有多种构象，多种构象间可以相互转化，有类似于蛋白酶催化的记忆效应，可以形成分子运动的网络将核酶的活性中心与距离远处的核苷酸联系起来，并且也可适应复杂的生物环境,从而行使更为优化的功能。

  3.   单分子酶学研究展望

  体外的单分子酶学研究已经取得了引人瞩目的成就，然而作为一个新兴领域，仍有许多方向值得探索：(1) 单分子酶学现阶段的大部分实验是在胞外环境进行的，然而在细胞内研究酶的功能更有意义，而在细胞内存在大量自由基等各种物质的拥挤条件下，采用何种方法特异性识别待研究酶，如何追踪其荧光变化，并保证其检测过程中荧光不被淬灭，数据如何分析处理等这一系列的问题都需要摸索。(2) 在体外实验中，对酶的催化进行实时追踪时，由于仪器分辨率的限制可能导致一些现象被忽视，因而需要探索如何将超分辨等多种光学成像方法及分析手段的组合运用，提高监测的时间及空间分辨率，深入挖掘酶催化过程中隐藏的潜在信息。(3) 现阶段的单分子研究主要是基于荧光显微镜进行的，而许多在生物进程中具有重要功能的酶在催化时自身没有荧光变化，并且没有合适的荧光探针或者可生成荧光产物的底物，这在某种程度上局限了单分子酶学的研究，因此需要开发新的不依赖于荧光的单分子酶学研究方法或者制备通用的荧光探针或者荧光标记方法。(4)现阶段单分子酶学研究主要集中在基础研究及酶学机理的提出，而在研究中所开发出的新方法与技术以及得到的新的理论不应该仅局限于这单一领域，如何将这些技术方法以及理论应用于其它领域或者指导实际应用更值得深入思考。单分子酶学领域迅速发展，现阶段单分子酶学已经提出了许多生物大分子工作机制的新信息，在未来必带给人们更多新的惊喜。

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  Figure 1  (A) Scheme of cholesterol oxidase (COx) catalysis. When COx catalyzing its substrate to generate product,the flavin adenine dinucleotide (FAD) containing in active site is reduced to the reduced flavin adenine dinucleotide,FADH2,then re-oxidized by O₂,corresponding changes of its fluorescent state. (B) Single molecule COx fluorescence emission intensity changes with time. (C) On-time distribution of single COx with 2 mmol/L substrate. (D) The 2D conditional probability distribution of On-time separated by certain numbers of turnovers. (E) The autocorrelation analysis of On-time. (F) Proposed simple model of enzyme catalysis.Fig. 1 was reproduced with permission from Ref ^[9],Copyright 1998 The American Association for the Advancement of Science.

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  Figure 2  (A) Scheme for study of horseradish peroxidase (HRP) activity fluctuation： a,immobilization scheme of HRP；b,correlation analysis of fluorescence intensity changes of single HRP catalysis； (B) Product release process study of HRP： a,scheme for immobilization of HRP; b,Correlation plots of the lifetime,anisotropy,and intensity on single HRP-catalyzed Amplex Red fluorogenic assay; c,Theory model of two kinds of product releasing processes; (C) Conformational manipulation of HRP through single molecule magnetic microscopy: a,the conceptual scheme of the experimental system; b,the catalytic rates changes under external force; c,conceptual scheme of conformational fluctuation of single enzyme protein when being deformed by external force. Fig. 2(A) was reproduced with permission from Ref ^[12],copyright 1999 Elsevier Limited. Fig. 2(B) was reproduced with permission from Ref ^[13],copyright 2014 American Chemical Society. Fig. 2(C) was reproduced with permission from Ref ^[14],copyright 2015 National Academy of Sciences.

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  Figure 3  (A) A virus-based study of HRP catalysis: a,experiment scheme for HRP capsuled in virus capsid,substrates diffuse into the cavity of the virus capsid,and are catalyzed by HRP; b,autocorrelation analysis of HRP catalysis. (B) Study of HRP catalysis revealing a two-step radical dismutation reaction mechanism: a,scheme for glass optical fiber bundle confined single HRP catalysis study; b,averaged catalysis turnover rate for single HRP detection; c,averaged catalysis turnover rate in bulk measurement. (C) Allosteric inhibition study of product generated by HRP: a,scheme for HRP trapped by liposome; b,a typical time trace of fluorescence intensity from HRP catalyzing product formation inside single liposome vesicle as a function of time; c,simple model for noncompetition inhibition and the correlation function between initial reaction rate of individual HRP and the number of product molecules needed for completely inhibition.Fig. 3(A) was reproduced with permission from Ref ^[15],copyright 2007 Nature Publishing Group. Fig. 3(B) was reproduced with permission from Ref ^[16],copyright 2010 American Chemical Society. Fig. 3(C) was reproduced with permission from Ref ^[17],copyright 2012 National Academy of Sciences.

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  Figure 4  (A) Ras activation by Son of Sevenless: a,ras loaded with fluorescent labeled GTP is trapped on to supported bilayer,after catalyzed by SOS,the resulted fluorescent GDP is released to solution. (B) Specific interaction of anaphase-promoting complex (APC) and substrate: a,fluorescent labeled substrate is fixed onto the interface,meanwhile ubiquitin and APC are also fluorescently labeled,and the interaction of APC and substrate are monitored by fluorescence microscopy; b,processive affinity amplification enhances the specificity of APC. (C) Substrate degradation by the proteasome: a,construction of substrate with different ubiquitin configurations; b,single molecule study strategy,the proteasome is trapped on the coverslips,the substrate is conjugated with different ubiquitin conformers,and when the substrate interacting with proteasome,fluorescent spot could be recorded.(A) was reproduced with permission from Ref ^[22],copyright 2014The American Association for the Advancement of Science. (B) was reproduced with permission from Ref ^[23],copyright 2015 The American Association for the Advancement of Science. (C) was reproduced with permission from Ref ^[24],copyright 2015The American Association for the Advancement of Science.

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  Figure 5  (A) Single-molecule study of ribozyme catalysis and folding:a,structural model of ribozyme and experimental scheme;b,the model of P1 interaction with the active center of ribozyme; c,time histogram of folding into native structure. (B) Study of structural dynamics and function: a,single-molecule and bulk solution measurements of enzymatic activities; b,the undocking kinetics is complex,suggesting four docked states of distinct stabilities. c,Docked states have a strong memory effect. (C) Study of modification showing impacts on catalysis: a,exemplary single-molecule FRET time trajectories of the major subpopulations of the WT and variant hairpin ribozyme-noncleavable substrate analog complexes;b,experimental and simulated cleavage time courses of WT and variant ribozymes. (D) Molecular crowding Accelerates Ribozyme Docking and Catalysis: a,PEG stabilizes the docked conformation of the hairpin ribozyme; b,PEG helps the ribozyme fold in near physiological conditions; c,PEG accelerates ribozyme cleavage.(A) was reproduced with permission from Ref ^[25],copyright 2000,The American Association for the Advancement of Science. (B) was reproduced with permission from Ref ^[28],copyright 2002,The American Association for the Advancement of Science. (C) was reproduced with permission from Ref ^[29],copyrights 2004,National Academy of Sciences. (D) was reproduced with permission from Ref ^[30],copyright 2014 American Chemical Society.

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