基于DNA/Nafion-聚二烯丙基二甲基氯化铵功能化的石墨烯电化学传感器评价阿魏酸及当归水提物抗氧化活性

引用本文: 孙伯禄, 苟于强, 马玉玲, 郑晓萍, 胡芳弟. 基于DNA/Nafion-聚二烯丙基二甲基氯化铵功能化的石墨烯电化学传感器评价阿魏酸及当归水提物抗氧化活性[J]. 分析化学, 2016, 44(10): 1575-1583. doi: 10.11895/j.issn.0253-3820.160172 shu

Citation: SUN Bo-Lu, GOU Yu-Qiang, MA Yu-Ling, ZHENG Xiao-Ping, HU Fang-Di. Electrochemical Sensor for Assessment of Antioxidant Activities of Ferulic Acid and Extract in Angelica Sinensis Based on DNA/Nafion- Poly(diallyldimethylammonium chloride) Functionalized Graphene[J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2016, 44(10): 1575-1583. doi: 10.11895/j.issn.0253-3820.160172 shu

基于DNA/Nafion-聚二烯丙基二甲基氯化铵功能化的石墨烯电化学传感器评价阿魏酸及当归水提物抗氧化活性

1.
兰州大学药学院, 兰州 730000;
2.
兰州军区兰州总医院疾病预防控制中心, 兰州 730050
基金项目:
本文系甘肃省中医药管理局科研课题（No.GZK-2013-13）和兰州市科技计划项目（No.2014-2-30）资助

摘要: 构建了DNA/Nafion-聚二烯丙基二甲基氯化铵功能化的石墨烯修饰的玻碳电极（DNA/NA-PDDA-G/GCE），用于DNA氧化损伤的监测及阿魏酸和当归水提物抗氧化活性的评价。采用循环伏安法（CV）和交流阻抗法（EIS）对NA-PDDA-G和DNA修饰后的玻碳电极进行电化学表征，并采用扫描电子显微镜（SEM）对修饰电极表面形貌进行表征。以Ru（NH₃）₆³⁺为探针，采用方波伏安法（SWV）筛选出DNA/NA-PDDA-G/GCE电化学传感器在pH 7.0，Fe²⁺和H₂O₂的配比为1：5的Fenton体系中，经·OH诱导损伤30 min后DNA的损伤程度最大。实验结果表明，当归水提物的抗氧化活性强于阿魏酸单体，但总体来说两者的抗氧化活性都弱于L-抗坏血酸。本方法具有简单、成本低、灵敏度高、重现性好等优点，可用于DNA损伤的监测，以及于抗氧化剂活性大小的评价。

关键词:

English

Electrochemical Sensor for Assessment of Antioxidant Activities of Ferulic Acid and Extract in Angelica Sinensis Based on DNA/Nafion- Poly(diallyldimethylammonium chloride) Functionalized Graphene

1.
School of Pharmacy, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China;
2.
Lanzhou Military Command Center for Disease Prevention and Control, Lanzhou 730050, China
Received Date: 09 March 2016
Revised Date: 03 August 2016

Abstract: A simple electrochemical sensor was constituted based on the glassy carbon electrode (GCE) surface modified with nafion-poly (diallyldimethylammonium chloride) functionalized graphene sheets (NA-PDDA-G) composite film and herring sperm double-stranded DNA for direct detection of DNA damage in vitro and evaluation of the antioxidant properties of ferulic acid (FA) and the aqueous extracts in Angelica Sinensis (EAS). Scanning electron microscopy (SEM) was used to characterize the morphologies of the fabricated sensor, while cyclic voltammetry (CV) and electrochemical impedance spectroscopy (EIS) were used to characterize the electrochemical performances of the modified electrode. Ru(NH₃)₆³⁺ was used as an electroactive indicator to monitor DNA damage induced by hydroxyl radical (·OH) with square wave voltammetry (SWV). The fabricated sensor showed the greatest degree of DNA oxidation damage occurred under the conditions of 30-min incubation in Fenton reagent containing 1.0 mmol/L FeSO₄ and 5.0 mmol/L H₂O₂ at pH 7.0. The antioxidant activity of extract in Angelica Sinensis (EAS) was stronger than that of FA, while they were all weaker than that of ascorbic acid (AA). The proposed sensor not only exhibited excellent stability and reproducibility, but would be a simple and novel method for assessment of antioxidant properties of medicinal herb components.

Key words:

1.   引言

机体内源性的活性氧自由基(ROS)能够引起DNA的损伤,导致DNA发生碱基的脱落、水解、修饰,以及核糖的变化、链的断裂、DNA构象的改变等^[1]。如果DNA的损伤不能及时修复,就会在DNA复制的过程中引起基因突变,最终可能导致癌症和肿瘤,因此,DNA损伤的及时诊断对基因突变和癌症的早期筛查与预防至关重要^[2]。现有的DNA损伤检测的方法有高效液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)^[3]、荧光光谱法^[4]、³²P标记法^[5]、免疫法^[6]、彗星实验法等^[7],但这些方法通常存在检测灵敏度低、繁琐耗时、需要对DNA进行预处理以及检测成本高等问题。建立灵敏、快速、低成本,既可用于DNA损伤的监测,又能同时评价DNA损伤过程中药物或抗氧化剂活性的方法,对疾病的发现、预防及药物作用机理的研究都具有重要的意义。

电化学分析方法具有响应快速、灵敏度高、可实时监测等优点,在生物分子损伤检测研究领域显示出独特的优势^[8]。已报道的DNA损伤的电化学检测方法,包括基于DNA损伤后产生的鸟嘌呤和腺嘌呤的直接电化学信号的测定^[9],以及通过DNA与电活性探针相互作用产生信号的间接测定方法^{[10, 11]}。Wang等^[12]报道了基于联吡啶钴为电化学探针的·OH对DNA损伤的电化学检测方法,由于DNA和黄嘌呤氧化酶(XOD)直接固载在玻碳电极表面,在检测过程中DNA和XOD易脱落。而且,很多类似的研究多集中在电化学检测方法或损伤试剂的作用的研究。

目前,中药活性单体及提取物抗氧化活性筛选的研究已成为中药领域研究的热点^[13],现有的用于中药抗氧化活性筛选及抗氧化能力评价的方法如紫外分光光度法、化学发光分析法、荧光分析法和色谱分析法等^[14]常易受测定物质、测定条件、测定方法等的影响^{[15, 16]}。当归水提物具有抗氧化、抗炎、增强免疫力的活性^{[17, 18]},阿魏酸是当归水提物的主要活性成分之一^{[19, 20]},然而目前未见有对阿魏酸及当归水提物抗氧化活性评价的研究。

聚二烯丙基二甲基氯化铵功能化的石墨烯(PDDA-G)因其较好的水溶分散性和优良的导电性能在传感得到了广泛的应用^{[21, 22]},而与成膜材料Nafion(NA)结合后的PDDA-G,不仅能很好地结合在电极表面,加速电极表面电子的转移,而且能够通过静电作用和二硫键有效地固定DNA^{[23, 24]}。基于NA-PDDA-G优越的性能,本研究利用带正电荷的NA-PDDA-G和DNA间的静电吸引作用及强的二硫键作用,将DNA固定在玻碳电极(GCE)表面,成功构建DNA/NA-PDDA-G/GCE电化学传感器,用于灵敏监测DNA损伤和评价阿魏酸及当归水提物抗氧化活性。以Ru(NH₃)₆³⁺为探针^[25],通过比较方波伏安法(SWV)测得的相对峰电流比(I_pt/I_p0),研究Fenton试剂对DNA的损伤及阿魏酸和当归水提物对DNA损伤的抑制作用。

2.   实验部分

2.1.   仪器与试剂

CHI 6041E和CHI 1220A型电化学工作站(上海辰华仪器有限公司),采用三电极体系,裸玻碳电极(GCE)或修饰电极为工作电极,铂丝(Pt)电极为辅助电极,饱和甘汞电极(SCE)为参比电极;Waters 2695高效液相色谱仪,配Waters2998二极管阵列检测器(美国Waters 公司);UV2300型可见-紫外分光光度计测定(上海天美公司);JEOL JSM-6380LV型扫描电镜(日本电子公司);PHS-3B型pH 计(上海精密科学仪器有限公司)。

鲱精DNA,NA(美国Sigma-Aldrich公司);六铵合钌(Ru(NH₃)₆Cl₃,97.5%,北京百灵威科技有限公司),用含有50 mmol/L NaCl的5 mmol/L pH 7.0 Tris-HCl缓冲液稀释为1.0 mmol/L;氧化石墨烯(GO,南京先丰纳米材料科技有限公司);L-抗坏血酸(AA,上海中秦化学试剂有限公司)和阿魏酸(FA,成都普菲德生物技术有限公司),用二次蒸馏水分别配成浓度为2.5 mmol/L的储备液。当归购于本地药材市场。所有试剂均为分析纯,实验用水均为二次蒸馏水。

2.2.   PDDA功能化的石墨烯(PDDA-G)的制备

本实验先采用改进的Offeman和Hummers方法,由石墨粉制得氧化石墨烯(Graphene oxide,GO),然后将GO与水合肼和PDDA反应得到PDDA功能化的石墨烯(Poly (diallyldimethylammonium chloride) functionalized graphene sheets,PDDA-G)^[22],并用0.5% NA稀释成1.0 mg/mL的NA-PDDA功能化的石墨烯(NA-PDDA-G)溶液。

2.3.   当归样品的制备

取市售当归干药材将其粉碎,过3号筛(50目),称取粉末各0.2 g,采用补足称重的方法,用20 mL蒸馏水80℃加热回流3 h,制备水提物(EAS),HPLC分析EAS中阿魏酸的含量。

2.4.   DNA/NA-PDDA-G/GCE修饰电极的制备

在预先打磨清洗的GCE表面,滴涂10 μL 1.0 mg/mL的NA-PDDA-G,室温干燥4 h,然后滴涂5 μL,2.0 mg/mL鲱精DNA溶液,4℃自然晾干。用pH 7.0的PBS溶液洗去电极表面吸附不牢的DNA,得到DNA/NA-PDDA-G/GCE。

2.5.   电化学测量方法

电化学交流阻抗法(EIS)测量条件为:振幅为0.005 V;电压为0.22 V;频率范围为0.1~10⁵ Hz。循环伏安法(CV)测量条件为:电压范围为-0.4~1.0 V;扫速为100 mV/s。电解质溶液为5 mmol/L[Fe(CN)₆]^3-/4-,0.1 mol/L KCl 溶液

将AA、FA和EAS的储备液用Fenton溶液(pH 7.0的PBS溶液,含1 mmol/L FeSO₄和5 mmol/L H₂O₂)稀释成一系列含不同浓度抗氧化剂的溶液。以1.0 mmol/L Ru(NH₃)₆Cl₃(含50 mmol/L KCl)为探针溶液,采用方波伏安法(SWV)检测修饰在电极表面的DNA受Fenton试剂的损伤程度及抗氧化剂抑制DNA损伤的活性,振幅为25 mV,扫描电压范围为-0.8~0.4 V。

2.6.   DNA氧化损伤的过程

首先将DNA/NA-PDDA-G/GCE修饰电极置于Ru(NH₃)₆³⁺溶液中,采用SWV扫描得到损伤前的电化学响应(图 1曲线a)。另将同一根电极同法重新修饰为DNA/NA-PDDA-G/GCE电极先在15 mL Fenton试剂中室温温育30 min,Fenton试剂产生的·OH^{[8, 26]}引起电极表面的DNA 的损伤。然后先用pH 7.0的PBS溶液冲洗电极,再将该电极置入Ru(NH₃)₆³⁺溶液中进行方波伏安扫描,得到损伤后的电化学响应(图 1曲线c)。图 1曲线b是修饰电极置于含抗氧化剂的Fenton试剂中处理相同时间后所得的电化学响应。根据损伤前后电化学响应电流的变化,实现对DNA 损伤程度的监测和抗氧化剂活性大小的评价。

图 1

图 1 羟自由基造成DNA损伤及抗氧化剂抑制损伤示意图

Figure 1. Schematic diagram of DNA damage

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3.   结果与讨论

3.1.   自由基的产生及阿魏酸抗氧化作用的检测

Fe²⁺与邻二氮菲能够生成橙红色络合物,在510 nm 波长处有最大吸收峰^[11],如图 2曲线a所示。当反应体系中邻二氮菲与FeSO₄和H₂O₂组成的Fenton试剂共存时,Fenton试剂产生的自由基会破坏Fe²⁺-邻二氮菲络合物,510 nm处的吸收值降低(图 2曲线f),而随体系中加入的阿魏酸浓度的增大,510 nm的吸收值逐渐增大(图 2曲线b~e)。上述结果表明,阿魏酸能够清除自由基,减小自由基对生成的橙红色络合物的破坏。另一方面,上述结果也表明,选择的体系(邻二氮菲、Fe²⁺和H₂O₂ 的浓度分别为0.006,1.0和5.0 mmol/L)能产生自由基对DNA产生损伤,而阿魏酸具有一定的抗氧化作用。

图 2

图 2 紫外-可见吸收光谱法验证自由基的产生和不同浓度阿魏酸清除自由基的作用,a FeSO₄+邻二氮菲 (不含自由基),b~f 邻二氮菲 + Fenton试剂(5 mmol/L H₂O₂ + 1.0 mmol/L Fe²⁺) + 阿魏酸 (45,30,15,7.5,0 μmol/L),g Fenton体系。

Figure 2. UV-vis absorption spectra of 1,10-phenanthroline-iron indicator (no free radical) (a),1.10-phenanthroline-iron indicator + Fenton reagents (5 mmol/L H₂O₂ + 1.0 mmol/L Fe²⁺)+ FA (45,30,15,7.5,0 μmol/L) (b-f) and Fenton reagents (g).

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3.2.   修饰电极的形貌表征

修饰的NA-PDDA-G玻碳电极表面,呈现出波浪状的整体形貌特征(图 3A)。当将DNA滴涂到NA-PDDA-G/GCE电极表面时,DNA通过物理吸附和氢键作用结合在电极表面,呈现出起伏较大、较为粗糙的形貌(图 3B)。而经Fenton试剂损伤30 min后,电极表面呈现出粗糙度和起伏更大的形貌(图 3C)。这可能是Fenton试剂引起了DNA链的断裂和碱基氧化损伤所致,或者Fe²⁺与DNA形成配合物,结果与Chiorcea-Paquim等在研究Pb²⁺、Cd²⁺、Ni²⁺和Pd²⁺与ds-DNA的相互作用的研究结果一致^[27]。

图 3

图 3 (A) NA-PDDA-G/GCE,(B) DNA/NA-PDDA-G/GCE和(C) 经Fenton试剂作用30min后的DNA/NA-PDDA-G/GCE的扫描电镜图

Figure 3. Scanning electron microscope (SEM) images of nafion (NA)-PDDA-G/GCE (A),DNA/NA-PDDA-G/GCE (B),and DNA/NA-PDDA-G/GCE film damaged for 30 min by Fenton reagents (C)

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3.3.   修饰电极的电化学表征

从图 4A可见,[Fe(CN)₆]^3-/4-在裸GCE电极上有一对弱的氧化还原峰(曲线a);修饰NA-PDDA-G后,由于PDDA-G优良的导电性能,使得[Fe(CN)₆]^3-/4-在其表面的背景电流和氧化还原峰明显的增大(曲线b);而当ds-DNA修饰在NA-PDDA-G/GCE后,[Fe(CN)₆]^3-/4-的氧化还原峰几乎消失,这是由于ds-DNA形成的膜阻碍了[Fe(CN)₆]^3-/4-在电极上的电化学响应(曲线c);然而,当DNA/NA-PDDA-G/GCE经Fenton体系损伤后,CV法扫描所得曲线的背景电流明显减小,这是由于DNA损伤后,很可能双链结构被破坏,引起DNA构象的变化,进一步阻碍[Fe(CN)₆]^3-/4-在电极上的电化学响应所致^[28]。

图 4

图 4 (A) 循环伏安法(CV)和(B) 交流阻抗法(EIS)在5.0 mmol/L[Fe(CN)₆]^3-/4-溶液中对GCE (a),NA-PDDA-G/GCE (b),DNA/NA-PDDA-G/GCE (c) 和经Fenton试剂损伤30 min后的DNA/NA-PDDA-G/GCE (d)的表征图。 (C) DNA/NA-PDDA-G/GCE在pH 7.0的PBS溶液(a) ,5 mmol/L H₂O₂ (b),1.0 mmol/L Fe²⁺ (c)和Fenton试剂(d) 中损伤不同时间后在Ru(NH₃)₆²⁺探针溶液中,采用方波伏安法(SWV)检测的氧化峰电流(I_pt)和损伤前峰电流(I_p0)比值随时间的变化趋势

Figure 4. (A) Cyclic voltammetry (CV) and (B) electrochemical impedance spectroscopy (EIS) characterization of GCE (a),NA-PDDA-G/GCE (b),DNA/NA-PDDA-G/GCE (c) and DNA/NA-PDDA-G/GCE damaged for 30 min by Fenton reagents (d) in 5.0 mmol/L[Fe(CN)₆]^3-/4- (pH 7.0) solution. (C) Square wave voltammetry (SWV) oxidative peak current ratio (I_pt/I_p0) of 1.0 mmol/L Ru(NH₃)₆^3＋ for DNA/NA-PDDA-G/GCE versus incubation time in pH 7.0 PBS containing blank (a) ,5 mmol/L H₂O₂ (b),1.0 mmol/L Fe²⁺ (c) and Fenton reagents (d)

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图 4B为不同修饰电极在5 mmol/L[Fe(CN)₆]^3-/4-溶液中的奈奎斯特曲线^[29]。裸GCE的电荷转移电阻(R_ct)约为2693 Ω 。修饰NA-PDDA-G后R_ct减小到300 Ω(曲线b),这是由于PDDA-G优良的导电性能加速电极表面的电子转移所致。当用DNA修饰NA-PDDA-G/GCE(曲线c)后,R_ct值增大到7965 Ω,一方面是由于形成的DNA膜阻碍了[Fe(CN)₆]^3-/4-在电极表面的电子传递,另一方面是由于DNA链的负电荷阻碍了[Fe(CN)₆]^3-/4-探针到达电极表面。当DNA/NA-PDDA-G/GCE修饰电极经Fenton试剂损伤后,其R_ct值又逐渐增大至22496 Ω (曲线d),这可能是由于DNA受损后,DNA发生碱基修饰、核糖变化、链断裂、碱基游离等构象变化,进一步阻碍了探针分子在电极上的电化学响应所致。

3.4.   DNA损伤的电化学检测

由于Ru(NH)₆³⁺被完整的和损伤的DNA特异性催化发生反应的程度不同,因此本研究将其作为探针溶液^[25],通过比较相对峰值电流比(I_pt/I_p0)^[30]来评价DNA的损伤。图 4C为DNA/NA-PDDA-G/GCE修饰电极在不同体系溶液中分别浸泡不同时间I_pt/I_p0的变化趋势。可以看出,当修饰电极在Fenton试剂中(曲线d),室温条件下损伤40 min后,I_pt/I_p0是未浸泡前的4.24倍。而在单组分的H₂O₂溶液(曲线c)、Fe²⁺溶液(曲线b)以及只含有pH 7.0 PBS的溶液(曲线a),浸泡前后I_pt/I_p0均没有明显的变化。上述结果说明,Fenton试剂产生的·OH对DNA造成了损伤。而DNA损伤后发生的链断裂和碱基暴露^[31],将引发如下所示的反应,从而引起电极响应发生变化,基于此可以实现对DNA损伤的电化学检测。

1

2

3

3.5.   实验条件的优化

3.6.   抗氧化剂对DNA氧化损伤抑制的研究

在优化的实验条件下,采用DNA/NA-PDDA-G/GCE修饰电极,对AA、EAS和FA的抗氧化活性进行了比较(图 6)。与经Fenton试剂损伤不同时间后修饰电极的I_pt/I_p0 (图 6D曲线a)相比,含抗氧化剂的Fenton试剂损伤后修饰电极的I_pt/I_p0的明显较小。在抗氧化剂浓度相同的条件下,这3种物质的抗氧化活性依次为AA＞EAS＞FA,这是由于AA双烯醇式结构的互变使其具有较强的抗氧化活性^[32];而FA与AA相比,单一烯醇式结构的互变使其具有弱于AA的抗氧化活性^[22]。同时,阿魏酸含量一定时,当归水提物的抗氧化活性大于阿魏酸,这可能是由于当归水提物中所含的具有微弱抗氧化作用的当归多糖、藁本内酯等对阿魏酸的抗氧化作用具有协同作用所致^[33]。

图 6

图 6 修饰电极分别在含有(A) 7.5 μmol/L FA,(B) 7.5 μmol/L FA的EAS,(C) 7.5 μmol/L AA及不含有抗氧化剂的Fenton试剂损伤不同时间后的SWV检测信号。(D) 修饰电极在(a) 不含抗氧化剂,含(b) 7.5 μmol/L FA,(c) 7.5 μmol/L FA的EAS,(d) 7.5 μmol/L AA损伤不同时间后,SWV检测的I_pt/I_p0的变化趋势。探针溶液为1.0 mmol/L Ru(NH₃)₆³⁺

Figure 6. SWV responses of DNA/NA-PDDA-G/GCE after incubated in Fenton reagent containing (A) 7.5 μmol/L FA,(B) EAS onctaining 7.5 μmol/L FA,and (C) 7.5 μmol/L AA and containing no anti-oxidants for different time. (D) Dependence of SWV oxidative peak current ratio I_pt/I_p0 of 1.0 mmol/L Ru(NH₃)₆³⁺ for DNA film on the incubation time in Fenton reagents (pH 7.0) containing blank (a),7.5 μmol/L FA (b),EAS containing 7.5 μmol/L FA (c),and 7.5 μmol/L AA (d).

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图 7A为Fenton试剂中分别加入不同浓度的AA、FA、EAS后对DNA/NA-PDDA-G/GCE电极损伤前后I_pt/I_p0大小的影响。随着抗氧化剂浓度的增加,I_pt/I_p0先减小后增大。I_pt/I_p0的减小说明抗氧化剂清除了自由基,使得DNA的损伤程度减小。且当AA、EAS、FA在Fenton试剂中的浓度分别达到30,50和60 μmol/L时,其各自清除自由基的能力达到最大。再逐渐增加抗氧化剂的浓度,I_pt/I_p0逐渐增大,表现为促进氧化的作用,这是由于AA、FA过量时,会还原Fenton试剂之前产生的Fe³⁺为Fe²⁺,而进一步发生Fenton反应,产生自由基,对DNA造成损伤,这与文献^{[34, 35]}报道的结果一致。

图 7

图 7 (A) 抗氧化剂浓度对方波伏安法(SWV)检测峰电流比值(I_pt/I_p0)的影响。(B) 抗氧化剂的浓度与其抑制自由基产生的关系。

Figure 7. (A) Influence of antioxidant concentration on SWV oxidative peak current ratio I_pt/I_p0 in 1.0 mmol/L Ru(NH₃)₆³⁺ for DNA film after incubated in Fenton . (B) Relationship between the concentration of antioxidant and antioxidant properties

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氧化剂对自由基抑制率(Inhibition ratio,IR)按如下公式计算:

4

I_p30(i)、I_p30(0)和I_p30(Max)分别代表抗氧化剂的浓度为i、0及抗氧化能力最大时的抗氧化剂浓度的Fenton体系对修饰电极损伤30 min后的SWV峰电流值。计算得到AA,EAS和FA的半数抑制浓度(IC₅₀)分别为17.8,32.1和37.9 μmol/L,进一步验证了3种物质的抗氧化活性大小依次为AA＞EAS＞FA。

3.7.   修饰电极的重复性和稳定性研究

同一DNA/NA-PDDA-G/GCE电极平行测定10次的SWV检测值间的相对标准偏差为3.2%。5支玻碳电极修饰的DNA/NA-PDDA-G/GCE电极在同一体系中SWV检测值间的相对标准偏差为4.5%。修饰电极经4℃冰箱7天,SWV法测得的氧化峰电流为最初的91.3%。结果表明,此修饰电极具有很好的重现性和稳定性。

3.5.2.   Fenton体系的pH值对DNA损伤程度的影响

Fenton试剂的pH 值在3.0~9.0 范围内逐渐增加时,随着溶液pH值的增大,I_pt/I_p0先增大后减小,在pH 7.0时最大(图 5B)。说明该修饰电极在pH 7.0的Fenton试剂中损伤30 min后,其损伤最完全。因此,本实验选择pH 7.0 作为后续实验中Fenton体系的最佳pH值。

3.5.3.   Fe²⁺/H₂O₂摩尔比对DNA损伤程度的影响

图 5C是固定Fe²⁺浓度为1.0 mmol/L改变H₂O₂浓度时,SWV峰电流的变化。图 5D是固定H₂O₂浓度为5.0 mmol/L,改变Fe²⁺浓度时,SWV峰电流的变化情况。由图 5可知,当Fe²⁺的浓度为1.0 mmol/L,H₂O₂的浓度为5.0 mmol/L时I_pt/I_p0达到最大值,即损伤程度最大。因此,后续实验采用Fe²⁺与H₂O₂的摩尔比为1:5。

3.5.1.   Fenton体系损伤时间的影响

图 5A是DNA/NA-PDDA-G/GCE修饰电极在由1.0 mmol/L FeSO₄和5.0 mmol/L H₂O₂的pH 7.0 PBS溶液组成的Fenton体系中浸泡0~60 min时对I_pt/I_p0的影响。结果表明,电极经Fenton体系损伤30min后,其I_pt/I_p0几乎不再发生变化,因此,选择30 min为最佳损伤时间。

图 5

图 5 温育时间(A)和Fenton试剂的pH值(B)对SWV检测信号的影响,Fenton试剂为含1.0 mmol/L FeSO₄和5.0 mmol/L H₂O₂的PBS(pH 7.0);(C)固定Fe²⁺浓度为1.0 mmol/L,Fe²⁺和H₂O₂的摩尔比在0:0~1:8之间变化,(D)固定H₂O₂浓度为5.0 mmol/L,Fe²⁺和H₂O₂的摩尔比在0:0-5:5之间变化时对SWV检测信号的影响

Figure 5. Influence of different parameters on SWV response of DNA/NA-PDDA-G/GCE after damaged under different conditions. The influence of (A) incubation time and (B) pH of Fenton reagent in PBS containing 1.0 mmol/L FeSO₄,5.0 mmol/L H₂O₂,(C) molar ratio of Fe²⁺ and H₂O₂ in the range of 0:0-1:8 at a fixed concentration of Fe²⁺(1.0 mmol/L) in PBS (pH 7.0),(D) molar ratio of Fe²⁺ and H₂O₂ in the range of 0:0-5:5 at a fixed concentration of H₂O₂ (5.0 mmol/L) in pH 7.0 PBS in PBS (pH 7.0).

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1. [1]
  Hepel M, Stobiecka M, Peachey J, Miller J. DNA-Protective Mechanisms of Antioxidant Glutathione Intervention in Catechol-Mediated Oxidative DNA Damage in the Presence of Copper Ions, in: Oxidative Stress: Diagnostics, Prevention and Therapy, S. Andreescu, M. Hepel (Eds.), ACS Symp Series, Oxford University Press, Inc, American Chemical Society, Washington, DC, 2011, 1083: 177-209
2. [2]
  Xiong H, Chen Y, Zhang X, Gu H, Wang S. Sens. Actuat. B., 2013, 181: 85-91
3. [3]
  Tarun M, Bajrami B, Rusling J F. Anal. Chem., 2006, 78(2): 624-627
4. [4]
  Viswesh V, Gates K, Sun D. Chem. Res. Toxicol., 2010, 23: 99-107
5. [5]
  Reddy M V. Regul, Toxicol. Pharm., 2000, 32: 256-263
6. [6]
  Deforce D L D, Ryniers F P K, Van den Eeckhout E G, Lemière F, Esmans E L. Anal. Chem., 1996, 68(2): 3575-3584
7. [7]
  Jia S P, Liang M M, Guo L H. J. Phys. Chem. B, 2008, 112: 4461-4464
8. [8]
  Bian C, Xiong H, Zhang X, Wen W, Wang S. Biosens. Bioelectron., 2011, 28: 216-220
9. [9]
  Mello L D, Hernandez S, Marrazza G, Mascini M, Kubota L T. Biosens. Bioelectron., 2006, 21: 1374-1382
10. [10]
  Yang J, Zhang Z, Rusling J F. Electroanal., 2002, 14: 1494-1500
11. [11]
  Wang X, Yang T, Jiao K. Biosens. Bioelectron., 2009, 25: 668-673
12. [12]
  Wang Y, Xiong H, Zhang X, Wang S. Sens. Actuat. B., 2012, 161: 274-278
13. [13]
  Lee S E, Hwang H J, Ha J S, Jeong H S, Kim J H. Life Sciences, 2003, 73: 167-179
14. [14]
  S'anchez-Moreno C. Food Sci. Technol. Int., 2002, 8: 131-137
15. [15]
  Litescu S, Radu G L, Diaconu M. Electroanal., 2001, 13: 8-9
16. [16]
  Nyska A, Kohen R. Toxicol. Pathol., 2002, 30: 620-650
17. [17]
  WU Da-Zheng, SONG Chun-Qing, HAN Zhi-Fen, KONG Jian-Long, FAN Yi, HU Zhi-Bi. Pharmacol. Clin. Chin. Mater. Med., 1999, 15(5): 1-3 吴大正, 宋纯清, 韩之芬, 孔建龙, 樊懿, 胡之璧. 中药药理与临床, 1999, 15(5): 1-3
18. [18]
  Liu S P, Dong W G, Wu D F, Luo H S, Yu J P. World. J. Gastroentero., 2012, 9(12): 2786-2790
19. [19]
  Lu G H, Chan K, Leung K, Chan C L, Zhao Z Z, Jiang Z H. J. Chromatogr. A, 2005, 1068(2): 209-219
20. [20]
  Ou S, Kwok K C. J. Sci. Food. Adr., 2004, 84: 1261-1269
21. [21]
  Liu K P, Zhang J J, Wang C M, Zhu J J. Biosens. Bioelectron., 2011, 26: 3627-3632
22. [22]
  Liu L J, Gao X, Zhang P, Feng S L, Hu F D, Li Y D, Wang C M. J. Anal. Methods Chem., 2014: 424790
23. [23]
  Jalalvanda A R, Gholivanda M B, Goicoecheab H C, T Skovc, K Mansourid. Int. J. Biol. Macromol., 2015, 79: 1004-1010
24. [24]
  Long Y T, Li C Z, Sutherland T C, Kraatz H B, Lee J S. Anal. Chem., 2004, 76: 4059-4065
25. [25]
  Wang X, Jiao K, Li G. Electrochimica Acta, 2011, 56: 2828-2831
26. [26]
  Zhao C, Dodin G, Yuan C, Chen H, Zheng R, Jia Z, Fan B T. Biochim. Biophys. Acta, 2005, 1723: 114-123
27. [27]
  Chiorea-Paquim A M, Corduneanu O, Oliveira S C B, Diculescu V C, Oliveira-Brett A M. Electrochim. Acta, 2009, 54(7): 1978-1985
28. [28]
  LÜ Cui, KANG Tian-Fang, LU Li-Ping, XIONG Yue. Chinese J. Anal. Chem., 2012, 40(12): 1822-1826 吕翠, 康天放, 鲁理平, 熊岳. 分析化学, 2012, 40(12): 1822-1826
29. [29]
  Feng L J, Zhang X H, Zhao D M, Wang S F. Sens. Actuat. B., 2011, 152: 88-93
30. [30]
  Bian C, Xiong H, Zhang X, Ye Y, Gu H, Wang S. Sens. Actuat. B., 2012, 169: 368-373
31. [31]
  Wang X, Jiao C, Yu Z. Sens. Actuat. B, 2014, 192: 628-633
32. [32]
  Liu Y, Hu N F. Biosens. Bioelectron., 2009, 25: 185-190
33. [33]
  Huang S H, Chen C C, Lin C M, Chiang B H. J. Food Compos. Anal., 2008, 21: 402-409
34. [34]
  Mochizuki M, Yamazaki S i, Kano K, Ikeda T. BBA-GEN Subjects, 2002, 1569: 35-44
35. [35]
  Kerman K, Vestergaard M, Tamiya E. Anal. Chem., 2007, 79(17): 6881-6885
Figure 1 Schematic diagram of DNA damage

GO: Graphene oxide; PDDA-G: Poly(dially idimethy lammonium chloride)functionalized graphene sheets; AA: Ascorbic acid;FA:ferulic acid;EAS:extracts in Angelica Sinensis; SWV: Square wave voltammetry。

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Figure 2 UV-vis absorption spectra of 1,10-phenanthroline-iron indicator (no free radical) (a),1.10-phenanthroline-iron indicator + Fenton reagents (5 mmol/L H₂O₂ + 1.0 mmol/L Fe²⁺)+ FA (45,30,15,7.5,0 μmol/L) (b-f) and Fenton reagents (g).

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Figure 3 Scanning electron microscope (SEM) images of nafion (NA)-PDDA-G/GCE (A),DNA/NA-PDDA-G/GCE (B),and DNA/NA-PDDA-G/GCE film damaged for 30 min by Fenton reagents (C)

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Figure 4 (A) Cyclic voltammetry (CV) and (B) electrochemical impedance spectroscopy (EIS) characterization of GCE (a),NA-PDDA-G/GCE (b),DNA/NA-PDDA-G/GCE (c) and DNA/NA-PDDA-G/GCE damaged for 30 min by Fenton reagents (d) in 5.0 mmol/L[Fe(CN)₆]^3-/4- (pH 7.0) solution. (C) Square wave voltammetry (SWV) oxidative peak current ratio (I_pt/I_p0) of 1.0 mmol/L Ru(NH₃)₆^3＋ for DNA/NA-PDDA-G/GCE versus incubation time in pH 7.0 PBS containing blank (a) ,5 mmol/L H₂O₂ (b),1.0 mmol/L Fe²⁺ (c) and Fenton reagents (d)

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Figure 5 Influence of different parameters on SWV response of DNA/NA-PDDA-G/GCE after damaged under different conditions. The influence of (A) incubation time and (B) pH of Fenton reagent in PBS containing 1.0 mmol/L FeSO₄,5.0 mmol/L H₂O₂,(C) molar ratio of Fe²⁺ and H₂O₂ in the range of 0:0-1:8 at a fixed concentration of Fe²⁺(1.0 mmol/L) in PBS (pH 7.0),(D) molar ratio of Fe²⁺ and H₂O₂ in the range of 0:0-5:5 at a fixed concentration of H₂O₂ (5.0 mmol/L) in pH 7.0 PBS in PBS (pH 7.0).

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Figure 6 SWV responses of DNA/NA-PDDA-G/GCE after incubated in Fenton reagent containing (A) 7.5 μmol/L FA,(B) EAS onctaining 7.5 μmol/L FA,and (C) 7.5 μmol/L AA and containing no anti-oxidants for different time. (D) Dependence of SWV oxidative peak current ratio I_pt/I_p0 of 1.0 mmol/L Ru(NH₃)₆³⁺ for DNA film on the incubation time in Fenton reagents (pH 7.0) containing blank (a),7.5 μmol/L FA (b),EAS containing 7.5 μmol/L FA (c),and 7.5 μmol/L AA (d).

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Figure 7 (A) Influence of antioxidant concentration on SWV oxidative peak current ratio I_pt/I_p0 in 1.0 mmol/L Ru(NH₃)₆³⁺ for DNA film after incubated in Fenton . (B) Relationship between the concentration of antioxidant and antioxidant properties

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