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• 1.   引 言

  蛋白质和多肽是生命的重要物质基础,随着对蛋白质和多肽结构、功能和应用研究的不断深入,迫切需要从复杂生物体系中高效分离蛋白质和多肽的技术。

  逆流色谱(Countercurrent chromatography,CCC)是一种连续高效的液-液分配色谱技术,其固定相和流动相为互不相溶的两相。在分离过程中,固定相通过离心力保留在分离柱中,流动相以一定的速度通过固定相并与之混合,样品进入体系后在两相中反复进行分配,最终样品中的不同组分依据其在两相中分配系数的不同先后被洗脱出来,从而达到分离的效果。逆流色谱近年来广泛地应用于天然产物的分离纯化^[1],已有多种黄酮^[2]、多酚^[3]、生物碱^[4]和萜类化合物^[5]等通过逆流色谱得到了分离制备。逆流色谱具有样品负载量大、无不可逆吸附、回收率高和能有效保护物质的生物活性等优点,且样品不经过复杂的处理即可直接上样,与HPLC相比,不需使用昂贵的色谱柱^[6],因而有可能发展成为从复杂生物体系中高效分离蛋白质和多肽的重要技术手段。近年来逆流色谱技术已被应用于蛋白质和多肽的分离纯化中,表 1总结了近年来部分逆流色谱技术分离纯化蛋白质和多肽的研究报道。根据固定相的保留方式和柱体设计的不同,现代逆流色谱系统可以分为两类:基于流体静力学平衡体系的逆流色谱系统和基于流体动力学平衡体系的逆流色谱系统,这两类系统的区别在于所产生的离心力场是否恒定。本文综述了近年来这两类逆流色谱技术分离蛋白质和多肽的研究进展。

  2.   基于流体静力学平衡体系的逆流色谱技术

  基于流体静力学平衡体系的逆流色谱仪器具有一个单一的旋转轴,可以产生恒定的离心力。在一个旋转的流体静力学型逆流色谱仪器的分离柱中,溶剂体系的两相保持静止,不能单独移动,如要使流动相穿过固定相,则必须有泵的辅助。仪器在运行过程中体系会产生较大的反压^[19]。基于流体静力学平衡体系的逆流色谱系统主要包括离心分配色谱和环形线圈逆流色谱。

  2.1.   离心分配色谱

  离心分配色谱(Centrifugal partition chromatography,CPC)的结构示意图见图 1^[20]。其中心具有一根转轴,分离柱为一系列刻在圆盘上并由管道相连的腔体,其出口和和进口的流通管由旋转轴内部伸出,通过两个旋转密封接头与外界连接。CPC对于绝大多数溶剂体系都具有较高的固定相保留率,在蛋白质和多肽的分离纯化中,通常使用双水相体系为溶剂体系。Sutherland等^[21]以12.5% (w/w) 聚乙二醇(PEG)1000-12.5% (w/w) K₂HPO₄水溶液为溶剂体系,首先应用柱体积为500 mL的实验室规模的CPC对溶菌酶和肌红蛋白进行了分离,分离度为1.28。随后放大到柱体积为6.25 L的中试规模的CPC,分离度为1.88,制备量可达到1.65 g/h (40 g/d)。该研究表明:应用CPC分离纯化蛋白质和多肽的过程较容易实现放大,且在线性放大的条件下,固定相保留率有所提高,从而分离度也有所提高。Oelmeier等^[22]以16.5% (w/w) PEG 400-17.45%(w/w) NaH₂PO₄-17.45% (w/w) K₂HPO₄水溶液为溶剂体系,应用CPC对4种单克隆抗体进行了纯化,该方法对宿主细胞蛋白质具有较高的清除率,对目标蛋白质的回收率达到98%。Boudesocque等^[23]以甲基叔丁基醚-乙腈-正丁醇-水(2:1:2:5,V/V)为溶剂体系,在上相中添加磷酸二异辛酯(DEHPA)做为离子交换剂,与两种置换剂-氯化钙和盐酸联合使用,利用CPC从苜蓿白蛋白浓缩水解液中分离得到一种抗高血压的多肽L-缬氨酸-L-色氨酸,纯度为10.9%,纯化因子为41,回收率为97%。以上两项研究表明,CPC可以用于实际样品中蛋白质和多肽的分离纯化。CPC具有稳定性高和噪音低等优点^[19],但是由于CPC的柱系统是由一系列腔体通过管路连接而成的,在这些连接管路中只有流动相存在,这些流动相和固定相之间没有任何接触,造成了死体积的存在,从而降低了CPC的分离效率。这也促使了研究者对流体静力学型逆流色谱的分离柱进行改进。

  表 1

  

  表 1  逆流色谱分离蛋白质和多肽的应用

  Table 1.  Application of countercurrent chromatography (CCC) in separation and purification of proteins and peptides

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  蛋白质或多肽Proteins or peptides	仪器Instrument	溶剂体系Solvent systems	文献Ref.
  人类B19帕尔沃病毒样颗粒 Human B19 parvo virus-like particles	离心分配色谱 Centrifugal partition chromatography	14.8%(w/w) PEG 400-16.28% (w/w) 磷酸盐 (pH=3.0)-7.5% (w/w) NaCl水溶液 14.8%(w/w) polyethylen glycol (PEG) 400-16.28% (w/w) phosphate (pH=3.0)-7.5% NaCl in water	[7]
  缬氨酸-酪氨酸、色氨酸-酪氨酸 Val-tyr,trp-tyr 溶菌酶、肌红蛋白 Lysozyme,myoglobin	离心分配色谱 Centrifugal partition chromatography	1-丁醇-乙酸-水(4:1:5,V/V) 1-Butanol-acetic acid-water (4:1:5,V/V)12.5 % (w/w) PEG 1000-12.5% (w/w) K2HPO4溶液 12.5% (w/w) PEG 1000-12.5% (w/w) K2HPO4 in water	[8]
  重组蓝藻抗病毒蛋白-N Recombinant cyanovirin-N	离心分配色谱 Centrifugal partition chromatography	13%(w/w) PEG 4000-13% (w/w) Na3PO4 (pH=3.0) 水溶液 13% PEG 4000-13% sodium phosphate (pH=3.0) in water	[9]
  单克隆抗体1、2和4 Monoclonal antibody 1,2 and 4	离心分配色谱 Centrifugal partition chromatography	21.02% (w/w) PEG 400-18.99% (w/w) 柠檬酸盐溶液 21.02% (w/w) PEG 400-18.99% (w/w) citrate in water	[10]
  甘氨酸-甘氨酸、甘氨酸-酪氨酸、丙氨酸-酪氨酸、亮氨酸-缬氨酸和亮氨酸-酪氨酸) Gly-Gly,Gly-Tyr,Ala-Tyr, Leu-Val and Leu-Tyr	离心分配色谱 Centrifugal partition chromatography	甲基叔丁基醚-乙腈-正丁醇-水 (2:1:2:5,V/V),上相加入15 mmol/L DEHPA Methyl-tert-butylether-acetonitrile-n-butanol-water (2:1:2:5,V/V) 15 mmol/L DEHPA was added to the upper phase	[11]
  溶解酵素、肌红蛋白 Lysozyme,myoglobin	环形线圈逆流色谱 Toroidal coil countercurrent chromatography	12.5% (w/w) PEG 1000-12.5% (w/w) K2HPO4溶液 12.5% (w/w) PEG 1000-12.5% (w/w) K2HPO4 in water	[12]
  恩拉霉素-A和-B Enramycin-A and -B	高速逆流色谱 High-speed countercurrent chromatography	1-丁醇-正己烷-0.05%三氟乙酸水溶液(43:7:50,V/V) 1-Butanol-hexane-0.05% aqueous trifluoroacetic acid solution (43:7:50,V/V)	[13]
  环肽A和环肽B Segetalin A and Segetalin B	高速逆流色谱 High-speed countercurrent chromatography	石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(0.5:3.5:1:5,V/V) Petroleum ether-ethyl acetate-methanol-water (0.5:3.5:1:5,V/V)	[14]
  胶原酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅹ Collagenase Ⅰ,Ⅱ,Ⅳ,Ⅴ and Ⅹ	正交轴逆流色谱 Cross-axis countercurrent chromatography	12.5% (w/w) PEG 1000-12.5% (w/w) K2HPO4溶液,pH=9.2 12.5% (w/w) PEG 1000-12.5% (w/w) K2HPO4 in water at pH 9.2	[15]
  缬氨酸-酪氨酸、色氨酸-酪氨酸 Val-tyr,trp-tyr 溶解酵素、肌红蛋白 Lysozyme,myoglobin	螺旋柱逆流色谱 Spiral countercurrent chromatography	1-丁醇-乙酸-水(4:1:5,V/V) 1-Butanol-acetic acid-water (4:1:5,V/V)12.5 % (w/w) PEG 1000-12.5% (w/w) K2HPO4溶液 2.5% (w/w) PEG 1000-12.5% (w/w) K2HPO4 in water	[16]
  肽(GIHIGPGRAFYAARK) 酰基载体蛋白质碎片-肽(VQAAIDYING) 肽(fPRGGGGNGDFEEIPEEYL,f=D-Phe) Peptide (GIHIGPGRAFYAARK) Acyl carrier protein fragment- peptide (VQAAIDYING) Peptide (fPRGGGGNGDFEEIPEEYL,f=D-Phe) 类泛素融合蛋白 Ubiquitin-like fusion protein	螺旋柱逆流色谱 Spiral countercurrent chromatography	2-丁醇-0.1%三氟乙酸水溶液(1:1,V/V) 2-Butanol-0.1% aqueous trifluoroacetic acid (1:1,V/V)12.5% (w/w) PEG 1000-12.5% (w/w) K2HPO4水溶液 12.5% (w/w) PEG 1000-12.5% (w/w) K2HPO4 in water	[17]
  类胡萝卜素裂解酶 Carotenoid cleavage-like enzymes	螺旋柱逆流色谱 Spiral countercurrent chromatography	25% (w/w) PEG 1000-6.25% (w/w) KH2PO4-6.25% (w/w) K2HPO4溶液 25% (w/w) PEG 1000-6.25% (w/w) KH2PO4-6.25% (w/w) K2HPO4 in water	[18]

  图 1

  

  图 1  离心分配色谱仪(CPC)的结构示意图^[20]

  Figure 1.  Structure diagram of centrifugal partition chromatography(CPC)^[20]

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  2.2.   环形线圈逆流色谱

  环形线圈逆流色谱(Toroidal coil countercurrent chromatography,TC-CCC)是一种对流体静力学型逆流色谱分离柱进行改进的系统,其结构示意图见图 2^[24]。TC-CCC的中心为一根旋转轴,其分离柱为其外围的盘绕柱,与CPC的刻在圆盘上的分离柱不同,TC-CCC的分离柱为一圈圈盘绕的环形线圈。由于TC-CCC不需要同CPC一样用管路连接相邻的腔体,因而减少了死体积,提高了分离效率。在TC-CCC的运行过程中,仪器会对处于环形线圈中的流动相产生一种不对称的科里奥利(Coriolis)力,力的大小及方向会对物质的分离产生影响。当Coriolis力与作用的线圈部位平行时,流动相将分散到固定相中,产生大的接触面,加速样品的传质,从而提高理论塔板数与色谱峰的分离度^[25]。在早期的TC-CCC设计中,环形柱直接安装于普通离心机的缠线管上,环形柱和外部管路的连接需要机械密封,因此容易产生漏液、阻塞和污染的现象^[26]。在随后出现的多层环形线圈逆流色谱(Multilayer toroidal coil chromatography,MTCC)中,环形柱直接安装于J-型逆流色谱仪(见3.1)的缠线管上,旋转柱和外部管路之间不需要机械密封,因而避免了早期TC-CCC的缺点,如图 3所示^[12]。Guan等^[27]以肌红蛋白和溶菌酶为模型蛋白质,以12.5% (w/w) PEG 1000-12.5% (w/w) K₂HPO₄水溶液为溶剂体系,考察了Coriolis力、柱长和样品负载量对MTCC分离的影响。最终确定当Coriolis力与流动模式平行,且柱长和柱体积分别为53.5 m和107.5 mL时,进样体积最大可达到柱体积的7.4%(进样浓度为2.2 mg/mL),肌红蛋白和溶菌酶的理论塔板数分别为218和152,分离度为1.4,表明了逆流色谱具有较高的样品负载量,然而理论塔板数偏低。他们还对MTCC分离2种二肽(组氨酸-甘氨酸、缬氨酸-酪氨酸)和2种蛋白质(肌红蛋白和溶解酵素)的效果进行了比较,结果表明:在2种蛋白质的分离因子(3.2)大于2种多肽的分离因子(2.1)的情况下,MTCC对2种多肽的分离效果依然明显优于对2种蛋白质的分离效果,证实了分子量是导致逆流色谱峰展宽的一个重要因素。Sutherland等^[28]以12.5% (w/w) PEG 1000-12.5% (w/w) K₂HPO₄溶液为溶剂体系,分别考察了CPC和MTCC对肌红蛋白和溶菌酶的分离效果。在CPC分离中,分离度为1.24,制备量为0.14 g/h,在MTCC分离中,分离度为1.25,制备量为0.67 g/h。在CPC的分离过程中一直伴随着固定相的流失,因而在每次进样前,需要重新泵入固定相,而在MTCC的分离过程中则没有固定相的流失,因而可以实现连续进样。虽然2种逆流色谱均可对2种蛋白质实现较好的分离,但在仪器规模相近的情况下,MTCC的制备量约为CPC制备量的4.8倍,表明MTCC在蛋白质的大量分离与制备中具有巨大的潜力。

  图 2

  

  图 2  环形线圈逆流色谱仪(TC-CCC)的结构示意图^[24]

  Figure 2.  Structure diagram of toroidal coil countercurrent chromatography (TC-CCC)^[24][]

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  图 3

  

  图 3  多层环形线圈逆流色谱仪(MTCC ) 的结构示意图^[12]

  Figure 3.  Structure diagram of multilayer toroidal countercurrent chromatography (MTCC)^[12]

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  3.   基于流体动力学平衡体系的逆流色谱技术

  基于流体动力学平衡体系的逆流色谱仪器具有两个或多个旋转轴,常见的为两个旋转轴,包括一个主轴(公转轴)和一个行星运动轴(自转轴),能够产生可变的离心力场。流体动力学型逆流色谱仪器的分离柱在旋转过程中会产生阿基米德螺旋力,使分离柱的两端产生压力差,低压的一端称为"尾",高压的一端称为"头",轻相会从头端被排挤出来,仪器运行过程中体系的反压较小^[24]。不同的流体动力学型逆流色谱仪器的区别主要有两点,一是自转轴与公转轴角度的不同,二是自转轴与公转轴的旋转方向和角速度的不同。基于流体动力学平衡体系的逆流色谱系统技术有以下几种。

  3.1.   高速逆流色谱

  高速逆流色谱(High-speed countercurrent chromatography,HSCCC),即J-型逆流色谱,是目前最常用的逆流色谱,其结构示意图见图 4^[29]。HSCCC的分离柱为缠绕在圆柱形支撑件上的多层聚四氟乙烯螺旋管,其自转轴与公转轴通过两个尺寸和形状完全相同的齿轮相啮合,在运行过程中,支撑件在围绕公转轴转动的同时,以相同的角速度自转,且转动方向与公转方向相同。HSCCC对弱极性和中极性化合物具有较好的分离效果,而对于强极性化合物,分离效果不够理想。这是由于强极性的溶剂体系往往具有较大的粘度与较小的界面张力,且两相之间的密度差较小,因而在HSCCC上的固定相保留率较低。HSCCC很少直接用于蛋白质和多肽的分离,其应用往往局限于一些简单二肽的分离和一些中极性或弱极性的肽类衍生物的分离。Knight等^[30]以甲基叔丁基醚-正丁醇-乙腈-1%三氟乙酸溶液(2:2:1:5,V/V)为溶剂体系,利用HSCCC对6种二肽(酪氨酸-甘氨酸、酪氨酸-丙氨酸、酪氨酸-缬氨酸、缬氨酸-酪氨酸、酪氨酸-亮氨酸、亮氨酸-酪氨酸)基本上实现了基线分离。Ma等^[31]以甲基叔丁基醚-0.1 mol/L KH₂PO₄溶液(1:1,V/V)为溶剂体系,在上相中添加DEHPA做为配体,对4对二肽同分异构体(酪氨酸-甘氨酸、甘氨酸-酪氨酸,酪氨酸-丙氨酸、丙氨酸-酪氨酸,酪氨酸-缬氨酸、缬氨酸-酪氨酸,酪氨酸-亮氨酸、亮氨酸-酪氨酸)实现了部分分离。通过HSCCC实现分离的二肽往往含有至少一个疏水氨基酸残基,应用HSCCC对极性氨基酸组成的肽类和蛋白质的分离还面临着巨大的挑战。Seger等^[32]将葡聚糖凝胶 LH-20非极性色谱与HSCCC联用,从绿僵菌培养基中分离得到了5种亲脂性环肽衍生物,分别为腐败菌素(dtx)A,B,D,E和E-二醇。葡聚糖凝胶 LH-20非极性色谱用于目标物的富集,在这一过程中,dtx D和dtx E-二醇也得到了分离,其纯度超过90%。随后以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(2:5:2:5,V/V)为溶剂体系对dtx A,B,和E的混合组分进行分离,最终得到的3种化合物的纯度均超过98%,总产率超过40%。该研究表明逆流色谱可与其它分离技术联用,从复杂体系中分离蛋白质和多肽。

  图 4

  

  图 4  高速逆流色谱仪(HSCCC)的结构示意图^[29]

  Figure 4.  Structure diagram of high speed countercurrent chromatography (HSCCC)^[29]

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  传统的HSCCC分离柱对强极性溶剂体系的固定相保留率较低,为了解决这一问题,研究者对HSCCC分离柱的几何结构进行了改造,研制出螺旋柱逆流色谱(Spiral countercurrent chromatography)。螺旋柱CCC通过扩大螺旋管的盘绕螺距来增大其在行星式运动过程中产生的阿基米德螺旋力,以此来提高固定相的保留率。常见的螺旋柱有两种。一种为螺旋盘组装柱,由多个塑料的圆盘堆叠而成,具有1个或多个相互交织的串联螺旋通道,图 5a为具有1个通道的螺旋盘柱的结构示意图^[33],盘面上刻着1个螺旋型的凹槽,I为凹槽的内部入口,O为凹槽的外部入口。将盘面用聚四氟乙烯片封住,凹槽即成为可供溶剂流经的通道,将多个这样的圆盘堆叠并串联,即成为螺旋盘组装柱。另一种为螺旋管组装柱,由嵌入螺旋管支撑件内部框架的聚四氟乙烯管制成,图 5b为螺旋管支撑件的结构示意图^[33],螺旋管由支撑件边缘O₁沿着框架绕向中心I₁,然后沿着半径回到外围O₄,再去绕下一个螺旋,依次经过I₄,O₃,I₃,O₂和I₂,即形成了4个螺旋,如此便构成螺旋管组装柱。这两种螺旋柱均可用于蛋白质和多肽的分离^[33]。Kight等^[34]以仲丁醇-1%三氟乙酸水溶液(1:1,V/V)为溶剂体系,应用螺旋盘柱CCC对3种多肽(肽6877、肽7020和肽507)进行了分离,其中肽6877与其它2种多肽实现了完全分离,回收率达到90%,另外2种多肽得到了部分分离。Cao等^[35]以12.5% (w/w) PEG 1000-12.5% (w/w) K₂HPO₄水溶液为溶剂体系,应用螺旋管柱CCC对2组蛋白质(细胞色素C和肌红蛋白,溶菌酶和肌红蛋白)实现了基线分离。近年来对于螺旋柱的研究多集中于其几何结构的设计。在对螺旋盘组装柱结构的研究中,Ito等^[36]设计了一种Mixer-settler型螺旋盘柱,在分离柱内每隔一定距离设置一个障碍,将分离柱分成多个大小相同的小室,在每个小室中放置一个玻璃珠,在分离过程中,小室中的玻璃珠剧烈震荡,对两相的混合起了一定的搅拌作用,增大了两相混合的剧烈程度,以此来提高分离效率。Ito以12.5% (w/w) PEG 1000-12.5% (w/w) K₂HPO₄水溶液为溶剂体系,应用Mixer-settler型螺旋盘柱对细胞色素C、肌红蛋白、卵清蛋白和溶菌酶4种蛋白质基本实现了基线分离。在对螺旋管组装柱结构的研究中,Yang等^[37]设计了一种Flat-twisted型螺旋管柱,加工过程中需将螺旋管嵌入到一个狭窄的槽内挤压,然后绕着螺旋管的轴扭转1 cm。在分离过程中,当流动相流经Flat-twisted型螺旋管柱时,流动相的层流状态会被打破,两相持续地在管内混合,由此提高分离效率。Yang等以正丁醇-乙酸-水(4:1:5,V/V)为溶剂体系,分别使用装配普通螺旋管柱的CCC仪器与装配Flat-twisted型螺旋管柱的CCC仪器对2种二肽(缬氨酸-酪氨酸、色氨酸-酪氨酸)和2种蛋白质(溶菌酶和肌红蛋白)进行分离,普通螺旋管柱对2种二肽和2种蛋白质的分离度分别为2.79和1.10,Flat-twisted型螺旋管柱对2种二肽和2种蛋白质的分离度分别为4.06和2.53,该研究表明,Flat-twisted型螺旋管柱对蛋白质和多肽具有更强的分离能力。Wade等^[38]以32% (w/w) PEG 1000-25% (w/w) K₂HPO₄溶液为溶剂体系,应用Flat-twisted型螺旋管柱CCC对萝卜芽粗提物进行分离,从中得到了芥子酶,纯度提高了60倍,回收率为79.2%,研究结果表明,Flat-twisted型螺旋管柱CCC也可用于从实际样品中分离蛋白质和多肽。螺旋盘组装柱的制作需要精密的加工,以使得管道密封良好,不发生漏液。而螺旋管组装柱的加工则没有如此高的要求,因而更加灵活方便。

  图 5

  

  图 5  螺旋柱逆流色谱分离柱的结构示意图。a,螺旋盘柱; b,螺旋管柱支撑件^[33]

  Figure 5.  Structure diagram of separation columns of spiral countercurrent chromatography. a,spiral disk; b,spiral tube support^[33]

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  3.2.   正交轴逆流色谱

  正交轴逆流色谱(Cross-axis countercurrent chromatography,cross-axis CCC)的结构示意图见图 6^[39],正交轴CCC的柱体自转轴与仪器公转轴相互垂直,且自转与公转的角速度相同。正交轴CCC在运行过程中能产生三维的不对称离心力场,对于具有低界面张力的溶剂体系(如双水相体系)也有较高的固定相保留率,因而适用于蛋白质和多肽的分离。Shinomiya等^[40]以12.5% (w/w) PEG 1000-12.5% (w/w) K₂HPO₄溶液为溶剂体系,利用正交轴CCC对细胞色素C、肌红蛋白和卵清蛋白3种蛋白质进行了分离,获得了较好的分离效果。早期的正交轴CCC仪器具有占地面积大、流通管易损坏和分离柱安装困难等缺点。为了提高装置的实用性,Shinomiya等设计了一系列小型的正交轴CCC仪器,并以细胞色素C、肌红蛋白和溶菌酶为模型蛋白质考察了各种参数对分离效果的影响,这些仪器对这3种蛋白质均可实现较好的分离^{[15, 41, 42]}。小型仪器的研制对于溶剂体系的筛选具有重要的意义,可以节约溶剂与样品的消耗。Shinomiya等^[43]还以12.5% (w/w) PEG 1000-12.5% (w/w) K₂HPO₄溶液(pH=9.2)为溶剂体系,应用小型的正交轴 CCC对核糖核酸酶A与核糖核酸酶B实现了分离。以16% (w/w) PEG 1000-6.3% (w/w) K₂HPO₄-6.3% (w/w) KH₂PO₄溶液(pH=6.6)为溶剂体系从侧耳的粗提物中分离得到了核糖核酸酶Po₁和核糖核酸酶T₁,其中核糖核酸酶Po₁的回收率为60%,表明其活性在CCC分离过程中得到了较好的保持,而该研究组在使用HPLC分离核糖核酸酶Po₁时,发现酶的活性经常完全丧失。该研究表明逆流色谱在活性生物大分子的分离纯化中具有广阔的应用前景。然而正交轴CCC仪器的机械强度较差,在运行过程中容易损坏,限制了其在蛋白质和多肽分离中的应用。

  图 6

  

  图 6  正交轴逆流色谱仪(cross-axis CCC)的结构示意图^[39]

  Figure 6.  Structure diagram of cross-axis countercurrent chromatography (cross-axis CCC)

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  3.3.   非同步式逆流色谱

  非同步式逆流色谱(Nonsynchronous countercurrent chromatography)与高速逆流色谱和正交轴逆流色谱不同,其自转角速度和公转角速度可以不同。在实际的研究工作中,主要以自转轴与公转轴平行的非同步式CCC为研究对象。图 7为传统的J-型CCC(HSCCC)与非同步式CCC的仪器结构对比图^[44]。对于J-型CCC,其分离柱的自转是靠公转轴上的齿轮与自转轴上的齿轮相互啮合而带动的,这两个齿轮的尺寸和形状完全相同,因而自转与公转的方向与角速度均相同,见图 7a所示。而对于非同步式CCC,分离柱的自转是由不同于主轴的另一个独立的轴所控制的(图 7b),因而自转与公转的方向可以相同也可以相反,且自转与公转的角速度可以分别进行调节。非同步式CCC仪器对双水相体系也具有较高的固定相保留率,可用于蛋白质和多肽的分离。Shinomiya等^[45]以12.5%(w/w) PEG 1000-12.5%(w/w) K₂HPO₄溶液为溶剂体系,以细胞色素C、肌红蛋白和溶菌酶3种蛋白质为模型蛋白质,考察了非同步式CCC的行星运动模式对分离效果的影响。结果表明,从头到尾的洗脱方式有利于固定相的保留和分离度的提高。Shinomiya等^[46]以12.5% (w/w) PEG 1000-12.5% (w/w) K₂HPO₄溶液为溶剂体系,应用非同步式CCC仪器对细胞色素C、肌红蛋白和溶菌酶3种蛋白质进行了分离,在以下相做为流动相,自转速度为1066 r/min,公转速度为1000 r/min,且自转方向与公转方向相同时,可获得最佳的分离效果,理论塔板数为388,细胞色素C和肌红蛋白的分离度为1.3,肌红蛋白和溶菌酶的分离度为1.7。虽然非同步式CCC可以对蛋白质和多肽实现较好的分离,但是非同步式CCC的仪器构造较为复杂,未能实现广泛的应用。

  图 7

  

  图 7  两种仪器结构的对比图:(a)J-型逆流色谱,(b)非同步式逆流色谱^[44]

  Figure 7.  Comparison of the structures of two instruments: (a) J-type countercurrent chromatography,(b) nonsynchronous countercurrent chromatography

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  4.   总结与展望

  随着生物技术的迅速发展,各种具有独特的功效蛋白质和多肽被应用于食品、医药和化工等领域,使得对高纯度及生物活性良好的蛋白质和多肽的需求量大大增加。逆流色谱做为一种新型的液-液分配色谱技术,在蛋白质和多肽的分离纯化领域中具有巨大的潜力。逆流色谱用于分离蛋白质和多肽,未来的发展可以从以下几个方面考虑:(1) 加强仪器的研制。逆流色谱具有大规模制备的潜力,在研究过程中应重点关注规模放大的问题,设计规模更大的仪器,加大制备量。目前已有学者对CPC实现了中试规模的放大,如能继续对逆流色谱的工业化进行研究,则有可能充分发挥逆流色谱的优势。MTCC、正交轴CCC、非同步式CCC和螺旋柱CCC等逆流色谱虽然对蛋白质和多肽具有较好的分离效果,但这些仪器还处于实验室应用阶段,应加速其商品化进程。此外,还应继续研究具有新型结构的仪器与分离柱,提高分离效率。(2) 探索新型的溶剂体系。目前分离蛋白质和多肽的溶剂体系主要为双水相体系和含有丁醇的体系,种类过于单一,不能满足分离的需要,直接从复杂样品基质中分离得到的蛋白质和多肽种类有限,大多数研究还是集中于蛋白质和多肽标准品的分离,以进行仪器分离效率的考察和分离机理的研究。未来应发展更多具有良好理化性质和对目标物具有较高选择性的溶剂体系,向体系中加入与目标物有亲和作用的配体可以做为一种思路。(3) 开发逆流色谱与其它分离手段的联用技术。逆流色谱做为一种液-液分配色谱,其理论塔板数难以达到高效液相色谱、毛细管电泳等技术的级别,但其制备量大、无不可逆吸附和能有效保持物质的生物活性等优点使其可以与其它技术联用,共同发挥优势。逆流色谱分离可以作为蛋白质和多肽样品前处理的步骤,先对复杂样品进行粗分,再用HPLC等技术进行更为细致的分离,最终获得高纯度的蛋白质与多肽。随着对逆流色谱各方面研究的深入,相信在不久的将来,逆流色谱在蛋白质和多肽的分离纯化领域中会愈趋成熟。

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  Figure 1  Structure diagram of centrifugal partition chromatography(CPC)^[20]

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  Figure 2  Structure diagram of toroidal coil countercurrent chromatography (TC-CCC)^[24][]

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  Figure 3  Structure diagram of multilayer toroidal countercurrent chromatography (MTCC)^[12]

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  Figure 4  Structure diagram of high speed countercurrent chromatography (HSCCC)^[29]

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  Figure 5  Structure diagram of separation columns of spiral countercurrent chromatography. a,spiral disk; b,spiral tube support^[33]

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  Figure 6  Structure diagram of cross-axis countercurrent chromatography (cross-axis CCC)

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  Figure 7  Comparison of the structures of two instruments: (a) J-type countercurrent chromatography,(b) nonsynchronous countercurrent chromatography

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  Table 1.  Application of countercurrent chromatography (CCC) in separation and purification of proteins and peptides

  蛋白质或多肽Proteins or peptides	仪器Instrument	溶剂体系Solvent systems	文献Ref.
  人类B19帕尔沃病毒样颗粒 Human B19 parvo virus-like particles	离心分配色谱 Centrifugal partition chromatography	14.8%(w/w) PEG 400-16.28% (w/w) 磷酸盐 (pH=3.0)-7.5% (w/w) NaCl水溶液 14.8%(w/w) polyethylen glycol (PEG) 400-16.28% (w/w) phosphate (pH=3.0)-7.5% NaCl in water	[7]
  缬氨酸-酪氨酸、色氨酸-酪氨酸 Val-tyr,trp-tyr 溶菌酶、肌红蛋白 Lysozyme,myoglobin	离心分配色谱 Centrifugal partition chromatography	1-丁醇-乙酸-水(4:1:5,V/V) 1-Butanol-acetic acid-water (4:1:5,V/V)12.5 % (w/w) PEG 1000-12.5% (w/w) K2HPO4溶液 12.5% (w/w) PEG 1000-12.5% (w/w) K2HPO4 in water	[8]
  重组蓝藻抗病毒蛋白-N Recombinant cyanovirin-N	离心分配色谱 Centrifugal partition chromatography	13%(w/w) PEG 4000-13% (w/w) Na3PO4 (pH=3.0) 水溶液 13% PEG 4000-13% sodium phosphate (pH=3.0) in water	[9]
  单克隆抗体1、2和4 Monoclonal antibody 1,2 and 4	离心分配色谱 Centrifugal partition chromatography	21.02% (w/w) PEG 400-18.99% (w/w) 柠檬酸盐溶液 21.02% (w/w) PEG 400-18.99% (w/w) citrate in water	[10]
  甘氨酸-甘氨酸、甘氨酸-酪氨酸、丙氨酸-酪氨酸、亮氨酸-缬氨酸和亮氨酸-酪氨酸) Gly-Gly,Gly-Tyr,Ala-Tyr, Leu-Val and Leu-Tyr	离心分配色谱 Centrifugal partition chromatography	甲基叔丁基醚-乙腈-正丁醇-水 (2:1:2:5,V/V),上相加入15 mmol/L DEHPA Methyl-tert-butylether-acetonitrile-n-butanol-water (2:1:2:5,V/V) 15 mmol/L DEHPA was added to the upper phase	[11]
  溶解酵素、肌红蛋白 Lysozyme,myoglobin	环形线圈逆流色谱 Toroidal coil countercurrent chromatography	12.5% (w/w) PEG 1000-12.5% (w/w) K2HPO4溶液 12.5% (w/w) PEG 1000-12.5% (w/w) K2HPO4 in water	[12]
  恩拉霉素-A和-B Enramycin-A and -B	高速逆流色谱 High-speed countercurrent chromatography	1-丁醇-正己烷-0.05%三氟乙酸水溶液(43:7:50,V/V) 1-Butanol-hexane-0.05% aqueous trifluoroacetic acid solution (43:7:50,V/V)	[13]
  环肽A和环肽B Segetalin A and Segetalin B	高速逆流色谱 High-speed countercurrent chromatography	石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(0.5:3.5:1:5,V/V) Petroleum ether-ethyl acetate-methanol-water (0.5:3.5:1:5,V/V)	[14]
  胶原酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅹ Collagenase Ⅰ,Ⅱ,Ⅳ,Ⅴ and Ⅹ	正交轴逆流色谱 Cross-axis countercurrent chromatography	12.5% (w/w) PEG 1000-12.5% (w/w) K2HPO4溶液,pH=9.2 12.5% (w/w) PEG 1000-12.5% (w/w) K2HPO4 in water at pH 9.2	[15]
  缬氨酸-酪氨酸、色氨酸-酪氨酸 Val-tyr,trp-tyr 溶解酵素、肌红蛋白 Lysozyme,myoglobin	螺旋柱逆流色谱 Spiral countercurrent chromatography	1-丁醇-乙酸-水(4:1:5,V/V) 1-Butanol-acetic acid-water (4:1:5,V/V)12.5 % (w/w) PEG 1000-12.5% (w/w) K2HPO4溶液 2.5% (w/w) PEG 1000-12.5% (w/w) K2HPO4 in water	[16]
  肽(GIHIGPGRAFYAARK) 酰基载体蛋白质碎片-肽(VQAAIDYING) 肽(fPRGGGGNGDFEEIPEEYL,f=D-Phe) Peptide (GIHIGPGRAFYAARK) Acyl carrier protein fragment- peptide (VQAAIDYING) Peptide (fPRGGGGNGDFEEIPEEYL,f=D-Phe) 类泛素融合蛋白 Ubiquitin-like fusion protein	螺旋柱逆流色谱 Spiral countercurrent chromatography	2-丁醇-0.1%三氟乙酸水溶液(1:1,V/V) 2-Butanol-0.1% aqueous trifluoroacetic acid (1:1,V/V)12.5% (w/w) PEG 1000-12.5% (w/w) K2HPO4水溶液 12.5% (w/w) PEG 1000-12.5% (w/w) K2HPO4 in water	[17]
  类胡萝卜素裂解酶 Carotenoid cleavage-like enzymes	螺旋柱逆流色谱 Spiral countercurrent chromatography	25% (w/w) PEG 1000-6.25% (w/w) KH2PO4-6.25% (w/w) K2HPO4溶液 25% (w/w) PEG 1000-6.25% (w/w) KH2PO4-6.25% (w/w) K2HPO4 in water	[18]

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