English

• 1.   引 言

  食品中的矿物油问题由来已久，主要涉及抛光大米和食用油掺假。2008年，欧盟发生了近10万吨进口乌克兰葵花籽油被矿物油污染事件^[1]，使得食用油中矿物油的分析备受关注。油茶籽油是我国特有的高级食用油，其脂肪酸组成与橄榄油相似，具有很高保健功能，有“东方橄榄油”之称^[2]。随着人们健康理念的提高，近年来油茶籽油的需求量不断上升。因此，做好油茶籽油的质量监测具有现实意义。

  矿物油是石油原油经过物理分离、化学转化等过程形成的C₁₀～C₅₀的烃类化合物，主要由烷烃(MOSH)以及烷基取代的芳香烃(MOAH)两大类组成^[1]。由于MOSH的含量远远高于MOAH，且易于分析，因此，一般将MOSH作为矿物油污染的标志物^[3]。然而，矿物油化学组成复杂，其定量分析通常采用气相色谱-氢火焰离子化检测(GC-FID)。原因是FID系唯一对所有矿物油组分响应完全一致的检测器，GC是与FID检测器联用的理想分离方式^[4]。 MOSH的GC谱图是一个类似“驼峰”的宽峰，宽峰上方的尖峰为食用油中天然正构烷烃，定量计算时需要扣除，即MOSH的含量通过计算GC谱图的基线与宽峰之间的“空白”面积得到^[4~7]。

  然而，FID方法检测矿物油有两个缺点，即灵敏度低与选择性差。灵敏度低则要求进入检测器的目标物浓度足够高，选择性差则需要进入FID的目标物足够纯。一般经验要求进入FID的MOSH质量要达到50～100 ng^[4]；并尽可能除去食用油中固有的角鲨烯和天然烷烃。换言之，FID分析矿物油要求富集与净化的程度非常高。目前，高效液相色谱(HPLC)与GC的联用是最常用的矿物油分析技术，它通过HPLC与GC接口实现在线净化、富集，有效提高了矿物油的浓度和纯度^[8~10]。然而，HPLC-GC仪器昂贵，无法普及。因此，离线净化色谱柱或固相萃取柱(SPE)配合大体积进样系统(LVI)的GC就成为另外一种解决途径^{[11, 12]}。

  SPE方法快速、简便、高效、经济，利用SPE柱净化的关键是填料。硅胶能够有效的吸附食用油中的甘油三酯^[5]，是矿物油净化的首选填料。硅胶经过活化可以显著提高吸附容量^[11]；银渍硅胶能够吸附食用油中角鲨烯等物质^[13]；氧化铝则对碳数高于C₂₃的天然烷烃有吸附作用^{[14, 15]}。因此，本研究拟通过优化SPE柱填料与LVI-GC条件，建立油茶籽油中MOSH的定量分析方法，并在此基础上考察我国油茶籽油中的矿物油污染情况。

  2.   实验部分

  2.1.   仪器与试剂

  GC-2010 plus气相色谱仪，配备PTV进样口和FID(日本Shimadzu公司)；DB-5HT石英毛细管柱(15 m × 0.25 mm × 0.1 μm，美国Agilent公司)；N-EVAP氮气吹干仪(美国Organomation公司)。

  正己烷、丙酮(色谱纯，美国Fisher Scientific公司)；硅胶(0.063～0.200 mm，德国Merck公司)和中性氧化铝(100~200目，国药集团化学试剂有限公司)，使用前均在高温炉中于600℃烘烤6 h，冷却，置于干燥器备用；液体石蜡(Paraffin oil)、正十八烷烃(n-Octadecane，C₁₈)、C₇～C₄₀正构烷烃混合标准溶液、胆甾醇(5-Alpha cholestane，Cho)，均购自美国Sigma-Aldrich公司；AgNO₃(分析纯，北京化工厂)，配制成0.75 g/mL溶液。11个油茶籽油样品均购于当地超市。实验用所有玻璃器皿需依次用铬酸洗液、超纯水、丙酮和正己烷溶液冲洗后烘干。

  2.2.   标准溶液的配制

  配制2 mg/mL的C₁₈(内标)和Cho(MOSH的定位标准)储备液，然后分别取1 mL置于50 mL容量瓶中，以正己烷定容，得40 mg/L混合标准溶液。配制50 g/L液体石蜡储备液，然后分别取5,10,25,50,100,200和500 μL于50 mL容量瓶中，以正己烷定容得到浓度为5,10,25,50,100,200和500 mg/L系列标准工作溶液

  2.3.   实验方法

  2.3.3.   样品净化

  准确称取1.000g油茶籽油试样于2 mL容量瓶中，加入40 mg/L混合标准溶液200 μL，以正己烷定容。净化前SPE柱先用20 mL正己烷淋洗，弃去流出液，待正己烷近干时，加入上述试液2 mL，分次加入50 mL正己烷洗脱。弃去10 mL死体积，收集后续40 mL洗脱液；氮吹浓缩近干，用正己烷定容至0.5 mL，备用。

  2.3.2.   SPE柱制备

  取50 mL玻璃注射器(14 cm×2.8 cm)，底部放入圆形滤纸，依次装填10 g氧化铝，2 g无水硫酸钠和10 g银渍硅胶，中间用单层滤纸隔开，轻轻敲实，上面盖一层滤纸，用于净化食用油。

  2.3.1.   银渍硅胶制备

  称取45 g活化硅胶至500 mL圆底烧瓶(事先用铝箔纸包裹)中，再加入0.75 g/mL AgNO₃溶液6 mL，均质30 min，静置12 h后备用。

  2.3.4.   GC分析条件

  PTV参数：初始温度75℃保持1 min(分流比200:1)，以250℃/min 升温至370℃(关闭分流阀1 min)；切换分流比为50:1；进样量40 μL。GC分析条件：起始温度65℃，保持10 min，然后以25℃/min升温至350℃，再以5℃/min升温至370℃，保持10 min； 柱内采用恒压模式，载气为高纯氮气； 氢气流量30 mL/min； 空气流量400 mL/min；FID温度380℃。

  3.   结果与讨论

  3.1.   SPE柱填料的确定

  3.2.   线性范围、检出限和定量限

  液体石蜡是石油精炼后得到的烷烃混合物,是目前比较适于矿物油定量分析的标准品^[4]。在2.3.4 节条件下分析2.2节配制的液体石蜡系列工作溶液。以GC谱图中的宽峰面积与相应浓度绘制曲线，所得标准曲线为y=34863x－20512，相关系数0.998，液体石蜡在5～500 mg/L浓度范围内线性关系良好。将5 mg/L液体石蜡工作溶液在相同条件下进样11次，以3倍和10倍的标准偏差计算得到方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ)分别为0.26和0.80 mg/kg。

  3.3.   加标回收率

  选取10#油茶籽油作为样品基质，分别添加液体石蜡标准溶液进行回收率实验，添加水平为25.0,50.0和100.0 mg/kg。以10 g银渍硅胶-10 g活化氧化铝的SPE柱净化，每个试样及空白分别平行测定6次，计算平均加标回收率和相对标准偏差(RSD)。由表 1可知，加标回收率在93.3%～112.7%之间，RSD在1.8%～5.2%之间，本方法的回收率和RSD值均符合检测要求。

  表 1

  

  表 1  液体石蜡的加标回收率和相对标准偏差(n=6)

  Table 1.  Recoveries and RSD of paraffin oil(n=6)

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  分析物Analytes	添加浓度Spiked conc.(mg/kg)	样品含量Content in sample(mg/kg)	检出量Total found(mg/kg)	回收率Recovery(%)	相对标准偏差RSD(%)
  	25.0		60.1	97.2	4.9
  液体石蜡Paraffin oil	50.0	35.8	92.2	112.7	5.2
  	100.0		129.1	93.3	1.8

  3.4.   重复性

  选取10#油茶籽油样品，按照上述建立的方法每天测定6次，计算日内重复性；连续测定5天，计算日间重复性。日内和日间标准偏差分别为2.6%和1.6%。矿物油定量方法的重复性除了与样品前处理与仪器分析相关之外，还与矿物油宽峰面积的积分方法密切相关，不同的积分方法(包括消除尖峰的方法)对于分析结果的影响很大，通常认为，积分结果相差15%是可以接受的^[4]。

  3.5.   样品分析

  采用上述方法，即通过装填10 g银渍硅胶-10 g活化氧化铝净化的SPE柱净化1 g植物油样品，净化试液经浓缩后注入LVI-GC-FID分析，检测了11个市售的不同厂家与品牌油茶籽油中MOSH的含量。由表 2可见，油茶籽油的MOSH含量为6.8~76.7 mg/kg。其中8#和9#样品MOSH含量较低，低于10 mg/kg； 2#,3#,6#,10#和11#等5个样品中的MOSH含量为27.0～38.7 mg/kg；其余4个样品(1#,4#,5#和7#)的MOSH含量较高，均高于50 mg/kg。50 mg/kg 是2008年欧盟对乌克兰葵花籽油中MOSH提出的限量规定^[17]。如果参照此限量，我国市售油茶籽油中的矿物油污染情况不容忽视。

  表 2

  

  表 2  市售油茶籽油中MOSH的检测结果

  Table 2.  Analytical results of MOSH in commercial camellia seed oils

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  样品Sample	MOSH(mg/kg)
  1#	61.1±1.2
  2#	33.3±1.0
  3#	27.0±0.3
  4#	62.7±2.8
  5#	61.2±2.8
  6#	38.7±2.3
  7#	76.7±5.2
  8#	6.8±1.0
  9#	9.0±2.1
  10#	35.8±0.6
  11#	35.9±0.5
  Mean value	37.4

  食用油的污染来源非常广泛，包括环境污染与包装材料迁移油迁移，包装材料迁移相对简单，环境污染则涉及油籽生长、收割、晾晒、加工(油脂提取和精炼)、油脂贮存以及运输等环节中接触到的杀虫剂、发动机润滑油、未完全燃烧的汽油、轮胎和沥青的碎屑以及不洁净空气等。不同来源的污染通常表现在矿物油的组成上，本实验仅对我国市售油茶籽油中的MOSH总量进行了测定。对于矿物油的污染来源，需要后续进一步分析MOSH的组成情况。

  3.1.1.   银渍硅胶

  硅胶吸附弱极性的甘油三酯，而不吸附非极性的矿物油，因而利用硅胶可以除去食用油中的甘油三酯。此外，银渍硅胶对双键有微弱作用，可以吸附植物油中角鲨烯、胆甾烯(甾醇的衍生物)及胡萝卜素等物质，因此，当植物油通过装填银渍硅胶的SPE柱时，油脂中的甘油三酯和角鲨烯等干扰物质被吸附，矿物油直接流出，从而达到净化目的。Fiselier等^[13]研究发现，3 g银渍硅胶可以保留400 mg油脂。本实验采用10 g银渍硅胶净化1 g油茶籽油，洗脱液浓缩后注入GC-FID分析。采用上述方法测得一个市售油茶籽样品(4#)中矿物油的含量为71.3 mg/kg(图 1)。

  图 1

  

  图 1  油茶籽油中MOSH的GC-FID谱图(1.0 g油茶籽油通过10 g银渍硅胶SPE柱净化的结果)

  Figure 1.  Gas chromatography-flame ionization detector (GC-FID) chromatogram of mineral oil saturated hydrocarbon (MOSH) in a camellia seed oil(1.0 g of camellia seed oil purified by SPE with 10 g of Ag-silica gel)

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  通常，植物油中含有大量天然烷烃，它们是以奇数碳C₂₃～C₃₅为主的正构烷烃^[4]，图 1的MOSH宽峰上方的尖峰即为天然烷烃。由于这些尖峰影响MOSH的面积计算，需要通过SPE净化除去。

  3.1.2.   氧化铝

  Fiselier等认为经过350～400℃活化的氧化铝能够选择性吸附C₂₀以上的正构烷烃^[14]。为此，实验采用10 g银渍硅胶-10 g活化氧化铝净化1 g油茶籽油。结果表明，油茶籽油经过硅胶-氧化铝净化后，C₂₃～C₃₁正构烷烃被部分吸附，C₃₁以上的长碳链烷烃几乎完全除去(图 2)。同时，氧化铝对目标物矿物油也有少量吸附。采用10 g银渍硅胶-10 g活化氧化铝净化上述样品(4#)得到的矿物油含量为62.7 mg/kg，相比之下，矿物油损失了13.7%。矿物油是组成复杂，其测定方法具有特殊性，一般认为损失低于15%即可满足矿物油的分析要求^[4]。因此，氧化铝由于消除了天然烷烃的干扰作用，可以用于植物油的净化。

  图 2

  

  图 2  油茶籽油中MOSH的GC-FID谱图(1.0 g油茶籽油样品通过10 g银渍硅胶-10 g活化氧化铝SPE柱净化)

  Figure 2.  GC-FID chromatogram of MOSH in a camellia seed oil(1.0 g of camellia seed oil purified by SPE with 10 g Ag-silica gel-10 g of activated aluminum oxide)

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  由于SPE柱填料的用量与上样量、洗脱溶剂等密切相关，增加填料用量势必会增加试剂消耗和浓缩时间，从而增加了前处理工作量和污染风险^[16]。同时氧化铝对矿物油也有吸附，加大填料用量也会增加目标物的损失，因此，优化氧化铝用量就是要在消除干扰和准确分析之间找到一个平衡点。

  不同植物中的天然烷烃含量不尽相同，意味着氧化铝的用量可能不一样。本实验以烷烃含量较高的油茶籽油为例，以期为其他食用油的净化提供参考。为了考察氧化铝对烷烃的吸附容量，分别将20 μg C₇～C₄₀正构烷烃的混合标准溶液与50 μg液体石蜡混合，用正己烷定容至2 mL，制备得到考察氧化铝吸附容量的试液。然后分别用填有不同质量(0,5,10和20 g)的氧化铝SPE柱净化，以此考察氧化铝对烷烃的吸附能力以及液体石蜡回收率的影响，实验结果见图 3和图 4。

  图 3

  

  图 3  采用不同用量的活化氧化铝装填SPE柱净化烷烃的GC-FID谱图 (图中1~31代表n-C₁₀~n-C₄₀)

  Figure 3.  GC-FID chromatograms of n-alkanes purified by SPE with (0,5,10,20 g) activated aluminum oxide (No. 1~31: n-C₁₀~n-C₄₀)

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  图 4

  

  图 4  活化氧化铝对长链正构烷烃的吸附能力考察

  Figure 4.  Adsorption capacity of activated aluminum oxide for long chain n-alkanes

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  结果表明，氧化铝的用量与其吸附烷烃的能力呈正相关，即用量越大，吸附容量越高。以C₂₈为例，当氧化铝用量分别为5,10,20 g时，吸附的C₂₈分别达到42%,88%,99%。然而，氧化铝对不同碳数烷烃的吸附能力不同，碳链越长，吸附作用越强。由图 3和4可知：氧化铝对C₂₁以下的烷烃基本没有吸附；随着烷烃碳数的增加，氧化铝的吸附逐渐增强。10 g氧化铝对C₂₂～C₃₁的吸附量分别为2%,19%,43%,57%,72%,81%,88%,94%,97%和99%，对C₃₂～C₄₀基本完全吸附；当氧化铝用量达到20 g时，能够将10 g氧化铝没有完全吸附的C₂₈～C₃₁全部吸附。然而，提高氧化铝用量也会相应增加其对矿物油的吸附。5,10和20 g氧化铝吸附的液体石蜡分别为8%,23%和33%。此结果与文献^{[14, 15]}的氧化铝吸附容量结果完全一致。

  综上，由于氧化铝的吸附能力较弱，5 g氧化铝无法实现吸附大部分正构烷烃；10 g氧化铝则能够吸附绝大部分的碳数大于C₂₈的正构烷烃；20 g氧化铝虽然能够除去C₂₈以上的所有烷烃，但液体石蜡的损失也由23%升至33%。由于实际应用中可以容忍少量矿物油损失(15%以内)与部分烷烃的干扰,因此本实验选用10 g银渍硅胶-10 g活化氧化铝作为SPE柱填料，用于净化油茶籽油中的矿物油。

  4.   结 论

  建立了一种离线SPE结合LVI-GC-FID法测定油茶籽油中MOSH的方法，优化了SPE柱填料、净化条件与LVI-GC-FID分析条件。SPE柱的填料确定了以10 g银渍硅胶-10 g活化氧化铝，结果显示：油茶籽油经过硅胶-氧化铝净化，有效除去了甘油三酯、角鲨烯以及正构烷烃等干扰物，净化后的试样经浓缩注入LVI-GC-FID分析，其结果满足准确度和重复性等方法学考察要求。与在线联用的HPLC-GC-FID相比，离线SPE结合LVI-GC-FID的方法操作简单、成本低，适用于普通实验室对食用油中矿物油的检测。此外，分析了我国11个市售油茶籽油中矿物油的含量，结果为6.8～76.7 mg/kg，其中有4个样品的含量超过欧盟对食用油的限量规定了50 mg/kg。因此，做好食用油中矿物油的分析检测，对于保障我国食品安全具有现实意义。

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  17. [17]

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  Figure 1  Gas chromatography-flame ionization detector (GC-FID) chromatogram of mineral oil saturated hydrocarbon (MOSH) in a camellia seed oil(1.0 g of camellia seed oil purified by SPE with 10 g of Ag-silica gel)

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  Figure 2  GC-FID chromatogram of MOSH in a camellia seed oil(1.0 g of camellia seed oil purified by SPE with 10 g Ag-silica gel-10 g of activated aluminum oxide)

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  Figure 3  GC-FID chromatograms of n-alkanes purified by SPE with (0,5,10,20 g) activated aluminum oxide (No. 1~31: n-C₁₀~n-C₄₀)

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  Figure 4  Adsorption capacity of activated aluminum oxide for long chain n-alkanes

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  Table 1.  Recoveries and RSD of paraffin oil(n=6)

  分析物Analytes	添加浓度Spiked conc.(mg/kg)	样品含量Content in sample(mg/kg)	检出量Total found(mg/kg)	回收率Recovery(%)	相对标准偏差RSD(%)
  	25.0		60.1	97.2	4.9
  液体石蜡Paraffin oil	50.0	35.8	92.2	112.7	5.2
  	100.0		129.1	93.3	1.8

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  Table 2.  Analytical results of MOSH in commercial camellia seed oils

  样品Sample	MOSH(mg/kg)
  1#	61.1±1.2
  2#	33.3±1.0
  3#	27.0±0.3
  4#	62.7±2.8
  5#	61.2±2.8
  6#	38.7±2.3
  7#	76.7±5.2
  8#	6.8±1.0
  9#	9.0±2.1
  10#	35.8±0.6
  11#	35.9±0.5
  Mean value	37.4

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