溶解性有机质(Dissolved organic matter,DOM)是环境中一类重要的物质,能够为微生物提供营养和能量、介导微生物与氧化性物质之间的电子传递[1]、络合重金属[2]、以及吸附和增溶疏水性有毒有机物[3],在陆地和水生态系统中发挥着重要的功能,因此成为研究热点。DOM成分复杂,包含有蛋白质、多糖、氨基糖、核酸和腐殖质等多种物质,目前常用的分析方法包括紫外光谱[3]、荧光光谱[3, 4]、红外光谱[4, 5]和核磁共振[5]。上述方法中,荧光光谱由于具有样品预处理简单、分析所需样品量少、灵敏度高等诸多优点,成为研究DOM的最常用技术[6, 7]。
采用荧光光谱分析技术,可以将DOM分为不同类别的荧光组分[8]。然而,由于DOM是一大类组成和来源不同的混合物,其中许多物质存在结构相似的单元,不同物质的荧光图谱可能相互重叠,给采用荧光光谱精确分析DOM组成和结构增加了困难[9, 10]。为了降低DOM的异质性,减少不同荧光组分的重叠,研究者采用了一些数学方法如平行因子分析法[9]、主成分分析法[10]、自组织人工神经网络法[11, 12]和物理化学方法如色谱分离法[13]、树脂分离法[14],将DOM分成光谱图和理化特性各异的组分单元[10, 13]。在数学方法中,平行因子方法对DOM组分的分离效果最好、应用最广泛[9, 10],但平行因子分析涉及复杂的数学程序,且组分数目的确定受到样品数量的影响[10]。在物理化学分离法中,树脂分离需要调节pH值,一定程度上改变了DOM组分的存在状态,与天然实际环境中的DOM存在一定的差异;而色谱分离不需要调节pH值,能更好地反映DOM的实际分布情况和组分,但色谱分离所得组分数目也受诸多条件如洗脱液、洗脱方法等的影响[15, 16]。因此,将数学分析和色谱分离两种方法结合,充分利用两种分析方法各自的优点,可以更有效和全面地揭示DOM的组成特征,目前尚缺乏这方面研究相关报道。基于此,本研究结合荧光光谱、分子排阻色谱和平行分子分析法,将DOM按不同的特性分组,探究其组成和结构特性。本研究结果可为DOM表征和地球环境化学行为预测提供科学依据。
Multi N/C 2100型总有机碳分析仪(TOC,德国耶拿公司);F-7000型荧光光谱仪(日本日立公司);1200 LC高效液相色谱(美国安捷伦公司);L-530离心机(湖南长沙湘仪离心机仪器有限公司);SHA-C 水浴恒温振荡器(江苏金坛市金城国胜实验仪器厂)。HClO4、NaOH、Cu(NO3)2、Pb(NO3)2、CH3COONH4均为分析纯。实验用水为超纯水。
为了获得具有代表性的样品,在某生活垃圾填埋场,采集填埋年限不到1年的新鲜垃圾产生的渗滤液样品S1和和填埋年限大于10年的陈腐垃圾产生的渗滤液样品S2,12000 r/min 离心10 min后,收集上清液,过0.45 μm滤膜,收集滤液,滤液中有机物即为DOM。采用总有机碳分析仪测定DOM样品中溶解性有机碳(DOC)含量,备用。
将所得DOM样品的DOC调至6 mg/L后,测定样品的荧光光谱:PTM电压700 V,激发和发射波长狭缝宽5 nm,激发波长200~400 nm,发射波长280~500 nm,激发和发射波长增量5 nm,扫描速度2400 nm/min。
分子排阻色谱采用配有荧光检测器的1200 LC系统进行,所用分离柱和保护柱分别为 PL aquage1-OH (50 mm × 7.5 mm,8 μm) 和MIXED-M (300 mm × 7.5 mm,8 μm)(美国安捷伦公司),洗脱液为pH=7的醋酸铵缓冲液,进样量100 μL,洗脱速度1 mL/min。检测器为激发/多波段发射波长的荧光检测器,激发波长230 nm,发射波长300~500 nm,发射波长增量为1 nm。
DOM三维荧光光谱的平行因子分析需要多个样品,为了获得多个样品,制备DOC为6 mg/L的DOM样品S1和S2 各18份,采用荧光猝灭滴定方法,分别加入Cu(NO3)2或Pb(NO3)2溶液,使DOM样品中Cu2+或Pb2+的浓度依次为10,20,30,40,50,60,70,80和90 μmol/L,将样品在恒温振荡器上振荡 4 h后,测定其三维荧光光谱,测定条件与DOM未加重金属时2.3节中的条件相同。将上述光谱数据扣除超纯水光谱后导出,进行平行因子分析。平行因子分析方法如下:将样品S1或S2的19种重金属离子浓度为0~90 μmol/L三维荧光光谱数据矩阵,在MATLAB 2007上,采用的DOMFluor toolbox数据包(www.models.life.ku.dk)进行分析。首先是将DOM三维荧光光谱图去除一次瑞利散射和二次瑞利散射,随后经异常值检验、对半分析、核一致性分析、累计方差和分析及视觉检验[3, 9, 10],确定样品S1和S2可以各分离出4种不同的荧光组分,将所得组分在MATLAB上制图。
比较DOM经分子排阻色谱和平行因子分析所得组分数目和激发、发射波长,确定两种分离方法所得组分的异同。
图 1为DOM的三维荧光光谱,样品S1在发射波长小于380 nm的区域具有较高的荧光强度,而样品S2在发射波长大于380 nm的区域具有较高的荧光强度,综合文献[17~20]可知,发射波长小于380 nm的区域为类蛋白物质,包括类色氨酸物质(发射波长小于325 nm)和类酪氨酸物质(发射波长大于 325 nm)。一些与类色氨酸结构类似的多酚化合物,也在发射波长小于380 nm范围内产生荧光峰[21],这些物质与类蛋白物质具有一个共同的特点,即均含有一个苯环结构。三维荧光光谱中发射波长大于380 nm的为类腐殖质物质,这些物质含有两个及以上的苯环结构,在类腐殖质物质中,一些带有3个和4个苯环的物质,发射波长可能相同[22]。因此,可以推测,样品S1主要为类蛋白物质,而样品S2以类腐殖质物质为主,两个样品代表了两类不同的DOM组成。在DOM中,不同荧光组分的荧光图谱可能相互重叠[10, 23];此外,类蛋白物质可以以3种形态存在,包括多肽/氨基酸形态、腐殖质结合态和大分子蛋白质形态[8],但图 1不能给出上述信息,需要采用物理和数学法对DOM荧光组分进行分离。
分子排阻色谱主要是基于分子量大小不同将DOM分组,在分子排阻色谱中,大分子有机物先被洗脱出来,而出峰时间晚的为小分子有机物[15, 16],通过洗脱时间可以将DOM按分子量大小分为不同的组分。由于DOM是一大类有机分子的混合体,不同分子之间可以通过疏水作用、氢键和范德华力结合在一起成为大分子复合物,因此本研究中的大分子应为不同小分子通过一定作用力结合在一起的聚集体。在图 1中,由于激发波长230 nm,发射波长300~500 nm处的组分荧光强度较高,并且能代表所有的荧光物质,因此,在分子排阻色谱中,固定荧光检测器的激发波长为230 nm、发射波长为300~500 nm、增量为1 nm进行洗脱物荧光发射光谱测定。图 2a显示出样品S1含有4类物质,其出峰时间依次约为3.45,3.9,4.45和4.65 min,以4.45 min出峰处物质的荧光强度最高,显示样品S1含有4类分子量大小不同的物质,其浓度最高的为小分子有机物。从图 2a还可见,3.45和4.65 min主要出现发射波长小于380 nm的荧光峰,而3.9和4.45 min在300~500 nm范围内均都出现了荧光峰,显示3.45和4.65 min 处的组分主要为大分子蛋白质和小分子多肽/氨基酸形态存在的类蛋白物质,而3.90和4.45 min处的组分主要为与腐殖质结合在一起的类蛋白物质[8],并且其分子量小于蛋白质分子但大于氨基酸/多肽物质。样品S2(图 2b)在3.30和3.85 min处出现了两个荧光峰,最大峰强出现在3.85 min,出峰范围为300~500 nm,显示其为类腐殖质物质。此外,在整个分离过程中,样品S1和S2均在发射波长325~375 nm范围内均出现了较强的荧光强度,其究竟是由类蛋白物质引起,还是噪声引起,还需要进一步鉴定。本研究采用色谱柱分离法与树脂分离类似,它们均能降低混合物的异质性, He 等[14]采用XAD-8大孔吸附树脂将DOM分类出了不同亲疏水组分,但是这种分离方法基于pH值调整到酸性范围后DOM分子上极性官能团的差异,而本研究采用色谱分离,是基于分析物分子量大小的差异进行分离。
图 3为样品S1经平行因子分析所得的4个组分。组分1有两个荧光峰,其激发波长为230 nm,发射波长为280/340 nm;组分2也有两个荧光峰,其激发波长分别为230和280 nm,发射波长位于325~340 nm范围内,以上两个组分在发射波长大于380 nm范围内也存在较强的荧光发射。由文献[8]可知,组分1和2为腐殖质结合态存在的类蛋白物质;组分3有一个尖峰和一个肩峰,其激发波长分别为230和250 nm,发射波长均为300 nm,属于类色氨酸物质;组分4有3个荧光峰,其激发波长分别为220,250和315 nm,发射波长均为 425 nm,属于类腐殖质物质[7]。组分1和2对应于样品S1分子排阻色谱中3.90和4.45 min出峰的物质,均为腐殖质结合态存在的类蛋白物质[8];组分3对应于样品S1分子排阻色谱中3.45和4.65 min出现的类蛋白物质[17],但组分4在分子排阻色谱中没有对应的物质,其是否为实际组分还不得而知。
如图 4所示,样品S2经平行因子分析得到4个组分,其中组分1有两个荧光峰,其激发波长分别为240和320 nm,发射波长为410 nm,参照文献[8],组分1为类腐殖质物质;组分2也有两个荧光峰,其激发波长分别为235和280 nm,发射波长在335~375 nm范围内,为类蛋白物质[17];组分3含有3个荧光峰,其激发波长分别为225、280和360 nm,发射波长为440 nm,为类腐殖质物质[17];组分4含有两个荧光峰,其激发波长均为225 nm,而发射波长不同,此类物质尚未见到相关报道。与样品S2的分子排阻色谱相比,组分1对应于分子排阻色谱中的3.85 min的类腐殖质物质,组分2和3在样品S2的分子排阻色谱中并未见对应的物质,组分4在样品S2的色谱图中一直存在,显示分子排阻色谱中发射波长325~375 nm范围内均出现的荧光强度对应于某种物质,可能为3.3 min出现的类蛋白物质。
对比DOM经分子排阻色谱和平行因子分析所得的组分发现,二者既有相同之处,有互相对应的物质,又有不同之处,显示物理分离和数学分离各有各自的优缺点。由于不同有机分子之间可能通过疏水作用、氢键和范德华力结合在一起[15, 24],因此,分子排阻色谱并不能将所有分子分开;相比较而言,平行因子分析可以将这些组分分开而不受到上述作用力的影响。但是很多情况下,平行因子分析并不能有效揭示两种物质之间是共存关系还是单独存在;此外,平行因子分析不能区分以大分子蛋白质形态存在和小分子多肽/氨基酸形态存在的两种类蛋白物质,因此,将分子排阻色谱和平行因子分析联用可以更加全面表征DOM组成情况,减少其复杂性和异质性。
分子排阻色谱能有效分析DOM中不同物质的分子量及其形态,可以将DOM分为小分子多肽/氨基酸、中等分子的腐殖质以及大分子蛋白质;平行因子分析可鉴别分子排阻色谱中未分开的组分,并且能给出不同组分激发/发射波长的详细信息,但平行因子分析不能分开蛋白质和氨基酸/多肽形态的类蛋白物质。结果表明,荧光光谱结合平行因子分析和分子排阻色谱,能有效、全面地表征DOM的组成。
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Figure 1 Fluorescence excitation-emission matrix spectra of dissolved organic matter (DOM)obtained from fresh (a) and old (b) landfill leachates
Figure 2 Size exclusion chromatography of DOM obtained from fresh (a) and old (b) landfill leachates
Figure 3 Fluorescence spectra of component 1 (a),component 2 (b),component 3 (c) and component 4 (d) identified by parallel factor analysis in sample S1
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