图 1
RRS光谱
Figure 1.
RRS spectra
引用本文:
李俊波, 杨小丽, 常宏宏, 魏文珑. 钯(Ⅱ)-盐酸二甲双胍-曙红Y缔合体系的共振瑞利散射、二级散射和倍频散射光谱及分析应用[J]. 化学通报,
2017, 80(8): 783-788.
Citation: Li Junbo, Yang Xiaoli, Chang Honghong, Wei Wenlong. Resonance Rayleigh Scattering, Second-order Scattering and Frequency Doubling Scattering Spectra of Pd(Ⅱ)-MFH-EY System and Their Analytical Application[J]. Chemistry, 2017, 80(8): 783-788.
Citation: Li Junbo, Yang Xiaoli, Chang Honghong, Wei Wenlong. Resonance Rayleigh Scattering, Second-order Scattering and Frequency Doubling Scattering Spectra of Pd(Ⅱ)-MFH-EY System and Their Analytical Application[J]. Chemistry, 2017, 80(8): 783-788.
钯(Ⅱ)-盐酸二甲双胍-曙红Y缔合体系的共振瑞利散射、二级散射和倍频散射光谱及分析应用
摘要:
在pH3.5的HAc-NaAc缓冲介质中，盐酸二甲双胍（MFH）与Pd（Ⅱ）形成阳离子螯合物，它能进一步与酸性染料曙红Y（EY）的阴离子反应，形成离子缔合物。三元离子缔合物的生成将引起共振瑞利散射（RRS）、二级散射（SOS）和倍频散射（FDS）光谱显著增强，其最大散射波长分别位于292、540和327 nm。在一定范围内，三种散射信号的增强（ΔIRRS，ΔISOS和ΔIFDS）均与MFH的浓度呈线性关系。方法具有较高的灵敏度，RRS、SOS和FDS法对MFH的检出限（3σ）分别为1.7、13.2和22.7 ng·mL-1。考察了适宜的反应条件和共存物质的影响，结果表明该方法选择性良好。探讨了缔合物生成及散射增强的机理。据此，提出了简便、快速、准确且高灵敏度的测定痕量MFH的光散射新方法，并应用于片剂和尿样中MFH的测定，结果满意。
English
Resonance Rayleigh Scattering, Second-order Scattering and Frequency Doubling Scattering Spectra of Pd(Ⅱ)-MFH-EY System and Their Analytical Application
Abstract:
In pH 3.5 HAc-NaAc buffer medium, metformin hydrochloride(MFH) reacted with palladium(Ⅱ) (Pd(Ⅱ)) to form chelate cation, which further reacted with eosin Y (EY) to form the ternary ion-association complexes [Pd·MFH] (EY)2, and the spectra of the system were recorded with synchronous scanning at λem=λex (Δλ=0nm). The intensities of resonance Rayleigh scattering (RRS), second-order scattering (SOS) and frequency doubling scattering (FDS) were enhanced greatly and new scattering spectra appeared. The maximum RRS, SOS and FDS wavelengths of three ion-association complexes were located at 292nm, 540nm and 327nm, respectively. The increments of scattering intensity (ΔIRRS, ΔISOS and ΔIFDS) were directly proportional to the concentration of MFH in certain ranges. The detection limits (3σ) of Pd(Ⅱ)-MFH-EY system were 1.7ng·mL-1 (RRS method), 13.2ng·mL-1 (SOS method) and 22.7ng·mL-1 (FDS method), separately. The optimum conditions of RRS method and the influence factors were discussed, in addition, the structure of ion-association complex and the reaction mechanism were investigated. Based on the ion-association reaction and its spectral response, the rapid, simple and sensitive RRS method for the determination of MFH had been developed. It had been applied to the determination of MFH in tablets and urine samples with satisfactory results.
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盐酸二甲双胍(Metformin hydrochloride，简称MFH)是非胰岛素依赖型糖尿病患者控制血糖的一线药物。主要通过增强外周胰岛素靶组织对葡萄糖的利用、降低机体对胰岛素的抵抗性、增加其敏感性来达到降糖的目的[1]。近年来的研究表明，MFH除降糖作用外，还对心血管有保护作用，可抑制动脉粥样硬化，改善糖尿病患者的内皮细胞功能[2]。目前，测定MFH的方法主要有电位滴定法[3]、紫外分光光度法[4]、毛细管电泳法[5]、高效液相色谱法[6]、电化学法[7]以及色谱-质谱联用方法[8]等。上述方法中，滴定分析法和分光光度法操作简便，但是对于痕量样品测定准确度、灵敏度较差；高效液相色谱法需要对样品进行前处理并大量使用有机溶剂，操作繁琐、分析时间较长；色谱-质谱联用法仪器设备昂贵，操作要求和运行成本高；其他分析方法在简便性、灵敏度等方面也都存在一些不足之处。因此，发展简便、快速、高灵敏度测定MFH的新方法，对于研究药物作用机制、药物剂型、体内代谢过程、毒副作用等具有重要意义。
共振瑞利散射(RRS)、二级散射(SOS)和倍频散射(FDS)由于其操作简便、灵敏度高，正受到越来越多的研究与关注。目前它们已应用于药物[9~11]、生物大分子[12~14]、无机离子[15]、金属离子[16]等的测定。近年来，利用配位反应形成离子缔合物并对其RRS、SOS和FDS光谱进行研究展现了广阔的应用前景[17, 18]。本文研究了在pH3.5的HAc-NaAc缓冲介质中，MFH与Pd(Ⅱ)阳离子螯合物与酸性染料曙红Y(Eosin Y，简称EY)的反应及离子缔合物的形成对RRS、SOS和FDS光谱的影响，因MFH浓度与散射信号的增强在一定范围内呈线性关系，这一体系可用于痕量MFH的测定。
1 实验部分
1.1 试剂与仪器
Hitachi F-4600型荧光分光光度计(日本日立公司)，测定参数：RRS法狭缝宽度5.0nm，SOS和FDS法狭缝宽度10.0nm；TU-1901型紫外-可见分光光度计(北京普析通用公司)；pHS-3C型酸度计(上海精密科学仪器有限公司)。
MFH对照品(中国食品药品检定研究院)；PdCl2(国药集团化学试剂有限公司)；EY(天津市科密欧化学试剂有限公司)；盐酸二甲双胍片(北京中惠药业有限公司，规格：0.25g·片-1)。所用试剂均为分析纯级。实验用水为超纯水。
pH3.5的HAc-NaAc缓冲溶液的配制：0.2mol·L-1的HAc和NaAc溶液按照一定比例混合，并用酸度计测定其pH。
1.2 实验方法
在10.0mL比色管中依次加入适量的10μg·mL-1 MFH溶液、1.5mL pH3.5的HAc-NaAc缓冲溶液、0.1mL 2×10-3mol·L-1的PdCl2溶液及0.8mL 2.5×10-4mol·L-1的EY溶液，用水稀释至刻度，摇匀，静置10min后，在荧光分光光度计上以λex=λem进行同步扫描，记录RRS光谱，并在最大散射波长处测定离子缔合体系和试剂空白的散射强度IRRS和IRRS0(ΔIRRS=IRRS-IRRS0)。同时将上述溶液在荧光分光光度计上以λex=1/2λem和λex=2λem进行扫描，记录SOS和FDS光谱，并在各自的最大散射波长处测定离子缔合体系和试剂空白的散射强度：ISOS、IFDS和ISOS0、IFDS0(ΔI=I-I0)。
2 结果与讨论
2.1 RRS光谱
图 1为Pd(Ⅱ)-MFH-EY体系的RRS光谱。由图 1(a)可见，Pd(Ⅱ)、MFH和EY自身的RRS均十分微弱，但当三者发生反应形成离子缔合物后，体系的RRS光谱显著增强，最大散射波长位于292nm处。由图 1(b)可知，在一定范围内，最大散射波长处的RRS强度随MFH浓度增大而呈线性增强。因此该反应可用于MFH的定量测定。
图 1
RRS光谱
Figure 1.
RRS spectra
2.2 SOS光谱和FDS光谱
反应体系的SOS和FDS光谱如图 2和图 3所示。在优化条件下，Pd(Ⅱ)、MFH和EY自身的SOS和FDS强度均很弱，而当三者反应形成缔合物后，溶液的SOS和FDS光谱显著增强，最大散射峰(λex/λem)分别位于270/540nm(SOS，图 2(a))和654/327nm(FDS，图 3(a))处。由图 2(b)和图 3(b)可见，在最大SOS和FDS波长处，体系的ISOS和IFDS与MFH的浓度呈良好的线性关系。因此，SOS和FDS法均可用于痕量MFH的测定。
图 2
SOS光谱
Figure 2.
SOS spectra
图 3
FDS光谱
Figure 3.
FDS spectra
2.3 反应条件的优化
2.3.1 反应介质及用量
考察了HAc-NaAc、HCl-NaAc和B-R缓冲溶液对体系散射强度的影响。结果表明，在pH3.0~4.0范围内，使用HAc-NaAc缓冲溶液时，体系的散射强度较大，方法有较高灵敏度。故试验选取pH3.5的HAc-NaAc缓冲溶液作为反应介质，用量为1.5mL。
2.3.2 Pd(Ⅱ)浓度的影响
考察了Pd(Ⅱ)浓度对散射强度的影响。结果表明，Pd(Ⅱ)的适宜浓度范围在1.0×10-5~3.0×10-5mol·L-1范围内，此时体系的ΔIRRS达到最大且基本稳定，而浓度过低或过高均会导致ΔIRRS降低。实验选择的Pd(Ⅱ)浓度为2.0×10-5mol·L-1。
2.3.3 EY浓度的影响
考察了EY浓度对散射强度的影响。结果表明，随着EY浓度增大，Pd(Ⅱ)-MFH与EY之间的反应逐渐完全，ΔIRRS逐渐增大。EY浓度在1.3×10-5~3.2×10-5 mol·L-1范围内，体系的ΔIRRS达到最大且基本稳定。EY浓度继续增大，则IRRS0增大，导致ΔIRRS降低。实验中选择的EY浓度为2.0×10-5mol·L-1。
2.3.4 离子强度的影响
通过向体系内加入不同体积的1.0mol·L-1的NaCl溶液，考察了离子强度对散射强度的影响。结果表明，当NaCl浓度低于0.02mol·L-1时，散射强度变化不大，但继续增大NaCl浓度，ΔIRRS迅速降低。可能是由于大量的Na+和Cl-会对三元离子缔合反应产生竞争作用，不利于离子缔合物的形成，这也证明了反应的主要作用力是静电引力。因此，反应体系应避免高浓度强电解质的加入。
2.3.5 反应时间及体系稳定性
在适宜的反应条件下，体系在10min内反应完全，散射强度达到最大，此后至少可稳定2h，可见该体系具有良好的稳定性。
2.4 标准曲线
在优化的反应条件下，测定了不同浓度MFH与EY形成离子缔合物的ΔIRRS、ΔISOS和ΔIFDS，并对MFH的浓度进行线性回归。标准曲线的回归方程、线性范围、相关性系数及方法检出限(3σ)见表 1。可以看出，3种方法的灵敏度均较高，检出限分别为1.7(RRS)、13.2(SOS)和22.7(FDS) ng·mL-1。
表 1
标准曲线相关参数与方法检出限
Table 1.
Related parameters for calibration curves
方法 线性回归方程
/(μg·mL-1)线性范
/(μg·mL-1)r 检出限
/(ng·mL-1)RRS ΔI=146.2+581.6c 0.012~2.5 0.9999 1.7 SOS ΔI=51.5+1928.6c 0.17~2.5 0.9989 13.2 FDS ΔI=-14.4+65.8c 0.23~2.5 0.9988 22.7 2.5 缔合物的形成及其散射增强的原因
2.5.1 离子缔合物的形成
实验采用摩尔比法和等摩尔连续变化法测定了三元离子缔合物的组成比为Pd(Ⅱ):MFH:EY=1:1:2。采用量子化学密度泛函法(B3LYP/3-21G)计算了MFH及EY-的静电势和基态电荷分布(图 4、图 5，蓝色表示正电，红色表示负电)。
图 4
MFH分子的静电势和电荷分布
Figure 4.
Electrostatic potential diagram and selected atomic charges of MFH
图 5
EY-分子的静电势和电荷分布
Figure 5.
Electrostatic potential diagram and selected atomic charges of EY-
由图 4可以看出，N4和N7的电荷密度最高，分别为-1.060和-0.731。在反应条件下，MFH先与Pd(Ⅱ)反应形成六元环状的螯合阳离子，即[Pd·MFH]2+。而在不同酸度的水溶液中，EY可能以H3L+、H2L、HL-和L2-四种形式存在。当pH为3.5时，根据EY的解离常数计算可知[19]，在实验条件下，EY的主要存在形式为一价阴离子HL-。从理论上讲，EY分子中的羟基或羧基离解均可得到HL-。如果不含强吸电子基，则羧基先于羟基离解，但是由于在呫吨环上羟基的邻位引入了Br，它们对于羟基有强烈的吸电子作用，使羟基氧原子上的电子云密度下降，使得其比苯基上的羧基更易解离，因此EY主要发生的是羟基解离。从图 5中也可以看出，EY发生羟基解离后生成的氧负离子可以与相连的苯环发生p-π共轭，负电荷主要集中在羰基氧上。EY-能与[Pd·MFH]2+在静电引力和疏水作用力下结合形成电中性的离子缔合物[Pd·MFH] (EY)2(图 6)。
图 6
缔合物的结构
Figure 6.
The construction of the ion-association complex
2.5.2 红外光谱分析
MFH、EY、Pd(Ⅱ)-MFH-EY物理混合物和Pd(Ⅱ)-MFH-EY反应体系的红外光谱如图 7所示。从图中可以看到，物理混合物的红外谱是反应物MFH和EY红外谱图的简单叠加，谱线(c)中的主要吸收峰均可以在(a)或(b)中找到对应吸收，而(d)则与(a)、(b)和(c)完全不同，说明缔合体系并非反应物的简单混合，有缔合反应发生。对比(b)和(d)发现，谱线(b)中对应酚羟基摇摆振动的特征吸收峰1092cm-1(γO—H)和1243cm-1(βO—H)在(d)中消失，而(b)中对应羧基O—H摇摆振动的特征吸收峰1351cm-1在(d)中可以找到相应吸收(1347cm-1)，这进一步说明了反应过程中是酚羟基发生了解离。
图 7
红外光谱图
Figure 7.
IR spectra
2.5.3 离子缔合物纳米微粒的形成及散射增强
反应生成的缔合物呈电中性，并且结构中的EY存在大的芳环，因此具有较强的疏水性。在水相的挤压作用和范德华力的共同作用下，离子缔合物相互靠近并聚集形成粒径较大的聚集产物，从透射电镜图(图 8) 可以看出，离子缔合物不是以单分子形式存在，而是以平均粒径为20nm左右的球形纳米微粒存在。此纳米微粒的形成，导致引起散射的微粒体积显著增大。同时由于散射位于分子吸收带中，产生了散射-吸收-再散射的共振增强效应。由于纳米微粒呈电中性，可与水相形成固液界面，从而引起表面增强的散射效应，导致散射强度增加。共振瑞利散射效应、表面增强散射效应和分子体积增大是引起散射信号增强的主要原因。
图 8
Pd(Ⅱ)-MFH-EY缔合体系的透射电镜图
Figure 8.
TEM image of Pd(Ⅱ)-MFH-EY
3 方法的选择性及分析应用
3.1 方法的选择性
以灵敏度最高的RRS法为例，考察了20余种共存物质对测定的影响，结果列于表 2。可见，在相对误差≤±5%范围内，常见的盐类、氨基酸、淀粉、糖类等物质对MFH的测定干扰较小，表明方法选择性良好，可用于实际样品中MFH的测定。
表 2
共存物质的影响
Table 2.
Effects of coexisting substances [cMFH=1.0μg/mL]
共存物质 浓度
/(μg/mL)相对误差/% 共存物质 浓度
/(μg/mL)相对误差/% BaCl2 110 -1.6 β-CD 65 2.1 CaCl2 58 3.1 Sucrose 108 -3.9 MgCl2 125 3.5 Glucose 178 3.3 NH4Cl 29 -4.7 Urea 60 2.6 KCl 89 -3.9 Lactose 68 0.8 FeCl3 50 0.4 BSA 56 2.9 KBr 69 3.2 HSA 78 4.5 NaNO3 236 1.0 Starch 87 2.7 ZnSO4 125 2.8 Threonine 37 1.9 CuSO4 187 2.7 Glycine 36 2.0 Al2(SO4)3 230 2.1 DL-Arginine 59 -3.7 3.2 分析应用
3.2.1 片剂中MFH的测定
取20片MFH(规格0.25g/片)，称重后粉碎，准确称取适量(约相当于MFH 100mg)，置100mL容量瓶中，加水适量，超声处理使之溶解，加水稀释至刻度，摇匀，滤过。量取续滤液10mL至100mL容量瓶中，加水定容后振摇。将10mL此样品移至100mL容量瓶中加水定容，振荡摇匀得到被测样品。取被测液1mL，测定MFH含量，将测定结果与药典[3]规定项下方法比较，结果见表 3。
表 3
片剂中MFH含量的测定结果
Table 3.
Determination results of MFH in tablets (n=5)
方法 标示量
/(g/片)测得值
/(g/片)平均值
/(g/片)RSD
/%RRS 0.250 0.253、0.246、0.251、0.249、0.253 0.250 1.2 CP1 method 0.250 0.252、0.248、0.253、0.259、0.249 0.252 1.7 注：1CP-中国药典 3.2.2 尿样中MFH含量的测定
取正常人尿样15份，过滤除去杂质，稀释10倍，备用。在3支比色管中各加入1.0mL稀释尿样、1.5mL pH3.5的HAc-NaAc缓冲溶液、0.1mL 2×10-3mol·L-1的PdCl2溶液及0.8mL 2.5×10-4 mol·L-1的EY溶液，按实验方法测定MFH含量，并用标准加入法测定回收率，结果列于表 4。
表 4
人尿样中MFH含量的测定结果
Table 4.
Determination results of MFH in urine samples (n=5)
样品 测得值
/(μg·mL-1)加入量
/(μg·mL-1)测定值
/(μg·mL-1)RSD
/%回收率
/%尿样1 ND 1.0 0.989、1.023、1.052、0.994、1.014 2.5 101.4 尿样2 ND 1.5 1.479、1.521、1.493、1.532、1.483 1.6 100.1 尿样3 ND 2.0 2.056、1.983、2.005、1.992、2.014 1.4 100.5 ND:未检出 从表 3和表 4可以看出，该方法应用于片剂和尿样中MFH的测定，相对标准偏差(RSD)为1.2%~2.5%，回收率在100.1%~101.4%之间，方法具有较好的重现性和准确度，检测结果与药典方法基本一致，说明该方法可用于实际样品的测定。
4 结论
在pH 3.5的HAc-NaAc缓冲介质中，MFH与Pd(Ⅱ)形成阳离子螯合物，它能进一步与酸性染料EY的阴离子反应，形成离子缔合物。离子缔合物的形成导致RRS、SOS和FDS光谱的显著增强，且MFH浓度与散射信号的增强在一定范围内呈线性关系，可用于痕量MFH的测定。其中，RRS法对MFH的检出限低至1.7ng·mL-1。本文的方法可应用于片剂和尿样中MFH的测定，取得满意的结果。
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图 1 RRS光谱
Figure 1 RRS spectra
(a) 1：Pd(Ⅱ)；2：EY；3：MFH-EY；4：Pd(Ⅱ)-EY；5：Pd(Ⅱ)-MFH；6：Pd(Ⅱ)-MFH-EY。cPd(Ⅱ)=2×10-5mol·L-1，cMFH= 1.5μg·mL-1，cEY=2×10-5mol·L-1，pH3.5；(b) Pd(Ⅱ)-MFH-EY，cMFH (1~5)：0.5，1.0，1.5，2.0，2.5μg·mL-1；cPd(Ⅱ)=2×10-5mol·L-1，cEY=2×10-5mol·L-1；pH3.5
图 2 SOS光谱
Figure 2 SOS spectra
(a)1：MFH，2：EY，3：Pd(Ⅱ)，4：Pd(Ⅱ)-MFH-EY。cPd(Ⅱ)= 2×10-5mol·L-1，cMFH=1.5μg·mL-1，cEY=2×10-5mol·L-1，pH3.5；(b) Pd(Ⅱ)-MFH-EY，cMFH (1~5): 0.5，1.0，1.5，2.0，2.5μg·mL-1；cPd(Ⅱ)=2×10-5mol·L-1，cEY= 2×10-5 mol·L-1；pH3.5
图 3 FDS光谱
Figure 3 FDS spectra
(a) 1：MFH，2：EY，3：Pd(Ⅱ)，4：Pd(Ⅱ)-MFH-EY。cPd(Ⅱ)=2×10-5mol·L-1，cMFH=1.5μg·mL-1，cEY= 2×10-5mol·L-1，pH3.5；(b) Pd(Ⅱ)-MFH-EY，cMFH (1~4): 1.0，1.5，2.0，2.5μg·mL-1；cPd(Ⅱ)= 2×10-5 mol·L-1，cEY=2×10-5mol·L-1；pH3.5
图 4 MFH分子的静电势和电荷分布
Figure 4 Electrostatic potential diagram and selected atomic charges of MFH
图 5 EY-分子的静电势和电荷分布
Figure 5 Electrostatic potential diagram and selected atomic charges of EY-
图 7 红外光谱图
Figure 7 IR spectra
(a) MFH，(b) EY，(c) Pd(Ⅱ)-MFH-EY物理混合物, (d) Pd(Ⅱ)-MFH-EY反应体系
表 1 标准曲线相关参数与方法检出限
Table 1. Related parameters for calibration curves
方法 线性回归方程
/(μg·mL-1)线性范
/(μg·mL-1)r 检出限
/(ng·mL-1)RRS ΔI=146.2+581.6c 0.012~2.5 0.9999 1.7 SOS ΔI=51.5+1928.6c 0.17~2.5 0.9989 13.2 FDS ΔI=-14.4+65.8c 0.23~2.5 0.9988 22.7 
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表 2 共存物质的影响
Table 2. Effects of coexisting substances [cMFH=1.0μg/mL]
共存物质 浓度
/(μg/mL)相对误差/% 共存物质 浓度
/(μg/mL)相对误差/% BaCl2 110 -1.6 β-CD 65 2.1 CaCl2 58 3.1 Sucrose 108 -3.9 MgCl2 125 3.5 Glucose 178 3.3 NH4Cl 29 -4.7 Urea 60 2.6 KCl 89 -3.9 Lactose 68 0.8 FeCl3 50 0.4 BSA 56 2.9 KBr 69 3.2 HSA 78 4.5 NaNO3 236 1.0 Starch 87 2.7 ZnSO4 125 2.8 Threonine 37 1.9 CuSO4 187 2.7 Glycine 36 2.0 Al2(SO4)3 230 2.1 DL-Arginine 59 -3.7
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表 3 片剂中MFH含量的测定结果
Table 3. Determination results of MFH in tablets (n=5)
方法 标示量
/(g/片)测得值
/(g/片)平均值
/(g/片)RSD
/%RRS 0.250 0.253、0.246、0.251、0.249、0.253 0.250 1.2 CP1 method 0.250 0.252、0.248、0.253、0.259、0.249 0.252 1.7 注：1CP-中国药典
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表 4 人尿样中MFH含量的测定结果
Table 4. Determination results of MFH in urine samples (n=5)
样品 测得值
/(μg·mL-1)加入量
/(μg·mL-1)测定值
/(μg·mL-1)RSD
/%回收率
/%尿样1 ND 1.0 0.989、1.023、1.052、0.994、1.014 2.5 101.4 尿样2 ND 1.5 1.479、1.521、1.493、1.532、1.483 1.6 100.1 尿样3 ND 2.0 2.056、1.983、2.005、1.992、2.014 1.4 100.5 ND:未检出
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