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• 近年来，受实验条件和资金等条件的限制，利用计算模拟的方法来研究分子间的相互作用越来越受到人们的重视。目前，分子模拟与光谱技术相结合，已广泛用于研究小分子污染物和生物大分子的毒性作用，并共同阐明人体内毒性或副作用的分子机制^{[1, 2]}。

  多溴联苯醚(Polybrominated diphenyl ethers，PBDEs)作为一种性能优异的溴代阻燃剂，广泛用于电脑等电子电器产品中，因其具有较强的生物毒性和生物蓄积性而逐渐被人们所关注^[3]。研究表明，其羟基化衍生物^{[4, 5]}羟基多溴联苯醚(Hydroxylated polybrominated diphenyl ethers，OH-PBDEs)具有比母体PBDEs更大的毒性，例如甲状腺激素毒性^{[2, 6, 7]}、神经毒性^{[8, 9]}、雌激素毒性^{[10, 11]}等。人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)是人血浆中含量最为丰富的载体蛋白质，具有维持血浆渗透压、调节血液pH等作用，能存储、转运各种内源性、外源性物质，因此常被选为模型蛋白研究蛋白质与小分子的相互作用^[12]。目前，已有很多研究学者对OH-PBDEs的分布情况^[13]、环境毒理学、生物效应^[14]、动物毒性^[11]及海洋环境污染等方面进行了研究，但对其在人体内的相互作用，特别是OH-PBDEs与血清蛋白的结合研究甚少^[15]，作用机制也尚未明确。

  本文采用分子对接和光谱法研究了4-羟基-2,2’,3,4’-四溴二苯醚(4-OH-BDE-42) 与HSA的相互作用，并利用GROMACS 4.6.5程序的MM-PBSA方法计算两者之间的结合自由能。这对于探索小分子污染物4-OH-BDE-42与HSA的作用机制具有重大意义，可为4-OH-BDE-42的环境风险评估提供更多的参考信息。

  图 图式1  4-OH-BDE-42的化学结构 Figure 图式1.  Chemical structure of 4-OH-BDE-42

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  1   实验部分

  1.1   仪器与试剂

  日立F-4600荧光光谱仪(日本Hitachi)；RF-5301PC型荧光光度计(含配套恒温装置，日本岛津)；TU-1901型双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)。

  4-OH-BDE-42(美国AccuStandard公司)，人血清白蛋白(美国Sigma公司)，华法林、布洛芬等其他所用试剂均为分析纯，实验用水均为二次蒸馏水。

  以pH 7.40 Tris-HCl缓冲溶液配制浓度为1.0×10^-5mol·L^-1的HSA贮备液和1.0×10^-6mol·L^-1的4-OH-BDE-42贮备液，置于4℃以下冰箱保存备用。

  1.2   计算模拟

  HSA的晶体结构(PDB ID：1AO6) 来自Brookhaven蛋白质数据库(http://www.rcsb.org/pdb)。采用Sybyl-X 1.3软件对蛋白与小分子进行分子对接。将分子对接中最优的结果导入GROMACS 4.6.5软件进行20ns的分子动力学模拟，然后用MM-PBSA方法对4-OH-BDE-42-HSA体系的结合自由能进行分析计算^[16]。

  1.3   荧光光谱

  在298K下，分别测定HSA与4-OH-BDE-42-HSA混合物的三维荧光光谱。激发波长200～400 nm，发射波长为200～450 nm，步长和狭缝均为5nm。

  在一系列10mL的比色管中，分别加入1mL HSA储备液(HSA的最终浓度为1.0×10^-6mol·L^-1)和不同体积的4-OH-BDE-42储备液，用Tris-HCl缓冲溶液定容。于291、298、310 K三个温度下恒温5min，以280nm为激发波长，激发和发射荧光狭缝宽度均为5.0nm，测定体系在290～450 nm波长范围的荧光光谱。

  2   结果与讨论

  2.1   分子对接模型

  分子对接可以直接揭示污染物小分子与靶点之间的相互作用，也可为构效关系的研究提供最为合理的活性构象。为探讨4-OH-BDE-42在HSA结合空腔的可能结合模式，首先，本研究以华法林和布洛芬为探针，通过竞争实验确定小分子与蛋白的结合区域。研究发现，4-OH-BDE-42与HSA的结合位置在Site I，即IIA(华法林结合空腔)^[15]。

  图 1(a)为4-OH-BDE-42在HSA的亚结构区域IIA的对接图。图 1(b)显示了4-OH-BDE-42周围5.5Å范围内的氨基酸残基，蓝色表示的是亲水性氨基酸，橘色为疏水性氨基酸。如图所示，4-OH-BDE-42被ALA、PHE、TRP、LEU、ILE等强疏水性氨基酸所包围，形成一个很强的疏水面。图 1(c)的疏水作用图则直观表明4-OH-BDE-42结合在HSA中一个疏水性较强的空腔内，由此可见疏水作用力在稳定复合物方面起到了重要作用。此外，由于—OH极性基团的存在，4-OH-BDE-42分子的H原子和O原子分别与亲水性氨基酸GLU292、LYS195形成了氢键，醚键中的O原子也与LYS199形成氢键(图 1(d)黄色实线)，加强了4-OH-BDE-42与HSA的结合作用。

  图 1  (a) 4-OH-BDE-42在HSA位点I的对接模型；(b)4-OH-BDE-42周围5.5Å范围内的氨基酸残基；(c)疏水作用力图；(d)氢键的形成 Figure 1.  (a) Docking model of 4-OH-BDE-42 with the site I of HSA; (b) Amino acid residues around 4-OH-BDE-42 in 5.5Å; (c) Hydrophobic interaction between 4-OH-BDE-42 and HSA; (d) The formation of hydrogen bonds

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  2.2   HSA与4-OH-BDE-42-HSA体系的三维荧光

  由于蛋白质一般含有色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等残基，所以能发出荧光，且这3种氨基酸对微环境非常敏感。三维荧光不仅能直观地看到蛋白质荧光强度的变化，还能判断蛋白质的构象是否发生变化。图 2为加入4-OH-BDE-42前后HSA的三维荧光光谱图。图中可见，加入4-OH-BDE-42后，体系的瑞利散射峰增强，这可能是由于4-OH-BDE-42-HSA复合物的生成导致溶液中溶质的粒径增大，散射效应增强^[17]。peak 1反映了血清蛋白中色氨酸与酪氨酸残基的光谱行为；peak 2则反映了蛋白质的多肽链结构等信息^[18]。4-OH-BDE-42-HSA体系中两个峰的强度均降低，且最大发射波长都出现了蓝移(peak 1从280/360nm蓝移至280/355nm，peak 2从225/360nm移至225/350nm)。peak 1强度的降低及蓝移现象表明，4-OH-BDE-42的加入改变了TRP214残基周围的微环境，荧光发生猝灭。同时，蛋白质微环境的极性减小，疏水性增加；二级结构峰peak 2的降低及蓝移表明了4-OH-BDE-42的加入引起了蛋白的多肽链发生变化，从而导致HSA的构象改变。

  图 2  (a) HSA与(b) HSA-4-OH-BDE-42体系的三维荧光光谱 Figure 2.  Three-dimensional fluorescence spectra of HSA (a) and HSA-4-OH-BDE-42 (b) systems

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  2.3   4-OH-BDE-42与HSA相互作用的猝灭机理

  三维荧光表明，4-OH-BDE-42的存在会使HSA的荧光发生猝灭。为进一步探讨4-OH-BDE-42对HSA荧光的猝灭机理，本文测定了三个温度下的荧光光谱。图 3为在pH=7.40的条件下，不同浓度的4-OH-BDE-42对HSA荧光强度的影响。随着4-OH-BDE-42浓度的增加，HSA的内源性荧光有规律地发生猝灭，且最大荧光发射峰出现轻微蓝移(约4nm)。这表明4-OH-BDE-42与HSA发生相互作用，导致HSA发色团的微环境发生变化，最大发射峰蓝移，微环境的极性降低，疏水性增加^[19]。

  图 3  4-OH-BDE-42对HSA的荧光猝灭图 Figure 3.  Fluorescence quenching spectra of HSA in the presence >of 4-OH-BDE-42

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  荧光猝灭机制主要有静态猝灭、动态猝灭及非辐射能量转移三种。温度是辨别动、静态猝灭机制的一种简单易行的方法。对于动态猝灭，随着温度的升高，能量转移加剧，荧光物质的猝灭常数增大，但对HSA的二级结构和生理活性不会产生任何影响；若为静态猝灭，温度升高则使形成的复合物稳定性降低，且HSA的结构或生理活性发生变化，促使猝灭常数减小^[20]。为判断4-OH-BDE-42与HSA作用的猝灭机制，可以根据不同温度下HSA的荧光猝灭情况进行猝灭常数的计算。猝灭的作用过程遵循Stern-Volmer方程^[21]：

  式中，F₀和F分别表示加入猝灭剂前后HSA的荧光强度；[Q]为4-OH-BDE-42的浓度；K_sv为Stern-Volmer猝灭常数；K_q为双分子动态猝灭速率常数；τ₀是无猝灭剂时生物大分子内源性荧光寿命，约10^-8 s。以F₀/F对[Q]作291、298和310K三个温度下的Stern-Volmer曲线图(图 3右上方)，并由Stern-Volmer方程求出各个温度下的猝灭常数(如表 1) 。

  表 1  不同温度下4-OH-BDE-42对HSA的荧光猝灭常数 Table 1.  The fluorescence quenching constant of 4-OH-BDE-42-HSA interaction at different temperatures

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  CompoundT/KK_sv /(L·mol^-1)K_q/(L·mol^-1·s^-1)R4-OH-BDE-422908.12×10⁷8.12×10¹⁵0.99603109.34×10⁷9.34×10¹⁵0.9981

  298	8.77×107	8.77×1015	0.9983

  猝灭常数K_sv随着温度的升高而增大，这说明该猝灭机制可能是动态猝灭。但由表 1可见，4-OH-BDE-42与HSA之间的猝灭速率常数K_q的数量级为10¹⁵，远远大于各类猝灭剂对生物大分子的动态猝灭常数2.0×10¹⁰L·mol^-1·s^-1，且温度对K_q的影响并不明显，故推断4-OH-BDE-42对HSA的猝灭机制为复合物生成引起的静态猝灭，而不是动态猝灭。

  结合Förster偶极-偶极非辐射能量转移理论，为判断小分子与蛋白质是否了发生非辐射能量转移，我们测定了等摩尔浓度的HSA荧光与4-OH-BDE-42紫外吸收光谱。

  结合下列公式可以得出能量给体与受体之间的能量转移效率、临界距离和两者的结合距离等信息^[22]。

  式中，K²=2/3；R₀是转移效率为50%时的临界距离；N为介质折射指数；Φ为给体(HSA)的荧光量子产率；J为给体的荧光发射光谱与受体的吸收光谱间的重叠积分。图 4可看到两个图谱有一定的重叠程度，分析数据得出两光谱重叠区的重叠积分为J=4.43×10^-14 cm³·L·mol^-1；临界距离R₀=3.66nm；能量转移效率E=0.3371，且4-OH-BDE-42与HSA的结合位置距离色氨酸残基的距离r=3.66nm。结合距离r＜7nm且满足0.5R＜r＜1.5R，表明偶极-偶极非辐射能量转移是导致HSA内源性荧光发生猝灭的另一个原因。

  图 4  HSA荧光光谱与4-OH-BDE-42吸收光谱的重叠图 Figure 4.  The overlap of fluorescence spectrum of HSA and absorption spectrum of 4-OH-BDE-42

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  2.4   4-OH-BDE-42对HSA的表观结合常数、结合位点数及作用力

  当小分子与大分子结合时，其表观结合常数K_a与结合位点数n由下式求出^[23]：

  依据公式(5) 作不同温度下4-OH-BDE-42对HSA荧光猝灭的双对数曲线图，由所绘制直线的截距和斜率即可求得4-OH-BDE-42与HSA的结合位点数n及表观结合常数K_a(见表 2) 。

  表 2  不同温度下4-OH-BDE-42与HSA的表观结合常数K_a以及结合位点数n Table 2.  The apparent binding constants K_a and binding sites n of 4-OH-BDE-42-HSA interaction at different temperatures

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  CompoundT/KK_a /(L·mol^-1)nR4-OH-BDE-422900.47×10⁷0.85080.99633106.90×10⁷0.98470.9986

  298	3.43×107	0.9513	0.9989

  从表 2可知，4-OH-BDE-42与HSA的结合常数较大，均在10⁶数量级以上，这表明两者的结合能力很强。同时，两者的结合位点数n约为1，可见4-OH-BDE-42与HSA作用时只有一个结合位点。

  根据热力学公式^[24]以及不同温度下复合物的结合常数K_a，可求出4-OH-BDE-42与HSA结合的热力学参数(见表 3) 。由表 3可知，该体系中ΔG＜0，ΔH＞0，ΔS＞0，说明4-OH-BDE-42与HSA间的相互作用是一个自发吸热的过程，也是一个熵增加的过程，二者作用的主要驱动力为疏水作用力，这与分子对接的结论一致。

  表 3  不同温度下4-OH-BDE-42与HSA相互作用的热力学参数 Table 3.  The thermodynamic parameters of 4-OH-BDE-42 -HSA interaction at different temperatures

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  CompoundT/KΔH/(kJ·mol^-1)ΔG/(kJ·mol^-1)ΔS/(J·mol^-1·K^-1)4-OH-BDE-42290-37.0310-46.5

  298	96.8	-43.0	464.3

  2.5   结合自由能及主要残基贡献分析

  准确的自由能预测可以帮助我们更好地理解生物大分子的结构与功能。图 5为HSA体系与HSA-4-OH-BDE-42体系20ns分子动力学模拟轨迹的均方根位移(RMSD)图，由图中可看出，在模拟5ns后，两个体系均趋向于稳定，波动较小，这表明模拟体系达到了平衡状态。4-OH-BDE-42与HSA之间的结合自由能采用MM-PBSA方法进行计算，并选取模拟过程平衡阶段的最后10ns的模拟轨迹进行分析。如图 6(a)，用MM-PBSA得到的结合自由能为-50.68kJ·mol^-1，与实验值相差不大，可见该计算结果还是令人满意的。从图中各种作用能发现，E_VDW、E_elect、ΔG_np均为负值，表明4-OH-BDE-42与HSA之间的范德华作用能、静电作用能、非极性溶剂化自由能都有利于两者的结合^[25]。尽管静电作用能E_elect有利于配体的结合，但静电溶剂化能ΔG_PB却很大程度上抵消了这种趋势，总体表现为静电作用不利于两者的结合。4-OH-BDE-42与HSA形成复合物时，ΔG_nonpolar低达-117.16 kJ·mol^-1，克服了一切不利因素，使总的结合自由能为负值，这表明疏水作用对4-OH-BDE-42与HSA的结合自由能贡献很大^[13]，两者结合的主要驱动力为疏水作用力。

  图 5  HSA与HSA-4-OH-BDE-42体系的均方根位移(RMSD)图 Figure 5.  Root-mean-square displacement (RMSD) of HSA and HSA-4-OH-BDE-42 systems

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  图 6  (a)4-OH-BDE-42与HSA之间的结合自由能；(b)单个氨基酸残基对结合自由能贡献值 Figure 6.  (a) Binding free energies of 4-OH-BDE-42-HSA complex; (b) Binding free energy contribution of each residue in the complex

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  将结合自由能分解到每个氨基酸残基中，以此来确定在结合过程中的关键残基。单个氨基酸残基对两者结合自由能的贡献如图 6(b)所示。图中可见，LYS199、GLU292、ARG257、ARG218、ALA291、HIS242对两者的结合具有显著贡献。同时，根据分子动力学轨迹的氢键成键分析，4-OH-BDE-42均与GLU292、LYS195形成氢键，表明了氢键作用力的存在。结合分子对接及动力学模拟氢键分析，氢键的形成是导致LYS199、GLU292对结合自由能的贡献较大的原因之一；尽管LYS195也与4-OH-BDE-42形成氢键，但LYS195的残基贡献值为正，并不利于两者的结合。另外，TRP214是两者相互作用中一个重要的氨基酸，尽管贡献不大，但也是利于两者结合的。

  3   结论

  在模拟人体生理条件下，采用计算模拟和光谱法研究了4-OH-BDE-42与HSA的相互作用机制。三维荧光结果表明，4-OH-BDE-42能猝灭HSA的荧光，并导致HSA的微环境和构象发生变化，微环境的极性减小，疏水性增加。荧光光谱表明，4-OH-BDE-42与HSA发生相互作用进而猝灭了HSA的内源性荧光，猝灭机制为静态猝灭，并伴随着非辐射能量转移。根据热力学参数分析，焓变和熵变均为正值，说明疏水作用为两者结合作用的主要驱动力，这与结合自由能结果一致。此外，分子对接、动力学模拟和关键氨基酸残基分析均表明氢键作用对4-OH-BDE-42与HSA的结合起到了很大的作用。4-OH-BDE-42与HSA的结合常数很大，表明两者的结合能力很强。环境中的OH-PBDEs进入人体内与血浆蛋白结合，生成的复合物可被蛋白储存和转运，蓄积于人体内并发生毒性作用，影响人类健康。

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  图式1  4-OH-BDE-42的化学结构

  Scheme 1  Chemical structure of 4-OH-BDE-42

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  图 1  (a) 4-OH-BDE-42在HSA位点I的对接模型；(b)4-OH-BDE-42周围5.5Å范围内的氨基酸残基；(c)疏水作用力图；(d)氢键的形成

  Figure 1  (a) Docking model of 4-OH-BDE-42 with the site I of HSA; (b) Amino acid residues around 4-OH-BDE-42 in 5.5Å; (c) Hydrophobic interaction between 4-OH-BDE-42 and HSA; (d) The formation of hydrogen bonds

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  图 2  (a) HSA与(b) HSA-4-OH-BDE-42体系的三维荧光光谱

  Figure 2  Three-dimensional fluorescence spectra of HSA (a) and HSA-4-OH-BDE-42 (b) systems

  T =298 K,c_HSA=1.0×10^-6 mol·L^-1, c_4-OH-BDE-42=1.0×10^-7mol·L^-1

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  图 3  4-OH-BDE-42对HSA的荧光猝灭图

  Figure 3  Fluorescence quenching spectra of HSA in the presence >of 4-OH-BDE-42

  T=298 K,c_HSA =1.0×10^-6 mol·L^-1；0～7: c_4-OH-BDE-42=(0～7) ×10^-8 mol·L^-1

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  图 4  HSA荧光光谱与4-OH-BDE-42吸收光谱的重叠图

  Figure 4  The overlap of fluorescence spectrum of HSA and absorption spectrum of 4-OH-BDE-42

  T=298K,c_HSA =c_4-OH-BDE-42 =1.0×10^-6 mol·L^-1

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  图 5  HSA与HSA-4-OH-BDE-42体系的均方根位移(RMSD)图

  Figure 5  Root-mean-square displacement (RMSD) of HSA and HSA-4-OH-BDE-42 systems

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  图 6  (a)4-OH-BDE-42与HSA之间的结合自由能；(b)单个氨基酸残基对结合自由能贡献值

  Figure 6  (a) Binding free energies of 4-OH-BDE-42-HSA complex; (b) Binding free energy contribution of each residue in the complex

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  表 1  不同温度下4-OH-BDE-42对HSA的荧光猝灭常数

  Table 1.  The fluorescence quenching constant of 4-OH-BDE-42-HSA interaction at different temperatures

  CompoundT/KK_sv /(L·mol^-1)K_q/(L·mol^-1·s^-1)R4-OH-BDE-422908.12×10⁷8.12×10¹⁵0.99603109.34×10⁷9.34×10¹⁵0.9981

  298	8.77×107	8.77×1015	0.9983

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  表 2  不同温度下4-OH-BDE-42与HSA的表观结合常数K_a以及结合位点数n

  Table 2.  The apparent binding constants K_a and binding sites n of 4-OH-BDE-42-HSA interaction at different temperatures

  CompoundT/KK_a /(L·mol^-1)nR4-OH-BDE-422900.47×10⁷0.85080.99633106.90×10⁷0.98470.9986

  298	3.43×107	0.9513	0.9989

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  表 3  不同温度下4-OH-BDE-42与HSA相互作用的热力学参数

  Table 3.  The thermodynamic parameters of 4-OH-BDE-42 -HSA interaction at different temperatures

  CompoundT/KΔH/(kJ·mol^-1)ΔG/(kJ·mol^-1)ΔS/(J·mol^-1·K^-1)4-OH-BDE-42290-37.0310-46.5

  298	96.8	-43.0	464.3

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