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• 手足口病(HFMD)主要影响5岁以下的儿童，并且表现出广泛的临床症状。引发手足口病的肠道病毒有20多种(型)，其中以肠道病毒71型(EV71)及柯萨奇病毒A16(CVA16)最为常见，CVA16感染通常只造成轻症病例且占比例小，而EV71感染不仅造成轻症病例，还能造成重症和死亡病例^[1]，因此目前的抗病毒药物研究主要是针对EV71。EV71感染可以引起心肺衰竭且迅速恶化，具有较高的死亡率，其散发病例遍布全世界，但是大规模感染主要发生在东南亚国家以及中国^[2]。2015年，国家食品药品监管总局分别批准北京科兴和中国医学科学院医学生物学研究所自主研发的预防儿童手足口病的EV71型灭活疫苗的生产注册申请。然而由于病毒的高变异率，通过接种疫苗预防EV71病毒感染仍然具有很大的挑战性，而目前还没有有效的抗病毒药物用于治疗EV71的感染。目前临床上针对EV71引起的手足口病感染，主要使用阿昔诺韦、更昔诺韦以及利巴韦林等常用广谱抗病毒药物进行对症的支持性治疗，但仅对早期以及轻症状患者有效，而对于重症患者目前尚无特效药物。

  1   EV71的结构特点以及药物分子作用靶点

  EV71是一个无包膜的单股核糖核酸病毒，直径约30nm，属于细小核糖核酸病毒家族的肠病毒属^[3]。EV71的外层衣壳呈二十面体对称结构，由60个蛋白质亚基组成，每一个蛋白质亚基都是由4个结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4组成。其中VP1、VP2和VP3位于病毒衣壳的表面，而较短的VP4则全部位于衣壳之内^[4~6]。抗EV71药物的作用机制主要是通过影响EV71复制周期的某个环节来抑制病毒的复制和感染，主要针对病毒复制过程中的受体和酶作为靶标。目前EV71药物研究的作用靶点主要集中在结构蛋白VP1和非结构蛋白3C蛋白酶，而对其他作用靶点的研究则相对较少。

  2   抗EV71药物的设计合成

  2.1   以VP1为靶点的抑制剂

  EV71的结构蛋白VP1参与宿主细胞表面受体的识别^{[7, 8]}，VP1中的疏水口袋区域是抗病毒抑制剂设计的主要靶标位置，因为其被合适的化合物占据将稳定病毒衣壳并防止病毒RNA释放，从而抑制病毒复制^[9]。

  最早由Sterling-Winthrop研究所设计研发的Win系列化合物被确定为可逆的与衣壳蛋白结合的抑制剂^[10]，它的发现为该靶点抑制剂的研发提供了很好的化学结构模板(式1(a))。例如，Schering-Plough公司在此基础上开发了SCH系列化合物(式1(b))^[10g]。在以Win系列化合物为模板开发的抑制剂分子中，Pleconaril是一个杰出代表，该化合物于1994年由Sterling-Winthrop研究所设计合成，之后Viropharma公司获得许可并进一步研发。体外实验中它对肠道病毒原型株显示出了极强的抗病毒作用，但最终由于安全性问题未被美国食品药品管理局(FDA)批准上市。其合成是以4-羟基-3, 5-二甲基苯甲腈(1)为起始原料，羟胺进攻其氰基后直接在三氟乙酸酐作用下关环形成中间体2，之后与异噁唑部分(3)连接得到Pleconaril(式(2))^[10h]。

  2002年，Shia等^{[11, 12]}报道了以Win系列化合物骨架为模板，借助计算机辅助药物设计合成的一系列咪唑烷酮衍生物(式(3))。此类化合对EV71普遍有着很好的抑制活性。该类化合物骨架由三部分构成：吡啶咪唑酮的A部分、作为连接链的烷基链B部分以及尾部的芳基C部分。其中A部分在对病毒的抑制活性中起着重要作用。

  随后他们对该类化合物进行了进一步的结构衍生化，在合成的一系列衍生物(BPROZ系列化合物)中^{[13, 14]}，依据结构尺寸以及氢键作用设计出的研究代码为BPROZ-074的化合物的抑制活性最高，它对EV71病毒的IC₅₀值达到了0.8nmol/L，除此以外，对其他6种病毒变异株也有很强的抑制效果。其合成以对氰基苯酚为起始原料，首先用碘甲烷保护酚羟基，随后在氯化铵的作用下与叠氮化钠关环得到四氮唑中间体(5)，之后用碘乙烷对四氮唑环进行乙基化，得到的中间体6在三溴化硼的作用下脱除酚羟基保护并随后与3-甲基-1，5-二对甲苯磺酰氧基戊烷反应得到连有侧链的中间体7，最后与中间体8连接得到BPROZ-074(式(4))。反应的总收率仅17%，其中与叠氮化钠的关环反应收率为54%，成为了整个路线的收率限制步骤，中间体8可以通过4-氨基吡啶与2-氯乙基异氰酸酯反应关环得到，但2-氯乙基异氰酸酯的刺激性以及毒性较大，若进一步进行放大制备，需要寻求中间体8的替代制备方法。虽然BPROZ-074的抑制活性非常优秀，但是对于该化合物的后续临床实验却未见报道。

  2014年，笔者所在的饶子和课题组在解析了EV71的全病毒颗粒结构后，根据VP1的蛋白结构特点并借助计算机辅助药物设计，在BPROZ系列化合物的吡啶环上引入氨基/酰胺基团以增强抑制剂分子与蛋白氨基酸残基的作用，合成了两个EV71的有效抑制化合物NLD和ALD(式(5))^[15]。其中化合物NLD(研究代码TJAB1099)抑制活性极强，其IC₅₀值为25pmol/L。动物实验显示在中剂量(10mg/kg)条件下对乳鼠的保护率接近90%，TJAB1099是目前最有可能成为特异性抗手足口病药物的候选化合物，现在该化合物正在进行临床前的相关安全性评价和代谢动力学实验。

  化合物TJAB1099目前主要有两种合成路线。第一种是以2-溴-4-氨基吡啶和2-氯乙基异氰酸酯为原料，两者首先通过无溶剂反应合成得到中间体11，然后在碱性条件下关环合成得到咪唑酮12，随后以DMSO为溶剂在乙酸作用下与叠氮化钠反应得到中间体13，再在碱性条件下与1, 5-二溴-3-甲基戊烷(14)反应得到带有连接侧链的中间体15，随后用氯化亚锡还原叠氮基团得到中间体16，最后在碱性条件下与化合物17反应即得到化合物TJAB1099(式(6)，路线1)^[16]。该方法仅可以满足实验室的克级制备需求(一般制备量小于10克)，但随着制备规模要求的扩大，该制备方法固有的危险性会明显显现出来：第一步用到的2-氯乙基异氰酸酯的刺激性以及毒性较大，大规模制备时容易对环境和操作人员造成危害；第三步反应中用到了大量易爆的叠氮化钠也限制了进一步的放大生产；另外，还原叠氮基团时会产生大量的锡盐废渣，不易后处理且很容易造成最终产品的重金属超标。对于中间体15的叠氮基团的还原，我们曾经尝试过催化加氢以及Staudinger反应，但效果均不理想。

  为克服这些缺点，我们又设计开发了利用钯催化偶联的路线来合成TJAB1099的方法^[17]。其合成是以4-溴-2氨基-吡啶(18)为起始原料，先用对甲氧基苄基氯对氨基进行双取代保护得到中间体19，随后与单乙酰基咪唑酮(20)进行钯催化的偶联反应，得到咪唑酮中间体21，其在碱性条件下脱去乙酰基得到中间体22，之后在碱性条件下与1, 5-二溴-3-甲基-戊烷反应得到化合物23，随后脱去保护基得到化合物16，最后在碱性条件下与化合物17反应得到TJAB1099(式(6)，路线2)。该路线的总收率为12%，其中钯催化的偶联反应收率仅为52%，为收率限制步骤。但是该方法全过程无需硅胶柱层析，所有的中间体经过适当洗涤或结晶纯化后即可直接进行下一步投料，且终产物TJAB1099通过重结晶可以达到99%以上纯度。目前该路线已进行了多次百克级的放大投料，结果较为稳定。

  其他VP1抑制剂还包括：Pirodavir衍生物^{[18, 19]}、类黄酮衍生物^{[20, 21]}及一些本身已具有药理活性的分子^[22]。Pirodavir是由Janssen研究基金会研发的，该化合物在体外实验中对鼻病毒复制具有显著活性，其浓度为64nmol/L时，便可抑制80%的病毒，但Pirodavir对EV71的抑制活性则相对较低，IC₅₀值为5.4μmol/L。随后对Pirodavir进行衍生化发现，其哒嗪基肟醚系列衍生物对EV71有着显著的抑制活性，随着研究的不断深入，最终使得BTA系列化合物被发现。其中代表性的BTA39有着显著抑制EV71复制的活性，对EV71的IC₅₀值达到1nmol/L，且这种化合物在动物实验中可口服利用(式(7))。

  BTA39的合成如式(8)所示。首先氯代哒嗪(24)和羟乙基哌啶(25)直接在加热条件下就可以以80%的收率反应得到中间体26，然后在二氯亚砜的作用下以95%的收率得到氯代物27，随后与对羟基苯甲醛反应以80%收率得到中间体28，再与O-乙基羟胺缩合得到化合物BTA39。缩合反应后的产物中顺式产物所占的比例小于10%(式(8))。虽然BTA39的抑制活性非常优异，但是对于该化合物的后续临床实验却未见报道。

  2.2   以3C蛋白酶为靶点的抑制剂

  3C蛋白酶(3C^pro)是一种半胱氨酸蛋白酶，在病毒复制过程中起着关键的蛋白切割作用^{[23, 24]}，因此3C^pro在EV71感染中的关键作用使其成为抗EV71药物发现的一个有吸引力的靶标。Rupintrivir(AG7088)(式(9))最初是由Agouron公司研发的针对人鼻病毒(HRV)3C^pro开发设计的抑制剂，用于感冒的治疗，虽然最终由于临床有效性方面的问题未获得FDA批准，但作为肽模拟物为之后的类似抑制剂的研发提供了很好的模板^{[25, 26]}。随后的研究发现AG7088还具有抑制EV71复制的作用，其IC₅₀值为14nmol/L。这种抑制剂结构组成包括：P1位置的内酰胺环以模拟谷氨酰胺，P1’位置的α, β不饱和酯作为迈克尔受体与活性位点Cys残基形成共价键，P2位的氟代苯丙氨酸，P3位的缬氨酸，然后是P4位的5-甲基-3-异噁唑^[27~29]。

  AG7088的合成方法^{[30, 31]}如式(10)所示，合成分为内酰胺环部分(片段A)的构建以及拟肽片段(片段B)的构建。内酰胺环部分的合成始于L-谷氨酸(29)，首先对其羧基和氨基进行全保护，之后在-78℃下利用氨基酸自身的手性诱导作用，得到单一构型的氰基取代中间体31，该步反应中的碘乙腈可以用溴乙腈替代，反应效果类似；之后用二氧化铂催化加氢还原氰基成氨基，并在乙酸钠的作用下原位关环得到内酰胺中间体32；随后依次经过硼氢化钠还原和Dess-Martin氧化得到氨基醛中间体34，它与膦酸酯发生Horner-Wadsworth-Emmons反应得到α, β-不饱和羧酸酯35；最后用三氟乙酸脱去氨基上的保护基得到中间体36(片段A)。片段B的合成始于苄氧羰基(Cbz)保护的L-缬氨酸，在羰基二咪唑的作用下，它与乙酸叔丁酯缩合得到中间体41，之后与中间体39发生取代反应脱除溴化氢得到中间体42，随后用三氟乙酸将叔丁氧羰基脱除得到中间体43，之后在钯碳的催化下氢化脱除氨基上的Cbz保护基，换为叔丁氧羰基(Boc)保护氨基，并在氢氧化钠作用下水解得到中间体45(片段B)。

  将分别制备好的两个片段进行脱水缩合得到中间体46，随后脱除氨基上的Boc保护并与甲基噁唑甲酰氯反应得到AG7088。中间体39可以以D-4-氟苯基丙氨酸为原料，在亚硝酸钠的作用下发生溴代反应并随后成酯得到。笔者曾利用该合成方法进行AG7088的相关衍生物制备，发现在进行内酰胺环合成制备中间体32时，将乙酸钠替换为三乙胺得到的反应效果更好；此外氨基醛34不易纯化，可以将其粗品继续用于下一步的Horner-Wadsworth-Emmons反应后再进行纯化，这样既可以简化操作，又可以得到纯度较高的样品。

  基于3C^pro的晶体结构，Kuo等^[32]将Rupintrivir结构中P1’位置的α, β-不饱和酯用醛代替设计合成了一系列Rupintrivir类似物用于测定其对EV71的抑制活性。衍生物保留了P1以及P2位置的结构类型，将P3位置替换为肉桂酰基衍生物，将P1’位替换为醛，大部分衍生物相比Rupintrivir而言仅表现出了中等程度的抑制活性。其中，所得的衍生物48对EV71的抑制活性最高，相应的IC₅₀值为18nmol/L，值得一提的是其细胞毒性很低。Yin等^[33]研究发现P1位置(S)-γ-内酰胺环被(S)-δ-内酰胺环取代可以提高抑制剂对EV71 3C^pro的效力，并发现α-酮酰胺可很好地与S1’口袋相互作用，进而设计了一系列的α-酮酰胺类似物。在对α-酮酰胺类似物的活性评估中发现，P1’位置分子越小活性越好；P2位置引入对氟苄基(式(11)，化合物49)可提高其抑制活性。α-酮酰胺类似物为EV71 3C^pro抑制剂的研究提供了很好的方向。

  对于此类化合物的合成方法，他们初期从醛通过氰醇合成α-酮酰胺(式(12)，路线1)。然而，此方法中使用有毒的氰化钾，并且总收率仅为20%。他们基于先前报道的方法，通过Passerini反应完成α-酮酰胺的合成，以醛为原料用异氰化物和乙酸处理得到酯，然后在碱性条件下除去乙酰基得到醇，之后用Dess-Martin氧化得到α-酮酰胺(式(12)，路线2)。该方法步骤较短，转化率高，最终的总收率达到了70%^{[33, 34]}。

  该类化合物P1位置的内酰胺部分对抗EV71的活性至关重要，它的合成是以L-谷氨酸(29)为起始原料，首先将氨基和羧基分别保护得到中间体30，之后在LiHMDS作用下通过氨基酸自身的手性诱导得到单一构型的中间体57，之后氰基还原并原位关环得到中间体58，再依次与L-苯丙氨酸以及肉桂酸缩合得到中间体60，最后还原氧化得到醛肽62(式(13))。

  Dragovich等^[35]在以AG7088为模板的基础上，将AG7088中肽结构换成了含有2-吡啶酮结构的模拟肽(式(14)，化合物63)。化合物63左侧氮端是一个3-氨基-2-吡啶酮部分，右侧碳端仍为一个α, β不饱和酯结构，维持着对HRV的高抑制活性(IC₅₀=2nmol/L)，该化合物具有较好的口服生物利用度和药代动力学性质。由于HRV和EV71有相似的3C^pro，Lin等^[36]从提高抑制剂分子血浆稳定性的角度设计合成了一系列吡咯并吡啶酮类化合物，根据EV71的3C^pro共晶结构，设计了一系列P1’位置的内酯衍生物，实验发现用内酯作为替代时，对EV71可以显示更好的稳定性且表现出可接受的效力(式(14)，化合物64)。

  化合物63的合成如式(15)所示，首先以L-谷氨酸为起始原料构建出内酰胺环得到氨基醇衍生物65，之后与化合物66(由D-3, 4-二氟苯基苯丙氨酸制备得到)脱水缩合得到中间体67，之后对其羟基进行磺酸酯保护得到中间体68，随后中间体69(由氨基吡啶酮与甲基噁唑甲酸缩合得到)的吡啶环上的氮原子进攻磺酸酯得到中间体70，之后脱除羟基保护并用Dess-Martin氧化剂氧化得到醛肽中间体，之后发生Horner-Wadsworth-Emmons反应得到中间体72，最后在DDQ的作用下脱去内酰胺环上氨基保护得到目标产物。用溴代吡咯并吡啶酮替代氨基吡啶酮，通过类似的方法可以合成得到化合物64。

  3   结语

  手足口病在许多亚洲国家的频繁大量爆发，使得有效的抗病毒药物需求迫切，虽然目前已有相关疫苗上市，然而对于主要致病病毒EV71，由于其较高的变异率，使得通过接种疫苗的方式预防手足口病仍具有很大的挑战性，因此研发出上市的有效药物就显得十分必要。目前而言，对于抗EV71的研究靶点主要集中在衣壳蛋白VP1和3C蛋白酶上，其他靶点还有2C蛋白^[37]、3A蛋白^[38]以及3D聚合酶^[39]，但相应抑制剂的设计合成研究较少。就整体效果而言，以VP1为靶点的抑制剂的抑制效果往往较好，且VP1在EV71病毒的A、B和C 3个型和多种亚型中相对保守，因此选取VP1蛋白作为靶点，开发的药物具有广谱性，可有效的缓解由于病毒变异产生的耐药性问题。目前最有希望进入临床的TJAB1099，其对病毒的半数抑制率达到了pmol/L级别。随着EV71病毒结构及其功能的阐明以及合成技术的发展，越来越多的EV71抑制剂被发现，为手足口病的治疗展现出了广阔的前景。

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