English

• 纳米载体作为智能药物递送系统通过增强的渗透和滞留效应(EPR)可将药物被动靶向至癌变区域^[1]，实现药物在肿瘤组织内大量富集，提升肿瘤治疗效果，降低副作用，因而在肿瘤治疗方面引起人们愈来愈多的注意^{[2, 3]}。相比较常规的聚合物单体，基于非共价键作用的超分子体系由于避免了繁杂冗长的共价合成过程^[4]及多样的刺激响应性^{[5, 6]}为构筑复杂的高级功能纳米材料提供了简便的方法。

  作为新一代大环主体，基于柱芳烃^[7]优异的主客体络合性能而构筑的超分子纳米材料在染料吸附^[8]、分子识别^[9]、人工跨膜通道^[10]、机械互锁分子^[11]、金属离子分离、化学传感器及超分子聚合物^[12]等领域得到广泛的应用。目前，科研工作者更是聚焦于柱芳烃体系在药物递送系统的研究^[13~20]。例如，Cao等^[21]基于水溶性柱[6]芳烃制备的超分子囊泡不仅可以包载疏水性抗癌药物阿霉素(DOX)，而且能对DOX进行可控释放；Yu等^[22]基于水溶性柱[6]芳烃构筑的三组分药物转运体系不仅具有良好的抗癌活性和对正常细胞较低的毒性，而且成功实现了对药物释放情况的实时检测。然而在纳米药物递送系统的设计中，作为构筑单元的柱芳烃更多是基于负离子的两亲体设计，柱芳烃阳离子单体特别是基于生物相容性好、毒性低的氨基酸修饰柱芳烃阳离子构筑的纳米药物递送系统目前尚未见报道。

  基于此，本文设计一种D-丙氨酸修饰的柱[5]芳烃DAP5，然后通过主客体作用与十二烷基苯磺酸钠(SDBS)组装成球形超分子纳米载体。该载体不仅可以高效装载抗肿瘤药物DOX，且在模拟的肿瘤弱酸性环境中能够持续释放药物，表现出pH响应性。通过MTT法测试了载药物体系对宫颈癌细胞(Hela)、肝癌细胞(HepG2)、胃癌细胞(MGC-803)、膀胱癌细胞(T24)和正常肝细胞(LO2)的增殖抑制活性，结果显示，构筑的药物输送系统对四种癌细胞的抗癌活性明显优于裸药。

  1.   实验部分

  1.1   仪器与试剂

  所有试剂均为市售分析纯级，使用时未进一步纯化。Bruker 600MHz超导核磁共振谱仪；MP420全自动熔点仪；JMS-S3000 Spiral TOF质谱仪；Bruker Dension Icon原子力显微镜；Tecnai G2 F20 S-TWIN透射电镜；Zetasizer Nano S Zeta电位测定仪；Mastersizer 2000激光粒度仪。

  1.2   DAP5的合成

  目标化合物DAP5的合成路线见图式 1。

  图式 1

  

  图式 1.  水溶性柱[5]芳烃DAP5的合成路线和构筑超分子纳米载体及药物释放示意图

  Scheme 1.  Synthesis route of water soluble pillar^[5] arene DAP5 and the formation of supramolecular nanoparticle and its drug release

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  化合物2的合成：向500mL两口烧瓶中依次加入60mL乙腈、60mL(0.5mol)1, 4-二溴丁烷和69.105g(0.5mol)K₂CO₃，65℃下搅拌应0.5h；将27.5g(0.25mol)对苯二酚溶于100mL乙腈溶液中，在氮气保护下逐滴加入混合溶液中。TLC跟踪反应，搅拌回流72h后停止反应，倒入50mL二氯甲烷(DCM)，抽滤，滤液经旋蒸除去溶剂后加DCM和去离子水萃取，合并有机相，无水硫酸钠干燥，柱层析分离得到白色固体，产率77%，熔点92.8℃。¹H NMR (600MHz，CDCl₃)δ：6.82(s，4H)，3.92(t，4H)，3.43(t，4H)，2.04(t，4H)，1.90(t，4H)；¹³C NMR(151MHz，CDCl₃)δ：153.1，115.4，67.4，33.6，29.6，28.0；MALDI-TOF-MS(m/z)：C₁₄H₂₂Br₂O₂，381.12，[M+H]⁺。

  化合物3的合成：向盛有200mL DCM的500mL两口烧瓶中依次加入4.2g(11mmol)化合物2和0.99g(33mmol)多聚甲醛，室温搅拌下回流反应10min，加入0.285g(1.76mmol)三氯化铁，溶液立刻由无色变为黄绿色最后变为深绿色，TLC跟踪反应，3h后加入100mL去离子水终止反应。分液，用DCM萃取水相，合并有机相，无水硫酸钠干燥，柱层析分离得到白色固体化合物3，产率55%，熔点90.4~91.3 ℃。¹H NMR (600MHz，CDCl₃)δ：6.82(s，10H)，3.93(s，20H)，3.75(s，20H)，3.44(s，20H)，2.06(s，20H)，1.93(s，20H)；¹³C NMR (151MHz，CDCl₃)δ：149.8，128.3，114.9，67.6，33.9，29.9，28.6，6.9；MALDI-TOF-MS m/z：C₇₅H₁₁₀Br₁₀O₁₀，1982.90，[M+Na]⁺；1998.88，[M+K]⁺。

  BDAP5的合成：将1.2g(0.61mmol)化合物3、2.2g(24.4mmol)D/L丙氨酸、3.37g(24.4mmol)碳酸钾和25mL乙腈加入到100mL的两口烧瓶中，加热到75℃反应6h，将混合物倒入水中，用DCM萃取，合并有机层，无水硫酸钠干燥，柱层析分离得到浅黄色粘稠状液体DBAP5，产率90%，[α]_DBAP5=-221。¹H NMR (600MHz，CDCl₃)δ：6.79(s，1H)，5.35(s，1H)，4.24(m，1H)，4.32(m，2H)，4.00(d，J=4.5Hz，1H)，3.79(dd，J=31.0、22.7 Hz，2H)，1.90(dd，J=18.4、5.1 Hz，4H)，1.46(m，9H)，1.39 (m，3H)；¹³C NMR (151MHz，CDCl₃)δ：173.47，155.2，149.75，128.42，115.13，79.67，67.87，64.89，49.24，29.41，28.34，26.29，25.68，18.53；MALDI-TOF-MS m/z：C₁₅₅H₂₄₀N₁₀O₅₀，3066.65，[M+Na]⁺。

  DAP5的合成：向盛有10mL 1, 4-二氧六环的25mL圆底烧瓶中加入0.6g(0.2mmol)BDAP5，通入HCl气体，搅拌回流，溶液慢慢析出白色不溶物，4h后停止反应。过滤得到白色固体，用甲醇/乙醚重结晶，真空干燥后得到黄棕色固体化合物DAP5，产率65%，熔点241.7℃，¹H NMR (600MHz，D₂O)δ：6.73(d，J=39.9Hz，1H)，4.38~4.18(m，2H)，4.11(dd，J=12.9、5.9 Hz，1H)，3.82~3.61(m，3H)，1.73(d，J=48.8Hz，4H)，1.52~1.39(m，3H)；¹³C NMR (151MHz，D₂O)δ：170.79，150.19，129.30，116.45，69.11，66.75，48.80，25.37，24.90，15.27，14.1；MALDI-TOF-MS m/z：C₁₀₅H₁₆₀N₁₀O₃₀，2042.12，[M]⁺(见图 1)。

  图 1

  

  图 1.  化合物DAP5的MALDI-TOF-Mass谱图

  Figure 1.  MALDI-TOF mass analysis of compound DAP5

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  1.3   纳米载体SDBS⊂DAP5的制备

  向装有0.075mL 5mmol/L SDBS水溶液的5mL容量瓶中加入0.125mL 1mmol/L的DAP5水溶液，加去离子水稀释，摇匀，定容，静置，用红色激光笔照射，观察到明显的丁达尔效应，表明组装体形成。

  1.4   纳米载药体系DOX⊂SDBS⊂DAP5的构筑

  分别向装有SDBS水溶液(浓度均为：5mmol/L，0.075mL)的容量瓶(5mL)中加入DAP5水溶液(1mmol/L，0.125mL)，加去离子水稀释，摇匀，静置，观察到明显的丁达尔效应，说明组装体已形成，再快速加入DOX·HCl溶液(1mmol/L，0.125mL)，定容，超声30min，置于4℃冰箱中保存备用。载药后，溶液颜色由无色变为橘黄色，主体DAP5、客体SDBS、药物DOX最后浓度分别为：2.5×10^-5、7.5×10^-5、2.5×10^-5mol/L。根据式(1)和式(2)计算药物的包封率(EE)及包载率(DLE)。

  $ \begin{gathered} \text { EE ( % })=m_{\text {Dox-loaded }} / m_{\text {Dox }} \times 100 \end{gathered} $

  (1)

  $ \text { DLE ( % })=m_{\text {Dox-loaded }} / m_{\mathrm{NPs}} \times 100 $

  (2)

  其中，m_DOX-loaded、m_DOX和m_NPs分别表示DOX的包载质量、DOX初始添加质量和载药囊泡质量。

  1.5   药物释放实验

  缓冲溶液配置：选用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(CPBS)作为药物释放介质，配制0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液(母液A)和0.1mol/L柠檬酸水溶液(母液B)，调配不同比例的A和B两母液，选取pH=6.2(A/B=13.22/6.78，体积比)和pH=4.8(A/B=9.86/10.14，体积比)的缓冲溶液，模拟肿瘤的弱酸性微环境。

  药物缓释：将5mL×2载药囊泡(DOX⊂SDBS⊂DAP5)溶液装入透析袋内(节流分子量3500)，分别置于两个装有20mL pH=4.8和pH=6.2缓冲溶液的烧杯内，在37℃恒温水浴中搅拌，每隔一定时间从烧杯内取出2mL溶液测定DOX在480nm处紫外吸光度，再向烧杯内倒入2mL新鲜的缓冲溶液。根据DOX的紫外吸光度-浓度标准曲线计算DOX浓度，并进一步计算药物的累积释放率。

  1.6   MTT实验

  用含10%胎牛血清的培养液配成单个细胞悬液，用细胞计数板计数，细胞浓度为1×10⁵个/mL，用排枪将Hela、HepG2、MGC-803、T-24、LO2细胞接种到96孔板，每孔体积180μL，在96孔板加入相同体积的PBS缓冲液，轻微拍打96孔板四周，使细胞分布均匀，放入培养箱继续培养。待96孔板中的细胞长满至70%~80%加入待测药物，设5个药物浓度梯度，每个浓度设置4个复孔，每孔20μL，将药物稀释成最终浓度为5、2.5、1.25、0.625、0.3125 μmol/L，阴性对照用培养基和DMSO配制不同浓度梯度。相同培养条件，载药系统和裸药分别与四种肿瘤细胞培养6、12、24、48 h，LO2细胞培养48h，空载系统作用于四种肿瘤细胞以及LO2细胞培养48h，并在相应的时间加入MTT(5mg/mL)，每孔20μL，继续孵育4h，终止培养，小心吸取孔内培养上清液，每孔加入150μL DMSO溶液，振荡10min，使结晶物充分溶解。选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔吸光度(OD)值。

  2.   结果与讨论

  2.1   目标化合物的合成

  如图式 1所示，首先以对苯二酚和二溴丁烷为原料合成中间体化合物2，然后在FeCl₃/DCM体系中与多聚甲醛一步反应制备全溴取代柱[5]芳烃(3)，接着与D构型的N-Boc-丙胺酸通过亲核取代反应生成N-Boc-丙胺酸酯柱[5]芳烃(DBAP5)，随后在HCl/dioxan体系中进行Boc脱保护反应生成目标化合物DAP5。目标化合物的结构经¹H NMR、¹³C NMR和MALDI-TOF-MS确证。

  2.2   主客体作用及纳米载体的构筑

  选用阴离子表面活性剂SDBS作为客体，通过¹H NMR研究了DAP5与SDBS的主客体作用。如图 2所示，在加入等当量的DAP5后，观察到客体SDBS上氢的化学位移和峰形发生明显变化，客体SDBS的长烷基链的H^c的化学位移明显向高场移动(Δδ=1.1)，H^d~m的化学位不仅移向高场，且峰形变宽几乎消失于基线中，与之前报道的部分二卤代烃络合在柱芳烃空腔内形成的^[2]准轮烷分子类似^[15]；同时苯环上H^a和H^b的化学位移则略向低场移动，这表明客体SDBS上的长烷基链在疏水作用和CH-π作用下进入主体空腔内形成^[2]准轮烷分子，而末端的磺酸基阴离子则与主体的胺基阳离子之间在空腔外发生静电作用。

  图 2

  

  图 2.  核磁氢谱图(600MHz，D₂O，298K)：(a)SDBS；(b)SDBS+1eq. DAP5；(c)DAP5

  Figure 2.  ¹HNMR spectra (600MHz, D₂O, 298K) of (a) SDBS, (b) SDBS+1eq. DAP5, and (c)DAP5

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  DAP5与SDBS作用后，发生明显的丁达尔现象(图 3(f))，表明该主客体络合物可进一步形成超分子自组装体SDBS⊂DAP5。采用透射电镜(TEM)、动态光散射(DLS)及原子力显微镜(AFM)对其形貌结构和尺寸进行了表征分析。如图 3和图 4所示，DAP5⊂SDBS复合物在水溶液自组装成球形纳米粒结构，DLS测得该纳米粒子的平均水合粒径为154nm，与TEM(140nm)和AFM(138nm)所测结果相吻合。通过Zeta电位测得该聚集体的ζ-电位为43mV，表明该聚集体为表面带正电荷的粒子，彼此之间具有较强的排斥力，适合在水溶液中稳定存在，AFM亦证明该纳米粒子在水溶液中24h内未发生明显的解组装行为(图 4)。综上，DAP5与SDBS在水溶液中首先通过主客体作用形成^[2]准轮烷，然后在疏水作用的驱动下自组装成超分子纳米粒(如图式 1所示)。

  图 3

  

  图 3.  (a) DAP5⊂SDBS的TEM图；(b)DAP5⊂SDBS的DLS图；(c) DAP5⊂SDBS的Zeta电位图；(d)DOX⊂DAP5⊂SDBS的TEM图；(e) DOX⊂DAP5⊂SDBS的DLS图；(f)DAP5⊂SDBS的丁达尔效应

  Figure 3.  TEM image of DAP5⊂SDBS; (b)DLS data of DAP5⊂SDBS; (c) Zeta of DAP5⊂SDB; (d) TEM image of DOX⊂DAP5⊂SDBS; (e)DLS data of DOX⊂DAP5⊂SDBS and (f) optical images showing the Tyndall effect of DAP5⊂SDB

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  图 4

  

  图 4.  DAP5⊂SDBS的AFM图(a)0.5h和(b) 24h

  Figure 4.  AFM image of DAP5⊂SDBS in (a) 0.5 h and (b) 24 h

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  2.3   载药性能及药物缓释

  选择抗肿瘤药物DOX·HCl作为模型药物，考察了上述超分子纳米粒SDBS⊂DAP5的载药性能及在模拟肿瘤细胞弱酸性环境的药物释放性能。为了制备DOX纳米粒，将DOX的水溶液快速加入含有DAP5和SDBS的水溶液中([SDBS]/[DAP5]=3∶1)。静置过夜后，用纯水透析除去未包载的DOX，直到透析管外的水溶液显示出可忽略的DOX特征紫外吸收。空白载体在波长为400~600 nm区域范围内没有吸收峰，携带DOX的药物载体在波长为400~700 nm区域内出现DOX特征吸收峰，如图 5(a)所示，说明纳米粒子包含有DOX分子。TEM图片(图 3(d))显示载药后的纳米粒仍为球形结构，直径约190nm，与DLS所测(192.3nm)较为接近，且比空白纳米粒的尺寸(154nm)更大，进一步证实DOX分子已成功负载在纳米粒中。根据DOX的紫外吸光度-浓度标准曲线计算DOX的包封率和载药率分别为62.6%和9.36%。药物缓释性能研究表明，在弱酸性环境下，药物12h内可持续释放且释放速度加快，如图 5(b)所示，经过12h透析后，累计释放率为72.2%(pH=4.8)和57%(pH=6.2)，而在纯水中(pH=7.0)药物的累积释放率为36.6%。结果表明，所构筑的纳米载药系统具有pH响应性能，在药物的释放方面具有潜在的应用。

  图 5

  

  图 5.  (a) 空白载体、载药体系及裸药的紫外吸收光谱图和(b)载药体系的pH响应释放曲线

  Figure 5.  (a) Spectra of UV-Vis absorption of carrier SDBS⊂DAP5, loaded-drug system DOX⊂SDBS⊂DAP5 and free DOX; (b) Stimuli-responsive release behavior of loaded-drug system DOX⊂SDBS⊂DAP5

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  2.4   抗肿瘤活性

  采用MTT法测试了载药体系DOX⊂SDBS⊂DAP5、载体SDBS⊂DAP5及裸药DOX对Hela、HepG2、MGC-803和T24的增殖抑制活性，同时考察了载体对正常肝细胞LO2的毒性。如表 1所示，SDBS⊂DAP5载体对四种癌细胞和正常细胞均具有相对较低的细胞毒性(IC₅₀>10μmol/L)，说明丙氨酸侧链的引入可以成功构筑出低毒性的纳米载体。重要的是构筑的载药体系对测试的肿瘤细胞均具有较好的抑制活性，与裸药DOX相比，具有更低IC₅₀，即抗肿瘤抑制活性显著增强，且在较短的时间内体现出较好的抑制效果(图 6)，其中对于HepG2效果更为显著，作用24h后，其IC₅₀为0.77μmol/L，约为裸药DOX(3.43μmol/L)的22%。以上结果表明所构筑的超分子载药体系在肿瘤的治疗中具有潜在的应用价值，值得进一步研究。

  表 1

  

  表 1  载药纳米粒子DOX⊂SDBS⊂DAP5、裸药DOX·HCl和空载纳米粒子SDBS⊂DAP5对肿瘤细胞和正常细胞的抑制活性

  Table 1.  Inhibitory activity of drug-loaded nanoparticles DOX⊂SDBS⊂DAP5, free DOX·HCl and unloaded nanoparticles SDBS⊂DAP5 against tumor cells and normal cell

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  Tumor cells	IC50/(μmol/L)
  	DOX⊂SDBS⊂DAP5					DOX·HCl					SDBS⊂DAP5
  	6h	12h	24h	48h		6h	12h	24h	48h		48h
  Hela	>10	0.98±0.14	0.46±0.04	0.29±0.08		>10	2.5±0.17	0.78±0.06	0.71±0.09		>10
  HepG2	>10	4.41±0.33	0.77±0.01	0.58±0.07		>10	4.45±0.34	3.43±0.06	0.70±0.07		>10
  MGC-803	>10	2.08±0.07	1.63±0.18	0.66±0.09		>10	4.64±0.47	2.40±0.22	0.94±0.06		>10
  T-24	>10	2.55±0.1	1.65±0.14	1.47±0.24		>10	2.79±0.03	1.76±0.45	1.35±0.08		>10
  LO2	-	-	-	-		-	-	-	-		2.01±0.59

  图 6

  

  图 6.  载药体系DOX⊂SDBS⊂DAP5和裸药DOX·HCl(2.5μmol/L)的体外细胞毒性：(a)Hela、(b)HepG2、(c)MGC-803、(d)T-24

  Figure 6.  In Vitro cytotoxicities of DOX-loaded nanoparticles and free DOX·HCl ([DOX]=2.5 μmol/L) against Hela cell (a), HepG2 cell (b), MGC-803 cell (c) and T-24 cells (d), respectively, in different incubation time

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  3.   结论

  合成了一种新型的水溶性柱[5]芳烃DAP5，通过主客体作用构筑了一种球形的超分子纳米载体SDBS⊂DAP5，其可高效负载抗癌药物DOX，在模拟肿瘤细胞弱酸性环境下能够进行药物可持续释放。该纳米载体对宫颈癌细胞(Hela)、肝癌细胞(HepG2)、胃癌细胞(MGC-803)、膀胱癌细胞(T24)和正常肝细胞LO2均具有较低的毒性，且构筑的纳米载药体系DOX⊂SDBS⊂DAP5对所测试肿瘤细胞的抑制活性相比裸药显著增强。本文研究结果可为开发新型的抗肿瘤纳米药物提供参考。

  
  
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      Yu G C, Yu W, Mao Z W, et al. Small, 2015, 11: 919~925. doi: 10.1002/smll.201402236

  23. [23]

      Liu L Z, Duan W G, Kou Y H, et al. Chin. J. Chem., 2015, 33(3): 346~350. doi: 10.1002/cjoc.201400879

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  图式 1  水溶性柱[5]芳烃DAP5的合成路线和构筑超分子纳米载体及药物释放示意图

  Scheme 1  Synthesis route of water soluble pillar^[5] arene DAP5 and the formation of supramolecular nanoparticle and its drug release

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  图 1  化合物DAP5的MALDI-TOF-Mass谱图

  Figure 1  MALDI-TOF mass analysis of compound DAP5

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  图 2  核磁氢谱图(600MHz，D₂O，298K)：(a)SDBS；(b)SDBS+1eq. DAP5；(c)DAP5

  Figure 2  ¹HNMR spectra (600MHz, D₂O, 298K) of (a) SDBS, (b) SDBS+1eq. DAP5, and (c)DAP5

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  图 3  (a) DAP5⊂SDBS的TEM图；(b)DAP5⊂SDBS的DLS图；(c) DAP5⊂SDBS的Zeta电位图；(d)DOX⊂DAP5⊂SDBS的TEM图；(e) DOX⊂DAP5⊂SDBS的DLS图；(f)DAP5⊂SDBS的丁达尔效应

  Figure 3  TEM image of DAP5⊂SDBS; (b)DLS data of DAP5⊂SDBS; (c) Zeta of DAP5⊂SDB; (d) TEM image of DOX⊂DAP5⊂SDBS; (e)DLS data of DOX⊂DAP5⊂SDBS and (f) optical images showing the Tyndall effect of DAP5⊂SDB

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  图 4  DAP5⊂SDBS的AFM图(a)0.5h和(b) 24h

  Figure 4  AFM image of DAP5⊂SDBS in (a) 0.5 h and (b) 24 h

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  图 5  (a) 空白载体、载药体系及裸药的紫外吸收光谱图和(b)载药体系的pH响应释放曲线

  Figure 5  (a) Spectra of UV-Vis absorption of carrier SDBS⊂DAP5, loaded-drug system DOX⊂SDBS⊂DAP5 and free DOX; (b) Stimuli-responsive release behavior of loaded-drug system DOX⊂SDBS⊂DAP5

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  图 6  载药体系DOX⊂SDBS⊂DAP5和裸药DOX·HCl(2.5μmol/L)的体外细胞毒性：(a)Hela、(b)HepG2、(c)MGC-803、(d)T-24

  Figure 6  In Vitro cytotoxicities of DOX-loaded nanoparticles and free DOX·HCl ([DOX]=2.5 μmol/L) against Hela cell (a), HepG2 cell (b), MGC-803 cell (c) and T-24 cells (d), respectively, in different incubation time

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  表 1  载药纳米粒子DOX⊂SDBS⊂DAP5、裸药DOX·HCl和空载纳米粒子SDBS⊂DAP5对肿瘤细胞和正常细胞的抑制活性

  Table 1.  Inhibitory activity of drug-loaded nanoparticles DOX⊂SDBS⊂DAP5, free DOX·HCl and unloaded nanoparticles SDBS⊂DAP5 against tumor cells and normal cell

  Tumor cells	IC50/(μmol/L)
  	DOX⊂SDBS⊂DAP5					DOX·HCl					SDBS⊂DAP5
  	6h	12h	24h	48h		6h	12h	24h	48h		48h
  Hela	>10	0.98±0.14	0.46±0.04	0.29±0.08		>10	2.5±0.17	0.78±0.06	0.71±0.09		>10
  HepG2	>10	4.41±0.33	0.77±0.01	0.58±0.07		>10	4.45±0.34	3.43±0.06	0.70±0.07		>10
  MGC-803	>10	2.08±0.07	1.63±0.18	0.66±0.09		>10	4.64±0.47	2.40±0.22	0.94±0.06		>10
  T-24	>10	2.55±0.1	1.65±0.14	1.47±0.24		>10	2.79±0.03	1.76±0.45	1.35±0.08		>10
  LO2	-	-	-	-		-	-	-	-		2.01±0.59

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