细胞色素P450酶(cytochrome P450 enzymes)是一类含有B型血红素(heme B)的蛋白超家族, 血红素作为P450酶的辅基与绝对保守的半胱氨酸相连, 使得其还原态与一氧化碳结合时在450 nm处产生特征吸收峰而得名[1].在自然界中P450酶主要参与人体对药物和毒素的代谢反应、植物及微生物次级代谢产物的生物合成过程以及一些微生物降解途径等; 其催化反应类型多达20余类, 如羟化、环氧化、脱烷基化、碳-碳偶联、氧化裂解等[2].细胞色素P450酶能在温和条件下催化复杂化合物中惰性C—H键的区域和立体选择性氧化反应, 具有化学氧化难以比拟的优势, 因而被广泛用于生产药物、维生素、香料、杀虫剂等高附加值产品[3].
近年来, 随着人们对P450酶催化机制的深入认识, 发现其催化循环中不同的反应中间体负责驱动不同的化学反应类型, 为改造并利用该类“万能生物催化剂”赋予了理论基础[4].与此同时, 有机化学家和生物化学家们也逐渐将目光更多地投向了对P450酶及其衍生酶或仿酶的设计改造, 利用理性设计和定向进化等策略不断拓宽P450酶在合成重要有机分子过程中的应用, 以期解决化学氧化过程中选择性控制困难、副产物多、反应条件苛刻、依赖贵金属或有毒试剂带来的环境不友好等诸多问题[5].目前, 一些人工改造获得的新型P450催化剂, 不但可以一步催化完成一些有机合成化学方法极难突破的反应类型, 而且开始创造新型生物催化反应, 展现出强大的催化潜力和广阔的应用前景.
P450酶广泛分布于自然界不同阶元的生命体中, 包括人类、动物、植物、微生物, 甚至病毒等[2a, 6]. 1968年首次被成功纯化的P450体系来源于兔肝微粒体(microsome), 随着哺乳动物P450酶的不断表征, 越来越多的证据显示哺乳动物中至少存在一种以上的微粒体P450酶[2a, 7].近年来随着基因组高通量测序及分析技术的长足进步, 已知人类基因组上的P450基因数为57个, 在其它重要模式生物如结核分枝杆菌、线虫、果蝇及植物拟南芥中都发现存在不同数量的P450基因[2a, 8].为了规范越来越多P450酶的记录和分类, Nelson等提出了目前被广泛接受的P450酶系统命名法[9].根据P450酶蛋白序列的同源性, 序列等同度＞40%的归为族(family: 1, 2, 3……); 等同度＞55%的归为亚族(subfamily: A, B, C……), 接着再对亚族中不同的P450酶进行编号(1, 2, 3……), 如CYP3A4、CYP152A1等.
由于几乎所有P450酶都需要利用氧化还原伴侣蛋白(redox partner protein)从NAD(P)H依次传递两个电子到血红素反应中心来激活分子氧以完成催化过程[2a], 根据氧化还原伴侣的不同类型可将P450催化系统分为五个主要类型:第一类(Class Ⅰ)为三组分系统, 包括P450酶、含铁硫簇(FexSy)的铁氧化还原蛋白(ferredoxin, 缩写为Fdx)以及含有一分子黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的铁氧化还原蛋白还原酶(ferredoxin reductase, 缩写为FdR), 原核生物与真核生物线粒体的P450酶往往属于此类; 第二类(Class Ⅱ)为双组分系统, 多见于真核生物(动植物及真菌等)来源的P450酶, 其氧化还原伴侣为同时含有FAD和黄素单核苷酸(FMN)的细胞色素P450还原酶(CPR)[1a]; 第三类(Class Ⅲ)和第四类(Class Ⅳ)均为单组分系统, 以来自巨大枯草芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的P450 BM3为典型代表的Class Ⅲ系统中P450结构域与含FAD/FMN的氧化还原伴侣结构域天然融合[10]; 而Class Ⅳ系统中P450结构域则与含Fe2S2/FMN的氧化还原伴侣结构域天然融合.此外, 自然界中还存在少量不需要氧化还原伴侣, 直接从NAD(P)H获取电子的P450酶(Class Ⅴ), 如一氧化氮还原酶P450 nor等[11].值得一提的是, 由于Class Ⅲ~Ⅴ系统无需独立的氧化还原伴侣蛋白支撑催化活性, 因此均被称为自给自足型(self-sufficient) P450酶.
细胞色素P450酶具有一个共同的整体折叠形式和拓扑结构[12].保守的P450结构核心是由三个平行的α螺旋结构D、L、I以及一个反平行的α螺旋结构E组成的四螺旋束[13](图 1).绝对保守的半胱氨酸的硫原子与血红素铁(heme-iron)配位相连, 并与相邻的主链酰胺基团形成两个氢键.虽然P450酶整体折叠形式是高度保守的, 但其“底物识别位点” (substrate recognition sites, SRSs)[14]的序列和结构多样性足以支撑不同P450酶与结构各异的底物识别/结合[6].一般认为P450酶的底物特异性是由6个SRSs[14], 即6个非保守蛋白区域序列所控制, 包括B'螺旋区域(SRS1)、F和G螺旋的一部分(SRS2和SRS3)、螺旋I的一部分(SRS4)、螺旋K的β发夹区(SRS5)以及β2连接区域(SRS6), 上述结构区域在诱导契合机制下与不同底物结合, 随后进行催化反应[15].
(a) The crystal structure with secondary structures; (b) the substrate recognition sites, SRS1, SRS2, SRS3, SRS4, SRS5, and SRS6
绝大多数的细胞色素P450酶具有类似的催化过程, 通过产生高反应活性中间体来催化各种化学反应.恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)来源的P450cam[16]首次被发现经历连续两个电子还原和存在多个活性中间体, P450酶的催化循环从1968年第一次提出后不断完善[6, 17], 直至获得如Scheme 1所示的经典催化循环模型. P450酶催化循环始于血红素FeⅢ六配位的静息态(中间体A), 底物的结合通过驱离一个配位的水分子来提高FeⅢ的氧化还原电位(中间体B), 从而启动第一个来自NAD(P)H由氧化还原伴侣介导的电子传递, 五配位的FeⅢ被还原为FeⅡ(中间体C), 进而与分子氧结合形成铁超氧化物络合物[Cys-FeⅡ-O2]与[Cys-FeⅡ-OO]－(中间体D和E), 随后催化中心获得第二个电子形成铁过氧中间体[Cys-FeⅢ-OO]2－(中间体F1), 该中间体会被迅速质子化形成铁氢过氧化物[Cys-FeⅢ-OOH]－, 即中间体F2, 接着第二个质子化和O—O键的异裂伴随着失去一个水分子获得高铁氧中间体[Cys-FeⅣ＝O]+•, 即Compound Ⅰ, 这个具有极高反应活性的中间体能够夺取底物中临近C—H键的氢原子, 产生底物自由基和[Cys-FeⅣ-OH], 即Compound Ⅱ, 其中羟基与底物自由基重新结合后形成的羟化产物(中间体Ⅰ)从活性位点释放, P450酶重新恢复至起始静息态, 完成整个催化循环.
虽然大多数P450酶都需要氧化还原伴侣蛋白将来自NAD(P)H的两个电子传递到血红素铁反应中心激活氧分子. P450酶亦可直接利用过氧化氢通过“走捷径”(shunt pathway, Scheme 1)的方式来完成催化反应[18], 即中间体B可以跳过电子传递步骤直接与过氧化氢结合形成中间体F2.例如CYP152家族成员P450 OleTJE即可利用过氧化氢为氧供体和电子供体, 高效催化游离脂肪酸的氧化性脱羧反应[19].
P450酶催化反应类型具有高度多样性, 其催化机制也不尽相同.例如脱羧反应、醇或醛的氧化反应等的催化机制与羟化反应类似(Scheme 1), 由Compound Ⅰ拔取氢原子; 然而, 也有一些P450酶并不使用Compound Ⅰ催化反应, 例如中间体F1或F2能够介导环氧化和磺化反应, 在一些情况下还可以催化C—C键裂解反应[20]等.此外, 中间体E被认为在P450酶催化的硝化反应中具有重要作用[21].
细胞色素P450酶是自然界催化多能性最高的生物催化剂, 不仅能够催化多种反应类型, 而且具有极为宽泛的底物谱, 可以识别芳香族、聚酮类、萜类、肽类、糖类等诸多结构类型的底物.其催化反应类型包括羟化反应、环氧化反应、成环反应、偶联反应、碳-碳裂解反应、官能团迁移反应、消除反应、脱羧反应、脱烷基化反应、硝化反应、胺化反应、反马氏加成及Kemp消除反应等.
兼具位点和立体选择性的羟化反应被认为是P450酶最为常见且极具工业应用价值的反应, 其对复杂底物的骨架结构没有显著改变, 但是对于化合物水溶性及生物活性的提高具有重要作用[22].一个应用广泛的案例是利用P450酶选择性羟化维生素D3生成1α, 25-OH维生素D3, 一种治疗骨质疏松和慢性肾功能衰竭的药物. 1α, 25-OH维生素D3可由胆固醇经过20多步化学合成步骤得到, 但整体收率不足1%[23].因此, 可直接羟化的P450酶法转化倍受关注.研究发现在变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)中异源表达CYP105A2(又名P450VD25), 可以催化维生素D3的25位选择性羟化得到25-OH维生素D3[24]; 随后, Yasutake等[25]报道了分离于自养无枝酸菌(Pseudonocardia autotrophica)的CYP107家族成员P450Ⅴdh能够催化维生素D3连续羟化生成为1α, 25-羟基维生素D3 (Scheme 2).
直链烷烃中亚甲基C—H键的高惰性以及缺乏介导催化作用的官能团使得该类化合物的选择性羟化极具挑战, 使用仿生过渡金属配合物作为催化剂和过氧化物作为氧化剂对烷烃氧化的选择性控制十分困难; Arnold等[26]通过定向进化改造P450 BM3, 获得的突变体BM3 9-10A-A328Ⅴ可以催化辛烷选择性羟化生成S-2-辛醇(40% ee), 总转换数(TTN)可达2000 (Eq. 1);烷烃在常温下的选择性氧化具有潜在的工业价值, 一直以来, P450酶虽然被发现可以氧化很多烷烃, 但对于如乙烷甚至甲烷的羟化活性一直未被发现, Wong等[27]通过改造来自于恶臭假单菌的P450cam在体外实现了乙烷直接氧化生成乙醇, 为气态烷烃的生物转化提供新思路(Eq. 2).
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烷基酚中烷基侧链的选择性氧化一直都是有机合成中的难题.近期, 我们[28]发现谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)来源的Class Ⅰ P450酶催化系统CreJEF (CreJ、CreE和CreF分别为P450酶、FdR和Fdx)联合磷酸化酶CreHI与水解酶CreD形成一种独特的生物氧化系统, 通过由CreHI介导的磷酸基团的“安装”、CreJEF对磷酸化中间体的氧化以及CreD对氧化产物磷酸基团的“卸载”, 成功实现了一系列对位和间位烷基酚中烷基侧链的选择性氧化.由于该法与化学氧化中“保护/氧化/去保护”的策略如出一辙, 我们将其命名为“仿化”(chemomimetic)生物氧化系统(Scheme 3).以对乙酚和间乙酚为例, 上述系统可选择性地生成S构型(ee＞99%)的苄位羟化产物.
环氧化合物是一类用途广泛的有机合成中间体, 在化工及生物医药领域扮演着重要的角色.目前有机合成中环氧化反应体系涉及多步保护的化学催化, 副产物多, 收率低[29].碳-碳双键的环氧化反应在天然产物和药物合成等过程中较为普遍, 例如大环内酯类抗肿瘤化合物埃博霉素C和D可以被纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)中P450 EpoK催化, C(12)＝C(13)双键环氧化生成埃博霉素A和B, 活性得到显著提高[30](Eq. 3).
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末端烯烃的不对称环氧化反应在化学催化体系的建立中多涉及钛-钽酸盐或铁-卟啉络合物等较为复杂的催化剂, 相较简单有效的线性叔胺烯烃的不对称催化剂尚未出现[31]; Arnold等[32]利用定向进化技术改造细胞色素P450 BM3, 以1-己烯为底物, 获得两个高活性突变体SH-44和RH-47, 可将一系列末端烯烃(C5~C8)转化为R-或S-环氧化合物(ee值可达83%), 并具有很高的环氧化反应选择性(可达95%) (Eq. 4).
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相较于纯粹的羟化和环氧化反应, 多功能细胞色素P450酶介导的连续羟化或者环氧化的组合式反应也受到广泛关注[33].例如, 来自稀有放线菌淡灰红小单孢菌(Micromonospora griseorubida)的P450单加氧酶MycG可以连续羟化和环氧化十六元环大环内酯类抗生素麦新米星Ⅳ (mycinamicin Ⅳ), 生成麦新米星Ⅴ和麦新米星Ⅱ; MycG还可以直接催化麦新米星Ⅳ的C(12)＝C(13)环氧化生成麦新米星Ⅰ[34](Scheme 4).
成环反应是一类应用范围广泛的有机合成反应, 能显著改变一些化合物如天然产物与合成药物的结构骨架和活性[22].成环反应可细分为环化反应、扩环反应和缩环反应.
P450酶可以通过不同机制催化分子内环化反应.例如来自Penicillum aethiopicum的P450酶ⅤrtK具有类似于Ⅱ型萜类环化酶的功能, 通过形成关键的碳正离子中间体以及进一步的电子重排实现萜类侧链环化, 从而建立独特的螺双环系统, 实现鲜绿青霉毒素前体previridicatumtoxin中的香叶基环化生成鲜绿青霉毒素(viridicatumtoxin)[35](Scheme 5).手性环丙烷作为特殊结构单元存在于西司他汀、除虫菊酯等多种药物分子中, 一直是有机合成化学中的热点; Arnold研究组[36]通过研究发现P450BM3 T268A突变是实现苯乙烯高活性环丙烷化的关键, 进一步优化的突变体9-10A-TS-F87Ⅴ- T268A可以形成ee值＞90%的非对映异构体, 且显示出对底物的强烈偏好(cis:trans＝71:29), 是一个有效的环丙烷化催化剂(TTN＝199) (Scheme 5).
扩环反应是比较罕见的P450酶催化反应, 通常是底物进入P450酶活性口袋经分子内化学键重排形成更稳定的五元环或六元环结构单元[2a].例如昆虫病原真菌Beauveria bassiana产生2-吡啶酮天然产物卵孢白僵菌素(tenellin)的过程中, P450酶TenA通过Compound Ⅰ夺取氢原子引发重排导致pretenellin-A氧化扩环形成pretenellin-B [37](Scheme 6).
CYP3A4可以催化2, 2, 6, 6-四甲基哌啶缩环生成2, 2-二甲基四氢吡咯; Watanabe等[38]发现P450酶FtmG可以催化烟曲霉(Aspergillus fumigatus)中去甲氧基烟曲霉毒素C (demethoxyfumitremorgin C)中六元环缩环为五元环, 形成吲哚类生物碱spirotryprostatin B等(Scheme 7).
芳基偶联反应是有机合成反应中的重要难题之一, 因为需要同时兼顾立体选择性和位点选择性. C—C键和C—O键的芳基偶联反应较常见于P450酶介导的植物和真菌天然产物(如生物碱)的生物合成反应以及细菌中抗生素的生物合成过程[39], 包括分子内芳基偶联反应和分子间芳基偶联反应.
在植物的次级代谢过程中常见到分子内芳基偶联反应[40], 例如镇痛剂生物碱吗啡的生物合成就含有一步较为典型的由P450酶介导的分子内芳基偶联反应, 来源于罂粟(Papaver somniferum)的CYP719B1催化R-网脉碱(R-reticuline)分子内C—C苯基偶联形成沙罗泰里啶(salutaridine)[41].另一个可以催化分子内C—C苯酚偶联的是来源于日本柳杉(C. japonica)的CYP80G2, 可将S-网脉碱(S-reticuline)转化为S-紫堇块茎碱(S-corytuberine)[42](Scheme 8).
Müller等[43]报道了真菌可以利用Class Ⅱ P450酶进行具有区域和立体选择性的酚类化合物分子间偶联, 例如来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的P450酶KtnC可在重组酿酒酵母(Saceharomyces cerevisiae)细胞中催化单体香豆素7-demethylsiderin通过具有高区域和立体选择性的分子间偶联生成二聚体P-orlandin; P450酶DesC也可以催化7-demethylsiderin发生选择性不同的双分子偶联形成M-desertorin A.一些植物来源的P450酶也可以催化分子间C—O芳基偶联反应, 如小檗属植物(Berberis stolonifera)中的CYP80A1作为黄芦木碱合成酶催化R-和S-N-甲基乌药碱(R/S-N-methylcoclaurine)的分子间C—O偶联生成双苄基异喹啉类生物碱黄芦木碱(berbamunine)[44]等(Scheme 9).
碳-碳键的断裂反应在有机合成反应中不仅可实现全新碳骨架的构建, 而且能够同时引入两个不同的官能团.传统有机合成中通常使用过渡金属作为催化剂帮助实现碳-碳键的断裂, 而P450酶可以实现一步断键高效合成多官能团化合物.断马钱子苷(secologanin)是单萜吲哚生物碱如抗肿瘤药物长春花碱(vinblastine)合成的重要前体, 由CYP72A1催化长春花(catharanthusroseus)马钱子苷(loganin)中环戊烷的分子内开环反应生成[45]; 烟曲霉素(fumagillin)是由烟曲霉(A. fumigatus)产生的高氧杂萜, 具有抑制血管生成的作用, 多功能细胞色素P450酶Fma-P450在其核心骨架的构造中起着关键作用, 尤其是能够催化双环倍半萜β-反式香柠檬烯(β-trans-bergamotene)中C—C键的氧化裂解[46] (Scheme 10).
官能团迁移反应是一种较为快速构建复杂有机分子的有效方法, 在有机化学中迁移位点的选择性一直都是研究的热点和难点.在一些植物来源的天然产物如2-羟基异黄酮(2-hydroxyisoflavanone)的生物合成中就涉及到P450酶催化的C—C键迁移反应. 2-羟基异黄酮是主要存在于豆科植物中的一类化学防御剂, 来自刺甘草(Glycyrrhiza echinata L.)的CYP93C2可以催化2S-黄烷酮(2S-flavanone) C(2)位置的酚环重排到C(3)位置, 进而生成2-羟基异黄酮[47].官能团的迁移反应也存在于一些药物分子的生物合成途径中, 如水仙子(Hyoscyamus nigar)中的CYP80F1可以催化R-littorine进行莨菪烷环的碳骨架重排形成的天仙子胺醛(hyoscyamine aldehyde), 是一种治疗眩晕药物S-东莨菪碱(S-scopolamine)的直接前体物质[48](Scheme 11).
除了上文提到的催化反应类型, 一些非常规的催化反应更加全面地展现了细胞色素P450酶多能的一面. P450酶催化的脱羧反应之前一直被认为只存在于药物合成和代谢过程中, 直到2011年来自于咸海鲜球菌(Jeotgalicoccus sp. ATCC 8456)的P450过氧化物酶OleTJE被发现可以催化脂肪酸的氧化性脱羧合成一种十分重要的基础化工原料α烯烃.近年来针对该类P450脂肪酸脱羧酶的研发为未来生物燃料、合成润滑油、聚合材料及洗涤剂等化工产品的生物合成开辟了新道路[19](Eq. 5).
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有机合成中脱烷基化反应很容易伴随副产物的生成, 因此专一性强的生物催化剂在脱烷基化应用中具有很大的潜力.对一些生物碱天然产物尤其是三级胺结构的改造经常会用到脱烷基化反应, 许多细胞色素P450酶可以催化脱烷基化反应, 主要包括N-脱烷基化、O-脱烷基化和S-脱烷基化.在一些体内由P450酶系介导的药物分子代谢中常涉及到N-脱烷基化的作用, 如抗抑郁药物丙米嗪(imipraminum)可以被CYP2C19与CYP1A2催化N-脱烷基化代谢为活性物质地昔帕明(desipramine)[49](Eq. 6)等.
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硝基化芳香族化合物是一种重要的化工原料, 被广泛应用于食品添加剂、高能材料及药品合成中; 但面对有机合成中的高污染、低产率等问题, 来自链霉菌(Streptomyces scabiei)的细胞色素P450酶TxtE (CYP1048A1)有望为解决这些问题提供新的思路. TxtE能够通过独特的质子转移途径, 利用NO、O2及NADPH实现特异性催化L-色氨酸吲哚环C(4)位的硝基化反应, 形成4-硝基色氨酸[21, 50](Eq. 7).
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因含氮官能团在天然产物中较为常见, 且在生物医药领域应用广泛, 高选择性的C—H键胺化受到广大有机化学家们的高度关注. C—H键胺化在有机合成中过度依赖昂贵的过渡金属, 如已报道的钌、铑等作为催化剂, 科学界长时间并未发现有P450酶可以直接催化该类反应的先例.近期Arnold等[51, 52]发现P450 BM3能够以较低效率催化烷烃分子内C—H键胺化生成苄胺, 氨基化试剂甲苯磺酰亚胺先与亚铁卟啉生成的铁氮化物中间体, 之后类氮化合物插入到烷烃的C—H键中进而形成苄胺产物.经过在一些位点(如半胱氨酸)进行突变之后, 活性得到大幅提高[51]; 进一步以P450 BM3为模板, 利用定向进化方法获得了可以高效催化苄位不对称C—H键胺化作用的P450突变体P411CHA, 其总转换数TON (turnover number)可达1300[52](Eq. 8).
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烯烃的反马氏氧化反应一直以来都是有机合成中的重要难题, 它可以简化从烯烃到一些精细化学品和药物的有机合成路线, 对于利用氧气作为末端氧化剂来实现不对称烯烃的反马氏氧化无疑具有很高的吸引力.来自红球菌属团聚拉布伦茨氏菌(Labrenzia aggregata)的P450 LA1, 在苯乙烯环氧化反应中可以催化产生反马氏羰基化合物, 因此被选作改造烯烃反马氏氧化反应的起始酶.经过定向进化后得到新型细胞色素P450工程酶aMOx, 可以高效催化烯烃如苯乙烯的不对称反马氏氧化反应[53](Eq. 9).
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Kemp消除反应是一类重要的有机合成反应, 通常用来合成一些药物, 如异噁唑基药品的中间体, Reetz等[54]发现细胞色素P450 BM3可以通过Kemp消除反应实现5-硝基-苯并异噁唑到2-氰基-4-硝基苯酚的一步转化.该发现阐明了一种不同于常规酸碱催化机制的氧化还原介导新机制, 且在抗炎治疗药物来氟米特(leflunomide)与其代谢产物特立氟胺(teriflunomide)中的转化中得到验证(Eq. 10).
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硅烷是著名的有机合成中间体, 在自然界中含有C—Si键或可以形成C—Si键的生物分子至今依然未被发现.受到定向进化蛋白质获得N—H和S—H键卡宾插入反应的启发, Arnold等[55]以苯基二甲基硅烷和2-重氮丙酸乙酯为底物对一些血红素蛋白进行筛选, 以期获得Si—H键卡宾插入反应活性的“超自然”生物催化剂.来自海洋红嗜热菌(Rhodothermus marinus)的细胞色素C(以及一些P450酶)可以催化该反应, ee值高达97%;在定向进化的选择压力下, 三突变体Ⅴ75T M100D M103E将反应ee值提高到99%, TTN＞1500, 比传统的有机合成金属催化剂提高了15倍多(Eq. 11).
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杂原子氧化也是一类重要的有机合成反应, 例如硫醚(thioether)的氧化可生成具有广谱生物活性的砜类物质, 而且砜类化合物是有机合成中重要的中间体, 在生物医药领域中应用较为广泛.在有机合成中, 常利用金属氧化物、有机氧化剂等实现该类氧化反应, 但副产物较多[56].丛志奇等[57]近期实现了细胞色素P450 BM3过氧化物酶体系在双功能小分子的协助下催化硫醚专一性生成亚砜(sulfoxide), TON达到3436, ee值32% (Eq. 12).
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上述这些非常规反应的不断发现、挖掘和创造, 在拓展细胞色素P450酶可催化反应类型的同时也为合成化学家及生物化学家们突破各种合成化学难题带来了新思路.
细胞色素P450酶可以在温和条件下催化众多底物分子的高选择性氧化反应, 介导的催化反应类型多样, 且一些全新催化活性也在不断被挖掘, 因此有望成为寻找应对挑战性有机合成反应生物催化剂的新宝库.为了拓宽P450酶在有机合成反应中的应用, 在合成生物学理念指导下, 蛋白质工程、氧化还原伴侣工程、底物工程及代谢工程等多种工程化改造手段相继被应用于细胞色素P450酶的改造优化及其化学空间的拓展(图 2).
蛋白质工程是基于蛋白质的折叠原理和分子结构进行定向改造, 从而获得目的特性提升的蛋白质, 以弥补天然蛋白质稳定性差、活性低、选择性差及应用空间受限等缺陷.定向进化和理性改造是细胞色素P450酶蛋白质工程化改造的主要手段, 这两种策略互不排斥, 定向进化不依赖于蛋白质空间结构和功能的解析及其相互之间的关联, 因此适用范围极广, 但往往需要对库容量超大的突变体库进行筛选; 理性改造则是建立在较为清晰的结构、功能以及相关催化机制的基础上进行的(半)理性修饰, 突变体库容量小且相对阳性率高.
定向进化(directed evolution)在细胞色素P450酶的蛋白质工程改造中应用广泛, 包括基因突变的迭代步骤、突变体库的表达与筛选等, 每轮进化都是在人为施加的选择压力下进行[58]; 从已有的P450酶(天然或者改造过的)出发, 引入突变, 然后筛选具有活性增强、接受非天然底物的新型活性、催化模式改变(如高效利用“过氧化物捷径”)、热稳定性提升或对映选择性改变的后代突变体[5].易错聚合酶链式反应(error-prone polymerase chain reaction, epPCR)[59]、饱和突变(saturation mutagenesis)[60]和DNA洗牌(DNA shuffling)[61]是最为常用的基因突变技术.产生分子多样性和定向筛选是定向进化策略中的两个核心环节.筛选是定向进化的限速瓶颈, 大量的工作需要建立在高通量培养和分析的基础之上, Reetz等发展的迭代饱和突变(Iterative Saturation Mutagenesis, ISM)[62]和组合活性位点饱和实验(Combinatorial Active-Site Saturation Test, CAST)[63]被广泛用来建立库容精减的高质量突变体库[64].
来自巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的P450 BM3, 是一个结构已解析的自给自足型细胞色素P450酶, 其对天然底物的转化数高达17000 min－1, 是一个很好的定向进化亲本酶[65].对于其热稳定性以及针对特定底物的位点和立体选择性提升是一直以来的重点关注对象.如Reetz等发现减小了空间位阻的单突变体P450 BM3 F87A可以催化睾酮底物非选择性地产生1:1的2β和15β异构体羟化产物.为了提高选择性, 选用组合位点饱和突变(CAST)技术, 基于已报道的P450 BM3晶体结构, 将选择的20个单位点分成9个多随机位点, 在第一轮筛选8700个突变体后得到了突变体P450BM3 A330W/F87A, 可选择性地催化产生97%的2β羟化产物(Eq. 13);而突变体P450 BM3 Ⅴ78L/A82F/F87A, 能够选择性地催化产生91%的15β羟化产物.为了进一步提高15β选择性, 又进行了一轮迭代饱和突变(ISM), 得到了高活性的突变体P450 BM3 R47Y/T49F/Ⅴ78L/ A82M/F87A, 展现出96%的区域选择性和100%的非对映立体选择性[66].
Arnold[53]作为蛋白质定向进化领域的先驱, 在过去的几十年里不断拓宽细胞色素P450酶的化学反应类型.例如:新型工程酶P450 aMOx可以高效催化烯烃的反马氏氧化, 这为一直困扰有机合成界的难题提供了新的解决途径.来自红球菌属团聚拉布伦茨氏菌(Labrenzia aggregata)的P450 LA1在苯乙烯环氧化反应中可以产生反马氏羰基化合物, 因而被选作改造烯烃反马氏氧化反应的起始酶, 在其突变体反应中可以检测到苯乙醛的产生, 但伴随着大量的环氧化合物; 于是采用定向进化方法提高P450 LA1的选择性和反应活性.在该酶的血红素位点引入随机突变筛到一个五重突变体, 将总转化数(TTN)提高了12倍, 但选择性未有明显改变; 继续对酶的活性位点和血红素结合位点展开了单点饱和突变, 结合所有有利突变得到突变体细胞色素P450 aMOx, 成功将苯乙烯生成苯乙醛的反应选择性提升至81%[53].
近年来对P450 BM3的定向进化还不断挖掘出更多的新型非天然反应, 尤其是一些有机合成化学家已知而在生物中未曾发现的反应.例如, 烯烃环丙烷化的催化活性则是基于细菌P450酶的催化特性进行定向进化而获得, 可用于合成抗抑郁药物左旋体米那普仑(levomilnacipran)的手性顺式环丙烷前体[36]; P450 BM3保守的半胱氨酸被改造后的突变体P411, 通过定向进化在不断提高活性的同时, 发现除了可以催化分子内C—H键胺化, 还可以催化分子间的氮杂环丙烷化及不对称硫醚酰亚胺化[52]; 除此之外, 进化改造后的细胞色素P411CHA, 可以催化苄位不对称C—H键胺化, 解决了长期以来化学催化方法所面临的难题; 近日, 又利用定向进化技术对P450基因编码的蛋白质在大肠杆菌(Escherichia coli)中的功能进行优化, 从而获得可以生产高能量结构双环丁烷的工程菌, 为许多有机合成中手性结构的获得提供了新途径[67].
上述成功案例证实了定向进化是一种有效的提高细胞色素P450酶催化活性、区域及立体选择性或获得全新催化反应类型, 进而拓宽了P450酶在有机合成反应中应用范围的有效策略.
定向进化在获得催化新活性、提高催化选择性时常伴随着低酶活及较弱的稳定性, 往往需要大量突变体的进一步筛选; 相比之下, 结合理性设计(rational design)的饱和突变可以产生较小却有效的突变体库[68].由于细胞色素P450酶结构与功能之间的关联不是十分清晰, 因此结合定向进化与理性改造进行半理性突变是进一步提高酶活和选择性的常见策略.
基于P450酶的结构信息, 改造主要针对与底物直接作用或活性位点附近的氨基酸残基, 进行特定的单饱和突变或组合饱和突变经常是行之有效的方法.例如基于对已知的29个细胞色素P450酶的晶体结构与6379个P450酶序列的系统计算分析, 发现靠近血红素中心的两个疏水性氨基酸最有可能在发生反应时与底物接触; 在P450 BM3中这两个氨基酸对应的是残基F87和A328, 随后将这两个位点突变为非极性氨基酸(A、V、F、L和I), 获得只有24个突变体的库, 发现其中一些突变体可以改变或提高各种线性萜烯、环状单萜和环倍半萜的氧化活性; 突变体A328Ⅴ相较于野生型, 催化环辛烷的羟化活性提高了近100倍[69].而在一些定向进化获得的新型催化活性突变体后, 往往会对个别位点进行理性改造, 如在前文提到的反马氏加成催化反应中, 对于定向进化筛选到的突变体进行了活性位点和血红素结合位点的单点饱和突变, 较快获得了活性更高的突变体酶P450 aMOx[53].
理性设计也可用于对催化选择性进行改造, 如对细胞色素P450酶PikC与底物那波霉素(narbomycin)和YC-17共晶获得的结构数据进行分析, 认为有三个氨基酸位点(D50、E85及E94)对于酶的底物结合和催化活性可能具有重要作用, 将这三个酸性氨基酸位点定点突变为非极性的丙氨酸(A)或天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q), 发现催化活性相较于野生型都有明显的提高; 在对YC-17的羟化反应中, 不同于野生型产生等量产物新酒霉素(neomethymycin)和酒霉素(methymycin), 活性显著提高的突变体PikC D50N的主要产物为新酒霉素(neo- methymycin) (Scheme 12)[70].
综上所述, 理性设计是改变P450酶催化活性和选择性的有效策略, 虽然P450酶的晶体结构能够提供一些有益信息, 但复杂的底物与残基之间的互作关系需要进一步结合一些其它分析技术, 如分子动力学模拟(molecular dynamic simulations)和底物对接(substrate docking)来提高预测的准确性[1a, 71]; 在有机合成反应的应用中, 理性设计相较于设计全新催化活性而言更适合对定向进化之后的突变体进行一些调整优化, 以获得更稳定或者活性/选择性更高的突变体酶.
氧化还原伴侣蛋白(redox partner)涉及电子传递过程, 在大多数P450酶催化反应中不可或缺.目前大量的P450催化系统的体外重建受限于无法获得自体氧化还原伴侣或者异源替代氧化还原伴侣来支持其催化活性, 因此拓宽细胞色素P450酶的应用还需对氧化还原伴侣蛋白的选择以及相互作用进行优化, 从而达到重建活性、提高活性以及改变反应类型的目的.
由于天然氧化还原伴侣处于未知状态, 一些较为常用的非天然氧化还原伴侣如菠菜(Spinach oleracea)中的铁氧化还原蛋白/铁氧化还原蛋白还原酶(ferredoxin/ ferredoxin reductase, Fdx/FdR)[72]、来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的假单孢铁氧化还原蛋白/假单孢铁氧化还原蛋白还原酶(putidaredoxin/putidaredoxin reductase, Pdx/PdR)[73]以及牛(bovine)的肾上腺皮质铁氧化还原蛋白/肾上腺皮质铁氧化还原蛋白还原酶(adrenodoxin/adrenodoxin reductase, Adx/AdR)[74]等常被用作替代氧化还原伴侣帮助一些P450酶重建体外活性.不同氧化还原伴侣的选择, 会对P450酶的催化活性产生不同程度的影响, 如Bureik等[75]利用不同来源的氧化还原伴侣与人线粒体细胞色素P450酶在裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中进行共表达时, 发现这28株重组裂殖酵母在进行全细胞催化类固醇激素的氧化反应时, 不同来源的氧化还原伴侣不仅会影响P450酶的催化效率, 而且使产物的构型发生改变; 我们[76]在利用来源于细菌和蓝藻的不同氧化还原伴侣在体外重建CYP-sb21对环孢菌素A (cyclosporine A)的选择性羟化活性时发现, 来源于细长聚球藻(Synechococcus elongates PCC7942)的氧化还原伴侣SeFdx/SeFdR具有最高的P450支撑活性.
选择不同来源的氧化还原伴侣会对P450酶的催化效率和产物分布产生较大影响, 而近期我们发现氧化还原伴侣的选择及其与P450酶的相互作用方式还会导致反应类型的改变甚至产生全新产物.具体而言, 我们在对来自稀有放线菌浅灰红小单孢菌(Micromonospora griseorubida)的大环内酯类抗生素麦新米星(mycinamicins)生物合成途径中的P450酶MycG进行研究时发现, MycG与异源氧化还原伴侣蛋白RhFRED处于分离或融合状态时, 以完全不同的方式对麦新米星进行结构修饰; 处于分离状态时, 相较于融合状态可以进行常规的羟化和环氧化反应外(图4 c), 还可以针对不同的麦新米星底物催化全新的N-脱甲基反应[77], 揭示了一种通过改变P450酶与氧化还原伴侣蛋白的作用方式来衍生出新结构“天然产物”的全新策略.
代谢工程与合成生物学的发展也为细胞色素P450酶在有机合成中应用的不断开拓提供了新思路和新途径.代谢工程(metabolic engineering)能够将不同宿主来源的酶分子在细胞内进行组合构建全新的代谢途径, 可以更加简便地实现天然产物、化学中间体、生物燃料等的合成; 如利用微生物合成生物液体燃料, 刘奕等[78]通过将P450脂肪酸脱羧酶OleTJE引入大肠杆菌高产脂肪酸系统, 优化氧化还原伴侣体系, 理性提高脂肪烃的产量, 使α烯烃的总产量达到97.6 mg/L.
一些高附加值的精细化学品和药物往往是天然代谢途径所不能合成的, 合成生物学(synthetic biology)的发展, 能够为突破上述瓶颈提供新思路, 即利用人工合成的新催化元件构建新的生物系统, 从而提高代谢途径的可能性与可控性.如抗疟疾药物青蒿素(artemisinin)的生产, Keasling等[79]设计了一条在大肠杆菌以及酿酒酵母中都不存在的合成青蒿素前体青蒿酸(artemisininc acid)的全新合成途径, 将来自植物黄花蒿(Artemisia annua)、大肠杆菌以及酵母中的多种基因实现精确的组装和调控, 优化关键基因的表达, 削弱前体物质酵母中焦磷酸法尼酯(FPP)的支路途径, 表达来自黄花蒿的P450酶CYP71AⅤ1, 成功构建了青蒿酸产量达到2.5 g/L的工程菌株, 并实现了工业化生产.
细胞色素P450酶在比较大规模的反应体系中, 因酶的不稳定性导致催化活性不高, 在应用中会受到限制.全细胞催化(whole-cell biotransformation)的应用可以解决这一问题.全细胞催化可在两相体系(水-有机溶剂体系)中进行, 从而很大程度上解决由于大多数P450酶的底物或产物疏水性高以及酶不耐受有机溶剂的问题; 如在利用重组大肠杆菌BL21(DE3)菌株过表达突变体P450 BM3 Ⅴ26T /R7F/A7G/F8Ⅴ/L188K将双环单萜α-蒎烯(α-pinene)氧化为马鞭草烯醇(verbenol)时, 选择邻苯二甲酸二异壬酯(Diisononyl phthalate)作为一种生物相容性有机载体溶剂, 能削弱α-蒎烯引起的毒性效应, 同时有效地提取产物, 使生物反应体系放大[80].此外, 大肠杆菌作为应用最为广泛的宿主细胞, 常用来构建生物催化系统, 如Sohng等[81]将来自链霉菌Streptomyces peuceticus的CYP107P3与来自恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的氧化还原伴侣Pdx和PdR在大肠杆菌中共表达, 可以实现催化7-乙氧基香豆素(7-ethoxycumarin)的O-脱烷基化生成7-羟基香豆素(7-hydroxycumarin).
底物工程(substrate engineering)作为一种有效策略越来越多地应用于拓宽细胞色素P450酶的底物谱, 即根据酶与底物分子结构之间的关系, 设计特殊结构的分子基团协助非天然底物进入活性位点, 实现催化反应.例如:利用P450酶PikC在催化反应中对去氧糖胺(desosamine)依赖的特性, 利用该分子协助多种类型的非天然工程化底物实现了具有高选择性的碳氢键氧化[82]; 在P450 PikC与底物YC17或narbomycin共晶结构基础上, Sherman等[83]依据PikC催化过程中形成锚定盐桥的特点, 设计一组带有二甲氨基锚定基团的薄荷醇(menthol)衍生物, 成功实现PikC对非天然底物薄荷醇的选择性羟化.
近日, 基于过氧化物酶(peroxidase)与过加氧酶(peroxygenase)在活性中心具有保守的酸碱性氨基酸残基的特性, 丛志奇等[57]设计了一类双功能小分子, 一端带有“咪唑基团”作为催化基团活化过氧化氢, 另外一端则带有起特异识别作用的“酰基氨基酸”将小分子固定到活性口袋, 模拟天然过加氧酶的催化机制, 将P450 BM3改造为可以利用H2O2的过加氧酶, 可在简化氧化还原伴侣蛋白传递电子复杂途径的同时进一步提高对烯烃的环氧化以及苄基型羟化等多个反应的催化活性.综上, 根据细胞色素P450酶特异性识别一些小分子基团的特性, 可以通过结合化学或生物合成将小分子锚定基团连接到目标底物, 进而实现P450酶对非天然目标底物的选择性氧化.
现代有机合成化学要求催化反应必须具有高反应效率和高选择性, 酶催化方法被认为能够与传统的有机合成方法相互补充, 来弥补有机合成方法目前存在的一些不足.细胞色素P450酶能在室温, 中性条件下, 以及底物官能团非保护情况下进行反应, 具有高效性、高选择性和反应温和性等特点; 这在一定程度上可减少高温高压带来的如分解、重排等副反应, 同时酶的可降解性也可避免传统有机化学合成中重金属催化剂对环境造成的压力. P450酶的手性催化性质能够加速立体和区域化学反应产物的形成, 某些酶的反应速度亦是化学催化剂所望尘莫及的.
细胞色素P450酶的魅力在于超乎人们想象力的催化反应类型多样性、立体结构专一性和底物结构多样性, 这是其它家族酶蛋白所无法比拟的, 因而极大丰富了有机化学家及生物化学家们理性设计复杂有机化合物半合成或全合成的工具箱.与此同时, P450酶催化机制的解析为“仿生”催化、新型化学催化剂的理性设计也提供了重要借鉴.合成生物学和多门类生物工程学的发展为P450酶在有机合成反应中的应用提供了更广阔的空间.随着未来对血红素中心、活性位点以及配体的深入研究, 必将促进P450酶的催化效率提升、稳定性改善以及底物谱和反应类型的拓展.如Hartwig等[84]尝试利用不同的金属卟啉IX(M-PIX)替代天然P450酶中铁卟啉IX(Fe-PIX), 获得的Ir-PIX在芳香烯烃加成等反应中具有很好的催化活性, 并且展现出全新的催化功能, 开启了人工改造天然酶的新思路.基于P450酶的催化特点与传统有机化学反应相结合, 可以衍生出极为有效的化学酶法(chemoenzymatic method)来合成药物分子及许多重要的化工产品, 如2013年Sherman等[85]利用有机化学合成结合P450 PikC的生物催化, 成功实现了十二元环及十四元环大环内酯苦霉素(pikomycin)与酒霉素(methymycin)的全合成.
未来在P450酶辅助有机合成以及合成生物学领域, 基于自动化高通量筛选技术的快速发展, 可以通过定向进化改造具有天然融合氧化还原伴侣和超高催化活性的P450 BM3或催化机制理解透彻的P450cam, 实现对更多精细化学品和药物的高位点选择性和对映选择性的调控.此外, 还可利用P450过氧化物酶(如CYP152亚族)来简化繁琐、限速的电子传递过程, 实现P450酶在有机合成反应中更加广泛的应用; 对于反应过程中高浓度过氧化氢导致酶失活的问题可以通过光系统等原位再生过氧化氢技术[86]实现H2O2浓度的精确调控.
本文基于对细胞色素P450酶丰富多样的催化反应类型及其在精细化学品、药物中间体或药物以及生物燃料等合成反应中的应用, 展现了它们卓著的催化多能性.然而, 必须承认的是天然来源的大多数P450酶的催化效率仍然难以达到工业应用要求, 对于其它P450酶的改造应用还需考虑到解偶联问题、氧化还原伴侣的优化以及酶稳定性的提高等因素.由于异源表达的限制, 对于植物和真菌来源P450酶的催化功能挖掘仍有待进一步提高.随着蛋白质工程、底物工程、代谢工程与合成生物学的快速发展, 研究人员可以不断去拓宽细胞色素P450酶介导的全新有机合成反应, 根据生产需要理性设计稳定、高效、高选择性的P450工程酶, 通过生物催化与合成化学融合造福人类.
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图 1 代表性P450酶PikC的晶体结构(PDB ID:2BⅤJ)
Figure 1 Crystal structure of the representative P450 enzyme PikC (PDB ID:2BⅤJ)
(a) The crystal structure with secondary structures; (b) the substrate recognition sites, SRS1, SRS2, SRS3, SRS4, SRS5, and SRS6
图式 3 细胞色素P450酶催化的代表性羟化反应
Scheme 3 Representative hydroxylation reactions catalyzed by P450 enzymes
图式 4 多功能细胞色素P450酶MycG催化的羟化及环氧化反应
Scheme 4 Hydroxylation and expoxidation reactions catalyzed by the multifunctional cytochrome P450 enzyme MycG
图式 8 P450酶介导的分子内芳基偶联反应
Scheme 8 Intramolecular aryl coupling reactions mediated by P450 enzymes
图式 9 P450酶介导的分子间芳基偶联反应
Scheme 9 Intermolecular aryl coupling reactions mediated by P450 enzymes
图式 10 细胞色素P450催化底物的碳-碳键裂解
Scheme 10 Examples of C—C bond cleavage reactions mediated by P450 enzymes
图式 11 细胞色素P450催化底物的官能团迁移
Scheme 11 Examples of group migration reactions mediated by P450 enzymes
图 2 拓宽细胞色素P450酶在有机合成反应中应用的主要策略
Figure 2 Major strategies for expanding the application of P450 enzymes in organic synthesis
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