2, 4, 6-三硝基苯酚(PA)，俗称为苦味酸，是一种通用试剂，已广泛应用于炸药、烟花爆竹和火箭燃料以及皮革、制药和染料工业等领域。最近，PA对国土安全和人类安全的威胁引起了越来越多的关注，同时对人体的中枢神经系统、心血管系统、新陈代谢、肝脏、肾脏和泌尿系统具有一定的危害[1-3]。对于PA含量的准确检测显得至关重要。目前，已经开发了多种检测PA的方法，包括比色法[4]、电化学[5]、荧光法[6]、质谱法[3]、离子迁移谱法[7]、表面等离子体共振法[8]和表面增强拉曼散射法[9]，但是这些方法通常需要复杂的合成过程才能获得探针，需要昂贵的仪器或灵敏度较低。因此，研究灵敏度高和低成本的荧光探针非常重要。
由于荧光金属纳米团簇具有生物相容性，同时在有毒物质的检测和生物成像等领域具有很好的应用前景[10-12]。与金、银等贵金属[13-14]纳米团簇相似，铜纳米团簇(Cu NCs)同样具有良好的水溶性、显著的催化性能和优异的光学性质。但是，Cu NCs具有许多优势，包括实用性、原料易得和出色的光稳定性等。目前，Cu NCs的合成方法主要有蚀刻法、电化学法、光还原法、声化学法、微波辅助法和模板辅助法[15-19]，保护剂主要有DNA、高分子聚合物、硫醇、蛋白质和其它一些小分子[20-23]。在过去的10年中，Cu NCs受到了越来越多的关注，已被广泛用于检测各种有毒有害物质[24-26]。
本文以脯氨酸(Pro)为保护剂，盐酸羟胺(NH2OH ·HCl)为还原剂，通过一步化学还原法制备脯氨酸稳定的Cu NCs。采用分子荧光仪和紫外可见吸收仪对Cu NCs的光学性质进行分析，通过透射电子显微镜(TEM)、X射线光电子能谱(XPS)和傅里叶变换红外波谱仪(FTIR)对Cu NCs的结构进行表征。同时对Cu NCs检测PA的检测限和荧光猝灭机理等进行了探讨。此外，研究了该探针在检测实际水样中PA含量的可行性。
F-7000型荧光光谱仪(日本日立公司)；8453型紫外可见分光光度计(UV-Vis，美国安捷伦公司)；FTIR-8400S型傅里叶变换红外光谱仪(FTIR, 日本岛津公司)；FEI Tecnai G2 F20型透射电子显微镜(TEM，美国FEI公司)；ESCALAB 250XI型X射线光电子能谱仪(XPS，美国ThermoFisher Scientific公司)；FE20型pH计(上海梅特勒仪器公司)。
L-脯氨酸(Pro)、氯化铜、盐酸羟胺(NH2OH ·HCl)、磷酸二氢钠及磷酸氢二钠均为分析纯试剂，购于天津市富宇有限公司；NaCl、KCl、MnCl2、CdCl2、MgCl2·6H2O、FeCl3、AgNO3、CuCl2·2H2O、CoCl2·6H2O、HgCl2、三硝基苯酚(PA)、对硝基苯酚(p-NP)、对硝基甲苯(p-NT)、硝基苯(NB)、苯甲酸(BA)、苯酚(CA)、甲苯(MB)及邻苯二酚(o-DHB)均为分析纯试剂，购于上海阿拉丁化学公司；溶液均用美国Mili-Q纯水仪制备的超纯水配制。
所有玻璃器皿先用王水(V(HCl)∶V(HNO3)=3∶1)洗涤，再分别采用乙醇和超纯水多次冲洗。首先，在室温下将Pro水溶液(2 mL，6 mol/L)与CuCl2水溶液(6 mL，4 mmol/L)混合，搅拌培育2 min，使Pro和Cu2+发生配合；然后，将NH2OH ·HCl水溶液(2 mL，6 mmol/L)逐滴加入上述混合物中，并将该混合物置于80 ℃下反应23 h，溶液的颜色逐渐从蓝色变为棕色，表明Cu NCs的生成；最后，在超纯水中使用透析袋(MWCO 3000)透析24 h除去未反应的Cu2+和Pro。将产物储存在冰箱(4 ℃)中备用。
在PA的检测中，将相应浓度的PA溶液滴入1 mL Cu NCs溶液和1 mL PBS缓冲溶液(磷酸盐缓冲溶液，pH=7.5)中(PA的最终浓度为0、0.5、0.7、1、2、5、7、10、15、20、25、30、40、50、60和70 μmol/L)。将混合溶液在室温下孵育3 min。同时，在397 nm的激发波长下测量Cu NCs的荧光强度(激发和发射的狭缝宽度设置为20 nm)。相对荧光强度(F0/F)与PA浓度之间的关系用于研究线性关系，其中F0和F分别代表不存在和存在PA的情况下Cu NCs的荧光强度。为了研究Cu NCs的选择性，在相同条件下探索了金属离子(Na+, K+, Mn2+, Cd2+, Mg2+, Fe3+, Ag+, Cu2+, Co2+, Hg2+)和其它结构相似的物质(p-NP、p-NT、NB、BA、CA、MB及o-DHB)对Cu NCs荧光强度的影响。
实际水样取自生活污水，将其离心(10000 r/min)并通过0.22 μm滤膜以除去任何悬浮颗粒，随后加入不同标准浓度的PA溶液。接下来，将含有PA的实际水样加至Cu NCs溶液培育3 min，记录各个浓度下的Cu NCs荧光强度。
为了证明Cu NCs的成功合成，分别采用FTIR、TEM、XPS、荧光光谱和紫外可见光谱进行表征。由图 1A可见，Cu NCs的最大激发和发射波长分别为397和458 nm，Cu NCs溶液在可见光和紫外光(365 nm)照射下呈棕色和蓝色。此外，考察了激发波长对发射波长的影响，如图 1B所示，Cu NCs的发射波长随着激发波长的变化而变化(340~410 nm)，主要原因是材料存在不均一的颗粒粒径。同时分别研究了Cu NCs、Pro和NH2OH·HCl的荧光光谱和紫外可见吸收光谱。由图 2A可见，在458 nm附近出现了明显的峰，而Pro和NH2OH·HCl没有出现。由图 2B所示，Cu NCs在325 nm处出现一个弱吸收峰，在500~600 nm处未出现颗粒较大的铜纳米粒子的吸收峰，表明Cu NCs中没有出现大颗粒的铜纳米粒子[10, 12]，而Pro和NH2OH·HCl的紫外吸收谱图中未出现任何吸收峰。
为了进一步阐明Cu NCs的纳米结构，采用TEM直接观察其形态和粒径分布。由图 3A可见，Cu NCs的形貌为球状，且分散性好，平均直径为(1.89±0.13) nm。同时，通过使用硫酸奎宁作为标准，制备的Cu NCs的荧光量子产率为3.2%。采用FTIR对Cu NCs和Pro进行表征，如图 3B所示。3700~3100 cm-1归属于O—H和N—H键的吸收峰，3063 cm-1处归属于C—H键的伸缩振动峰，1624.2 cm-1处归属于N—H键的弯曲振动，1000~650 cm-1处归属于C—H键的弯曲振动，可见Cu NCs和Pro的表面具有相似的官能团，表明Pro在Cu NCs的表面成功改性。通过XPS研究了Cu NCs的组分，如图 3C和3D所示。Cu NCs的XPS全谱中出现了C(1s)、N(1s)、O(1s)、O(KLL)和Cu(2p)的5个主要峰，表明Cu NCs主要由C、N、O和Cu组成。Cu的XPS谱图中，在932.2和952.7 eV处观察到两个峰，分别对应于Cu(0)的2p3/2和2p1/2电子的结合能，而在~942 eV附近并没有出现峰，表明Cu(Ⅱ)被完全还原。Cu(0)的典型2p3/2峰与Cu(Ⅰ)的峰的结合能仅相差约0.1 eV。因此，Cu NCs的中Cu的化合价态很可能在0和+1之间。综上所述，Cu NCs被成功地合成。
良好的水溶性和较强的荧光强度对Cu NCs在实际应用中是非常重要的。因此，研究了储存时间、光照时间和氯化钠浓度对Cu NCs荧光强度的影响，如图 4所示。随着储存时间的延长，Cu NCs的荧光强度几乎不变(图 4A)；还研究了Cu NCs的光稳定性，在365 nm的紫外灯照射60 min后，Cu NCs的荧光强度保持稳定(图 4B)；即使在500 mmol/L NaCl溶液中，Cu NCs的荧光强度也只是略有变化(图 4C)。表明该Cu NCs具有良好的稳定性。
考察了pH值和培育时间对PA检测的影响，如图 5所示。由图 5A可见，随着pH值不断提高，Cu NCs的荧光猝灭程度先增大后降低，当pH=7.5时，猝灭程度达到最大。由图 5B可见，当加入70 μmol/L的PA到Cu NCs溶液中时，反应3 min后荧光猝灭达到稳定。因此，检测PA时选择pH=7.5和培育时间为3 min。
图 6A为加入不同浓度的PA后Cu NCs溶液的荧光发射谱图(0、0.5、0.7、1、2、5、7、10、15、20、25、30、40、50、60和70 μmol/L)，可见，随着PA浓度的增大，Cu NCs的荧光强度逐渐降低。基于458 nm处的荧光强度变化，研究了相对荧光强度(F0/F)与PA浓度之间的关系(图 6B)。由图 6C和6D可见，当PA的浓度分别介于0.5~15 μmol/L和20~70 μmol/L之间时，相对荧光强度(F0/F)与PA浓度呈现良好的线性关系，线性方程分别为F0/F=0.013[PA]+1.004和F0/F=0.032[PA]+0.660，线性相关系数分别为0.9842和0.9954，检测限(LOD)为0.092 μmol/L(S/N=3)。线性范围和检出限均优于其它荧光探针，见表 1。
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为了更好地了解Cu NCs对PA的荧光猝灭机理，分别测定了Cu NCs和Cu NCs-PA系统的荧光寿命，如图 7A所示。由图 7A可见，Cu NCs和Cu NCs-PA系统的荧光寿命分别为7.53和7.15 ns，加入PA后荧光寿命没有明显变化，表明猝灭机理为静态猝灭[26]。此外，通过研究PA的紫外可见吸收谱图与Cu NCs的激发和发射谱图之间的关系，如图 7B所示。由图 7B可见，PA的紫外可见吸收谱图与Cu NCs的激发和发射谱图存在重叠现象，表明该猝灭机理存在内滤效应[26]。
为了研究Cu NCs检测PA的选择性，研究了金属离子(Na+, K+, Mn2+, Cd2+, Mg2+, Fe3+, Ag+, Cu2+, Co2+, Hg2+)和其它结构相似的物质(p-NP、p-NT、NB、BA、CA、MB及o-DHB)(浓度为70 μmol/L)对Cu NCs荧光强度的影响，如图 8所示。由图 8可见，当加入PA后，Cu NCs的荧光强度明显降低，而在相同条件下加入其它物质后，荧光强度的变化可以忽略。因此，Cu NCs作为荧光探针可以选择性地检测PA。
为了验证该荧光探针的实用性，检测了真实水样中的PA含量。用于测试的水样来自生活中的污水。分别检测了水样中的PA含量，并进行了回收率实验，结果见表 2中。水样品中检出的PA回收率在93.5%~110.4%范围内。表明所制备的探针适用于真实水样中的PA测定。
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| 样品 Samples |
添加浓度 Added/(μmol·L-1) |
检测浓度 Found/(μmol·L-1) |
回收率 Recovery/% |
| Water 1 | 0 | aND | bNC |
| 5 | 5.32 | 106.4 | |
| 15 | 15.45 | 103.0 | |
| 25 | 23.52 | 94.1 | |
| Water 2 | 0 | aND | bNC |
| 5 | 5.52 | 110.4 | |
| 15 | 14.02 | 93.5 | |
| 25 | 25.26 | 101.0 | |
| a.未检出; b.未计算。 a.ND, not detectable; b.NC, not calculated. | |||
本文以脯氨酸(Pro)为保护剂，NH2OH·HCl为还原剂，通过一步化学还原法制备Pro稳定的铜纳米团簇(Cu NCs)。该Cu NCs具有优异的稳定性。同时Cu NCs具有很好的分散性，尺寸大小为(1.89±0.13) nm。最大激发和发射波长分别为397和458 nm。作为检测三硝基苯酚(PA)的荧光探针，具有很高的灵敏度和选择性，线性范围为0.5~15 μmol/L和20~70 μmol/L，检测限为0.092 μmol/L，且已成功地用于检测实际水样中的PA。
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图 1 (A) 铜纳米团簇的激发和发射谱图；(B) 不同激发下铜纳米团簇的发射谱图
Figure 1 (A) The fluorescence excitation and emission spectra (Inset: the photographs of pro-Cu NCs under daylight lamp (a) and UV lamp (b)). (B) The fluorescence emission spectra under different excitation wavelength range from 340 nm to 410 nm (a-h)
图 2 (A) 铜纳米团簇，脯氨酸和盐酸羟胺的荧光谱图；(B) 铜纳米团簇，脯氨酸和盐酸羟胺的紫外可见吸收谱图
Figure 2 The fluorescence emission spectra (A) and UV-visible absorption spectra (B) of Cu NCs(a), proline(b) and hydroxylamine hydrochloride(c)
图 3 (A) 铜纳米团簇的TEM图；(B) 铜纳米团簇和脯氨酸的红外谱图；(C) 铜纳米团簇的XPS谱图；(D) 铜的XPS谱图
Figure 3 (A) TEM image of Cu NCs. (B) FTIR spectra of Cu NCs (a) and proline (b). (C) XPS spectrum of Cu NCs. (D) XPS spectrum of Cu 2p
图 4 储存时间(A)、紫外照射时间(B)和氯化钠浓度(C)对铜纳米团簇荧光的影响
Figure 4 Effect of storage time (A), UV irradiation time (B) and different concentrations of NaCl (C) on fluorescence intensity of Cu NCs
图 5 溶液pH值(A)和培育时间(B)对检测系统的影响
Figure 5 (A) Effect of pH on the F0-F of the Cu NCs-PA system. (B) Effect of incubation time on the F0-F of the Cu NCs-PA system
图 6 (A) 不同PA浓度所对应Cu NCs的荧光光谱；(B)相对荧光强度与PA浓度(0~70 μmol/L)的关系；(C)相对荧光强度与PA浓度(0.5~15 μmol/L)的线性关系; (D)相对荧光强度与PA浓度(20~70 μmol/L)的线性关系
Figure 6 (A) Emission spectra of Cu NCs in the presence of the increasing concentration (0, 0.5, 0.7, 1, 2, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60 and 70 μmol/L) of PA at 397 nm excitation. (B) Plot of the F0/F vs PA concentration. (C) The calibration plot of F0/F vs PA concentration range from 0.5 to 15 μmol/L. (D) The calibration plot of F0/F vs PA concentration range from 20 to 70 μmol/L. (F0 and F represented the FL response of Cu NCs in the absence and presence of PA, respectively)
图 7 (A) Cu NCs加入PA前后的荧光寿命(a.Cu NCs; b.Cu NCs+PA); (B) Cu NCs的激发谱图(a)、发射谱图(b)和PA的紫外可见吸收谱图(c)
Figure 7 (A) The fluorescence lifetimes of the pro-Cu NCs without and with PA (a.Cu NCs; b.Cu NCs+PA); (B) The fluorescence excitation (a) and emission spectra (b) of Cu NCs and UV-Vis absorption spectra of PA (c)
图 8 铜纳米团簇的相对荧光强度(检测物的浓度为70 μmol/L)
Figure 8 The relative emission intensity of the Cu NCs in the presence of Na+, K+, Mn2+, Cd2+, Mg2+, Fe3+, Ag+, Cu2+, Co2+, Hg2+, PA, BA, p-NP, p-NT, CA, MB, NB and o-DHB (F0/F, where F0 and F were the fluorescence intensities of Cu NCs in the absence and presence of interferences)
表 2 水样中PA的测定
Table 2. Recovery examination of PA spiked in real water samples
| 样品 Samples |
添加浓度 Added/(μmol·L-1) |
检测浓度 Found/(μmol·L-1) |
回收率 Recovery/% |
| Water 1 | 0 | aND | bNC |
| 5 | 5.32 | 106.4 | |
| 15 | 15.45 | 103.0 | |
| 25 | 23.52 | 94.1 | |
| Water 2 | 0 | aND | bNC |
| 5 | 5.52 | 110.4 | |
| 15 | 14.02 | 93.5 | |
| 25 | 25.26 | 101.0 | |
| a.未检出; b.未计算。 a.ND, not detectable; b.NC, not calculated. | |||
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