English

• 肼(N₂H₄)作为一种重要的化工原料，广泛应用在催化剂、农业产品和医药产品等领域^[1]。然而，N₂H₄是发烟的有毒液体，如果在生产、使用或者处理过程中泄露会造成环境和生物体不可修复的损伤。研究表明，挥发的N₂H₄蒸气会刺激人体上呼吸道感染，出现头晕、恶心等症状，还能刺激眼睛导致双目失明^[2-3]。美国环境保护署(EPA)已将N₂H₄列为潜在的致癌物，规定它在饮用水中的浓度不超过0.31 μmol·L^-1[4]。因此，开发检测环境和生物领域中N₂H₄的有效方法具有重要的意义^[5-6]。

  近年来，荧光探针技术在检测重金属离子、有毒气体、有机污染物等有毒有害物质方面得到广泛应用^[7-9]。该检测方法具有操作简单、成本低、响应时间短、选择性高和抗干扰能力强等优点，受到人们越来越多的重视^[10-12]。自从检测N₂H₄的荧光探针被报道以来，大多数探针是利用N₂H₄的强还原性，基于羟基的脱保护处理，构建出了许多识别N₂H₄的荧光探针^[13-14]。但这些探针表现出响应速度慢、荧光发射波长短、响应时间长等缺点，影响了探针的进一步应用^[15-16]。因此，开发出选择性好、发射波长较长、响应时间短的荧光探针，并将其应用在生物检测领域仍然是研究的重点方向^[17-19]。

  吡唑是一个五元杂环，在它的不同位置(1、3、4、5位)上进行配位修饰后可得到不同性质的荧光特性，包括高荧光量子产率、高斯托克斯位移、非线性光学性质等^[20-21]。基于吡唑结构，本工作利用1-苯基-3-(2-噻唑基)-1H-吡唑-4-甲醛(b)和2-[(2，6，6-三甲基环己-1-烯-1-基)亚甲基]丙二腈(c)通过Knoevenagel缩合反应合成了THI。其合成路线如Scheme 1所示。THI以吡唑结构单元为荧光团，通过在吡唑的4号位上引入c来增加探针的共轭结构，可实现对N₂H₄的特异性识别。THI对N₂H₄表现出较高的灵敏度和很强的抗干扰能力，不仅能应用于试纸条上N₂H₄的定量检测，还可对人宫颈癌细胞(HeLa细胞)中的N₂H₄进行荧光成像。

  Scheme 1

  

  Scheme 1.  Synthesis of fluorescent probe THI

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  1.   实验部分

  1.1   仪器与试剂

  实验所用试剂包括2-乙酰基噻唑、苯肼、丙二腈、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、异佛尔酮、三氯氧磷(POCl₃)、肼(N₂H₄)、无水乙醇、甲醇、蒸馏水、冰醋酸(HAc)，均为分析纯。所用仪器包括Agilent DD2-600 MHz核磁共振仪、Thermo Q-Exactive质谱仪、UV-2700紫外可见分光光度计、X-4型熔点显微仪、F-7000荧光分光光度计、RE52CS-1旋转蒸发仪。

  1.2   探针THI的合成

  化合物b和c按照文献^[22-23]的方法制备。将化合物b(0.40 g，1 mmol)和c(0.18 g，1 mmol)溶于甲醇(15 mL)中，滴加哌啶(0.1 mL)，在75 ℃下加热回流5 h，TLC检测反应至完全，用旋转蒸发仪蒸发使析出沉淀，干燥，产率96%，m.p. 228~233 ℃。¹H NMR(400 MHz，DMSO-d₆)：δ 8.47(d，J=16.7 Hz，1H)，7.71(d，J=14.4 Hz，1H)，7.68~7.54(m，2H)，7.58~7.44(m，1H)，7.42~7.12(m，2H)，6.83(s，2H)，6.25(s，1H)，1.87~1.40(m，2H)，1.02(s，2H)。¹³C NMR(100 MHz，DMSO-d₆)：δ 170.51，160.92，156.07，145.28，144.38，138.97，130.77, 130.23, 128.71, 128.11, 127.99，122.55，121.00，120.10，119.11，114.21，113.53，76.55，42.67，40.51，40.39，40.37，38.35，32.19，27.83，27.70，22.70。ESI-MS(m/z)：理论值423.530 64，实验值423.164 00[M]⁺。(图S1~S2，Supporting information)元素分析(C₂₅H₂₁N₅S)计算值(%)：C 70.90；H 5.00；N 16.54；S 7.57；实验值(%)：C 70.82；H 5.13；N 16.61；S 7.65。

  1.3   光谱实验

  首先将THI配制成10 μmol·L^-1的DMF溶液。不同类型的分析物包括无机离子(NO₂^-、ClO₄^-、Cl^-、NO₃^-、SO₄^2-、Na⁺、Cu²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Al³⁺、Fe³⁺、NH₄⁺)、氨基酸[甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、谷氨酸(Glu)、赖氨酸(Lys)]、酶[过氧化氢酶(CAT)、脂肪酶(Lps)、半胱氨酸(Cys)、磷酸二酯酶(PDE)]。将这些分析物用去离子水分别配制成浓度为10 μmol·L^-1的溶液。测试前，将THI和不同类型的分析物混合，然后用DMF/H₂O缓冲溶液(体积比7∶3，pH=7.0)稀释至10 μmol·L^-1。将混合溶液混匀2 min后，在室温下进行紫外和荧光光谱测试(λ_ex=575 nm，λ_em=430 nm，狭缝：10 nm)。检测限(LOD)由公式LOD=3.3S/K_a计算得出，其中S是THI在最大发射波长处10次测定的相对标准偏差，K_a是标准曲线的斜率。

  1.4   滤纸条测试

  将探针THI溶解在DMF溶液中，配制浓度为10 μmol·L^-1的探针溶液，将滤纸浸湿在探针溶液中，用镊子夹出滤纸，在烘箱中烘干或自然风干。随后用0~10 μmol·L^-1的N₂H₄溶液在滤纸条上轻点一下，待滤纸条恢复干燥后，在自然光和365 nm紫外灯下分别进行观察。

  1.5   细胞毒性和荧光成像

  细胞毒性测试：选用HeLa细胞，将细胞悬液接种在96孔板中，在培养箱(37 ℃、CO₂体积分数5%)中培养24 h。接着加入不同浓度(10、25、50、75、100 μmol·L^-1)的THI溶液，继续培养24 h。通过酶标仪测量490 nm处的光密度(OD)值，计算出细胞存活率。

  荧光成像测试：将HeLa细胞接种在培养皿上，在培养箱(37 ℃，5% CO₂)中培养24 h。将细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次后，将细胞分在6孔板上。加入10 μmol·L^-1的THI后在培养箱(37 ℃，5% CO₂)中培养24 h，之后进行荧光成像。

  2.   结果与讨论

  2.1   探针THI对N₂H₄的响应

  为了探究THI对N₂H₄的特异性选择和抗干扰能力，测试了THI在不同分析物(Na⁺、Cu²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Al³⁺、Fe³⁺、NH₄⁺、NO₂^-、ClO₄^-、Cl^-、NO₃^-、SO₄^2-、Gly、Ala、Leu、Glu、Lys、CAT、Lps、Cys、PDE)存在下的荧光响应，并记录了THI在发射波长(λ_ex=575 nm)处的荧光强度。如图 1所示，N₂H₄导致THI的荧光强度显著降低，而其他分析物几乎未引起THI荧光强度的变化，表明THI对N₂H₄具有高度特异性识别能力。图 1的插图进一步显示，加入N₂H₄后，THI溶液的颜色由橙红变为深蓝，表明THI对N₂H₄的特异性识别可实现可视化检测。此外，紫外可见光谱结果表明，THI的最大吸收波长在加入其他分析物后几乎不变，而加入N₂H₄后虽然最大吸收波长未发生位移，但其吸收强度显著降低(图 2)。当N₂H₄与其他分析物共存时，THI对N₂H₄的荧光响应未受明显影响(图 3)。综上所述，THI对N₂H₄表现出优异的选择性和抗干扰能力，能够在复杂环境中实现对N₂H₄的高效检测，并达到可视化检测的目的。

  图 1

  

  图 1.  不同分析物对探针THI荧光强度的影响

  Figure 1.  Effects of various analytes on the fluorescence intensity of probe THI

  Inset: color change of THI before and after adding N₂H₄.

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  图 2

  

  图 2.  不同分析物对THI紫外可见光谱的影响

  Figure 2.  Effects of various analytes on the UV-Vis spectra of probe THI

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  图 3

  

  图 3.  与其他分析物共存时THI对N₂H₄的响应

  Figure 3.  Responses of THI to N₂H₄ in the presence of other analytes

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  2.2   THI对N₂H₄的荧光滴定

  为了研究THI对N₂H₄的灵敏度，在THI(10 μmol·L^-1)溶液中加入不同浓度的N₂H₄，分别进行紫外可见光谱滴定和荧光光谱滴定实验。如图 4所示，随着N₂H₄浓度的增加，THI在425 nm处的吸收峰逐渐降低，并在350 nm处出现等吸收点，当N₂H₄浓度达到10 μmol·L^-1时，THI的吸收峰不再变化，表明THI可以检测等浓度的N₂H₄。如图 5所示，未加入N₂H₄时，THI在575 nm处的荧光强度最强，随着N₂H₄浓度的增加，THI在575 nm处的荧光强度逐渐减弱，直到N₂H₄浓度达到10 μmol·L^-1时荧光强度趋于稳定。对3~9 μmol·L^-1范围内的荧光强度数据进行线性拟合，如图 6所示，THI的荧光强度对N₂H₄浓度表现出良好的线性关系，表明其能够实现对N₂H₄的定量检测。通过检测限公式计算得出，THI对N₂H₄的检测限为0.141 μmol·L^-1(R²=0.993)。综合以上结果，THI对N₂H₄的识别具有高灵敏度，并可在0~10 μmol·L^-1范围内实现定量检测。

  图 4

  

  图 4.  不同N₂H₄浓度对THI的紫外可见光谱的影响

  Figure 4.  Effects of different N₂H₄ concentrations on the UV-Vis spectra of THI

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  图 5

  

  图 5.  不同N₂H₄浓度对THI荧光强度的影响

  Figure 5.  Effects of different N₂H₄ concentrations on the fluorescence intensity of THI

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  图 6

  

  图 6.  THI的荧光强度与N₂H₄浓度之间的线性关系

  Figure 6.  Linear relationship between the fluorescence intensity of THI and the concentration of N₂H₄

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  2.3   THI检测N₂H₄的响应时间和pH适应性

  探针的响应时间是衡量其检测性能的重要指标，因此，研究了THI的荧光强度随时间的变化关系。在THI(10 μmol·L^-1)溶液中加入等浓度的N₂H₄，记录其荧光强度-时间曲线。如图 7所示，THI的荧光强度在15 s突然下降，并在18 s之后达到稳定状态，表明探针THI可在18 s内快速完成对N₂H₄的检测。不同pH值对THI的影响如图 8所示，在pH=3.0~10.0范围内，THI的荧光强度没有明显变化。表明探针THI对pH变化不敏感。而加入N₂H₄后，在pH=7.0时THI荧光强度降低最多，表明THI对N₂H₄的识别在pH=7.0时达到最佳效果，且不受pH变化的干扰。

  图 7

  

  图 7.  加入10 μmol·L^-1 N₂H₄后，THI(10 μmol·L^-1)的荧光强度随时间的变化

  Figure 7.  Time-dependent fluorescence intensity of THI (10 μmol·L^-1) upon the addition of 10 μmol·L^-1 N₂H₄

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  图 8

  

  图 8.  不同pH值对THI检测N₂H₄的影响

  Figure 8.  Effects of different pH values on the detection of N₂H₄ by THI

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  2.4   THI对N₂H₄的识别机理

  为了研究THI对N₂H₄的可能识别机理，进行了质谱测试。如图S4所示，THI与N₂H₄反应生成的THI-1(C₂₂H₂₃N₅S)的m/z最大峰理论值为391.342 79([M+H]⁺)，而质谱在m/z=391.353 03显示出强峰，说明THI与N₂H₄反应确实生成了THI-1。产生这一现象的原因是由于2-[(2，6，6-三甲基环己-1-烯-1-基)亚甲基]丙二腈有很强的吸电子性，而吡唑作为一种富电子的共轭结构，两者合成的探针产生ICT效应，表现出橙红色荧光。N₂H₄具有强还原性和强亲核性，会进攻2-[(2，6，6-三甲基环己-1-烯-1-基)亚甲基]丙二腈基团形成的碳正离子，发生亲核反应生成THI-1，破坏了探针内部的ICT效应，导致荧光猝灭，相应过程如图 9所示。这个结果通过密度泛函理论计算进一步得到验证。如图 10所示，THI的最低分子轨道(LUMO)的电子云只分布在吡唑环和2-[(2，6，6-三甲基环己-1-烯-1-基)亚甲基]丙二腈基团上，而最高分子轨道(HUMO)上的电子云分布均匀，说明分子内确实存在ICT效应，表现为荧光发射。THI-1的LUMO电子云集中在吡唑环和碳碳双键上，HUMO上的电子云均匀分布，这说明THI-1的“推-拉”能力降低，导致ICT过程阻断，能隙为3.42 eV，这也解释了发射光谱中的荧光猝灭现象。

  图 9

  

  图 9.  THI识别N₂H₄的机理

  Figure 9.  Mechanism of THI for recognizing N₂H₄

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  图 10

  

  图 10.  THI和THI-1的分子构型优化和能级轨道分布

  Figure 10.  Molecular configuration optimization and energy level orbital distribution of THI and THI-1

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  2.5   THI对N₂H₄的比色法检测

  为了测试探针THI检测N₂H₄的范围，在含有10 μmol·L^-1探针溶液的滤纸上分别滴加0~10 μmol·L^-1的N₂H₄，自然风干后观察。如图 11所示，在365 nm紫外灯下，加入1 μmol·L^-1的N₂H₄时，滤纸条的颜色已经由深黄色变为无色，随着N₂H₄的浓度增大，颜色变化更加明显。在自然光下，在10 μmol·L^-1 N₂H₄处滤纸条的颜色变为浅黄色。这些结果说明探针THI被制成滤纸条时，也可以检测等量的N₂H₄。

  图 11

  

  图 11.  THI-滤纸条检测N₂H₄

  Figure 11.  Detection of N₂H₄ using THI-based test strips

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  2.6   THI的细胞毒性和荧光成像

  选用HeLa细胞进行细胞毒性测试。如图 12所示，HeLa细胞的存活率都在90%以上，说明探针THI对细胞几乎没有毒性。在细胞毒性测试的基础上，继续使用HeLa细胞进行细胞共聚焦成像。如图 13所示，THI进入HeLa细胞后，在荧光场中有很强的红色荧光，重叠场中荧光明显，说明THI能够在细胞中表现出良好的膜通透性，可以在细胞中荧光成像。加入N₂H₄后的荧光场中几乎看不到红色荧光，重叠场中红色荧光消失，说明THI能够检测细胞中的N₂H₄，在检测生物样品中的N₂H₄方面有潜在的应用价值。

  图 12

  

  图 12.  THI在HeLa细胞中的毒性测试

  Figure 12.  Toxicity test of THI in HeLa cells

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  图 13

  

  图 13.  在HeLa细胞中，THI加入N₂H₄前后的荧光成像

  Figure 13.  Fluorescence imaging of THI in HeLa cells before and after the addition of N₂H₄

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  3.   结论

  合成了一种特异性识别N₂H₄的荧光探针THI。光谱性能测试结果表明，在pH=7.0的条件下，该探针对N₂H₄表现出优异的选择性、高灵敏度、强抗干扰能力以及快速的响应时间(18 s)，其检测限低至0.141 μmol·L^-1。此外，滤纸条实验证实THI能够比色检测等浓度的N₂H₄；利用THI还成功实现了HeLa细胞中N₂H₄的荧光成像。本工作开发的荧光探针THI在生物成像领域展现出重要的应用潜力。

  
  Supporting information is available at http://www.wjhxxb.cn
  
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  Scheme 1  Synthesis of fluorescent probe THI

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  图 1  不同分析物对探针THI荧光强度的影响

  Figure 1  Effects of various analytes on the fluorescence intensity of probe THI

  Inset: color change of THI before and after adding N₂H₄.

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  图 2  不同分析物对THI紫外可见光谱的影响

  Figure 2  Effects of various analytes on the UV-Vis spectra of probe THI

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  图 3  与其他分析物共存时THI对N₂H₄的响应

  Figure 3  Responses of THI to N₂H₄ in the presence of other analytes

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  图 4  不同N₂H₄浓度对THI的紫外可见光谱的影响

  Figure 4  Effects of different N₂H₄ concentrations on the UV-Vis spectra of THI

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  图 5  不同N₂H₄浓度对THI荧光强度的影响

  Figure 5  Effects of different N₂H₄ concentrations on the fluorescence intensity of THI

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  图 6  THI的荧光强度与N₂H₄浓度之间的线性关系

  Figure 6  Linear relationship between the fluorescence intensity of THI and the concentration of N₂H₄

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  图 7  加入10 μmol·L^-1 N₂H₄后，THI(10 μmol·L^-1)的荧光强度随时间的变化

  Figure 7  Time-dependent fluorescence intensity of THI (10 μmol·L^-1) upon the addition of 10 μmol·L^-1 N₂H₄

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  图 8  不同pH值对THI检测N₂H₄的影响

  Figure 8  Effects of different pH values on the detection of N₂H₄ by THI

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  图 9  THI识别N₂H₄的机理

  Figure 9  Mechanism of THI for recognizing N₂H₄

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  图 10  THI和THI-1的分子构型优化和能级轨道分布

  Figure 10  Molecular configuration optimization and energy level orbital distribution of THI and THI-1

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  图 11  THI-滤纸条检测N₂H₄

  Figure 11  Detection of N₂H₄ using THI-based test strips

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  图 12  THI在HeLa细胞中的毒性测试

  Figure 12  Toxicity test of THI in HeLa cells

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  图 13  在HeLa细胞中，THI加入N₂H₄前后的荧光成像

  Figure 13  Fluorescence imaging of THI in HeLa cells before and after the addition of N₂H₄

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