English

• 在癌症的临床治疗领域，以顺铂为代表的金属类药物因其独特的作用机制，在化疗药物中占据重要地位^[1]。顺铂通过与癌细胞的细胞核DNA结合，干扰其正常的DNA复制和修复过程，从而阻止癌细胞的分裂和生长^[2]。这种作用机制使得顺铂能够有效地对多种实体肿瘤进行治疗，包括结肠直肠癌和非小细胞肺癌等。然而，顺铂的副作用和耐药性问题常常导致治疗效果不尽如人意^[3-4]。因此，开发具有高效、低毒的金属配合物成为亟需解决的问题。

  近年来，相较于铂类药物，非铂类金属配合物因其多样的结构、多元的配位模式、丰富的光学特性以及与顺铂不同的抗肿瘤机制等优势，激发了科研人员浓厚的研究兴趣^[5-8]。其中，环金属铱(Ⅲ)配合物具有独特抗肿瘤作用和出色的生物成像能力，促使科研人员在抗癌应用研究上投入巨大的努力^[9]。例如，我们课题组报道了一种环金属铱配合物CycloIr-OA，其能在线粒体积累并产生活性氧物质(ROS)，导致肿瘤细胞周期阻滞在S期^[10]；还报道了一种靶向溶酶体铱(Ⅲ)配合物Ir-9-Ac，通过ROS依赖的p38信号通路诱导细胞周期阻滞和凋亡^[11]。此外，我们还发现了一种金属配合物Ir-Rhein，其可以调节铂耐药相关转运蛋白，以克服耐药性^[12]。毛宗万课题组报道了2种铱(Ⅲ)-三苯胺光敏剂(IrC和IrF)，它们通过诱导典型细胞焦亡与铁死亡同时发生，增强了抗肿瘤治疗的免疫激活^[13]。巢晖课题组报道了5种线粒体靶向的环金属铱(Ⅲ)配合物用于肿瘤低氧成像和治疗^[14]。

  天然产物具有新颖多样的结构，已被证明是丰富的药物来源，并在癌症治疗领域发挥着重要作用。我们课题组在天然产物的金属化修饰方面进行了多项研究，并取得了显著进展。我们发现引入齐墩果酸的铱/钌芳基金属配合物能够发挥抗肿瘤和抗转移活性^[15]；反式阿魏酸钌配合物表现出优异的pH响应能力和荧光性能^[16]；大黄酸衍生的铑配合物(Rh1)兼具抗FTO活性和抗肿瘤效果^[17]；将具有抗癌活性的α-硫辛酸整合到铱基配合物中，改变其脂溶性来增强细胞内的吸收，发挥抗肿瘤作用^[18]。脱氢松香酸(DHA)是一种天然的二萜树脂酸，可以很容易地从松香衍生的主要下游产品—歧化松香中获得。据报道，DHA及其衍生物在高浓度条件下显示出广泛的生物活性，如抗炎、抗病毒、抗菌等，尤其是抗肿瘤活性^[19]。然而DHA及其衍生物在某些癌细胞系中仅显示出中等细胞毒性。这意味着它们对某些类型的癌细胞可能不够有效，需要进一步的结构优化和活性增强。在先前研究的基础上，我们提出了一种金属-配体协同增强(metal-ligand syn- ergistic enhancement，MLSE)策略，通过精心挑选具有特定功能和作用机制的金属和有机前体，以此实现提升抗癌配合物的效能和揭示其新颖作用途径的目的^[20]。例如我们曾报道一种环戊二烯铱-白桦脂醇配合物Ir-Bet，该配合物能通过促进铁死亡和激活NF-κB通路来增强免疫反应并诱导细胞死亡^[20]。此外，我们还报道了一种钌􀃭-芳烃配合物RuBTB，它可通过谷胱甘肽(GSH)代谢失衡来诱导铁死亡，逆转耐药性，并激活抗肿瘤免疫^[21]。另外，一种结合了姜黄素的锇-芳烃配合物也被开发出来，可作为光激活化疗的高效光敏剂应用于抗癌治疗^[8]。

  基于MLSE策略，我们将DHA引入到环金属铱中，设计合成了一种金属配合物 CycIr-DHA。CycIr-DHA对多种肿瘤细胞如人乳腺癌细胞(MCF- 7)、人非小细胞肺癌细胞(A549)、人卵巢癌细胞(A2780)表现出强烈的抗肿瘤活性，其效果优于顺铂。CycIr-DHA主要在MCF-7的线粒体聚集，促使细胞内ROS水平上升，进而导致线粒体功能障碍。此外，CycIr-DHA还能调节与凋亡相关的蛋白(抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax)的表达水平，增强LC3-Ⅱ蛋白的表达，从而促进细胞凋亡和自噬过程。这项研究为抗癌配合物的开发提供了新视角。

  1.   实验部分

  1.1   实验试剂和仪器

  在实验过程中使用的化学药品和试剂均为市售的分析纯级别，可以直接用于实验，无需进一步纯化。1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)等均购自Aladdin公司。DHA、顺铂、三乙胺(TEA)、1-羟基苯并三唑(HOBT)和N，N-二甲基甲酰胺(DMF)等均购自南京晚晴化玻仪器有限公司。抗体anti - LC3、羊抗兔FITC标记二抗等均购自Proteintech公司。Calcein AM/PI细胞活性与细胞毒性检测试剂盒均购自碧云天生物技术有限公司。Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒、ROS检测试剂盒、细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)、细胞核染料DAPI、BCA蛋白定量试剂盒等均购自凯基生物有限公司。DMEM培养基、青霉素/链霉素、胎牛血清(FBS)等均购自Gibco公司。

  本实验中，¹H NMR检测采用Bruker Avance Ⅱ 400 MHz核磁共振光谱仪完成；紫外可见(UV-Vis)光谱数据使用Lambda 365紫外可见分光光度计测得；荧光光谱数据使用FS5荧光分光光度计获得。化合物的细胞毒活性采用多功能酶标仪LabServ K3进行测定。此外，利用激光共聚焦扫描显微镜(CLSM，A1，Nikon)对配合物在细胞内的共定位成像进行了测试。同时，采用流式细胞仪(BD Accuri C6 Plus)对细胞凋亡、ROS等进行分析测定。

  1.2   配体及配合物的合成

  1.2.1   4-(4'-甲基-2，2'-联吡啶)-甲胺(bpy-NH₂)的合成

  在氩气氛围中，称取二氧化硒(4.4 g，39.8 mmol) 和4，4'-二甲基-2，2'-联吡啶(5.2 g，28.5 mmol)溶解在1，4-二氧六环(500 mL)中，加热回流24 h。反应结束后，冷却至室温，旋蒸除去溶剂。接着，向残余物中加入50 mL饱和碳酸氢钠溶液，用二氯甲烷萃取3次，合并有机相，减压旋蒸除去溶剂，然后加入100 mL 0.3 mol·L^-1的焦亚硫酸钠，充分搅拌并抽滤，将滤液用饱和碳酸钠溶液调节pH到10.0，再用二氯甲烷萃取，减压除去有机相溶剂，干燥，得白色固体产物(4.5 g，75%)。

  将上一步获得的白色固体(3.6 g，18 mmol)、盐酸羟胺(10.8 g，64.8 mmol)、碳酸钾(8.0 g，57.9 mmol)溶解在甲醇和水(1∶1，V/V)混合溶剂中，加热回流1 h。反应结束后，立即向溶液中加入冰水，得到白色固体沉淀，过滤、洗涤、真空干燥，得白色固体产物(3.4 g，87%)。

  将第二步得到的白色固体(3.0 g，14.7 mmol)、醋酸铵(4.9 g，37.5 mmol)溶解在30 mL氨水中，并加入等体积的乙醇和水混合溶剂，加热回流反应0.5 h后，缓慢加入锌粉(4.2 g，75 mmol)继续反应3 h，冷却至室温，过滤，减压蒸馏除去乙醇，加入氢氧化钠，用二氯甲烷萃取，合并有机相，减压除去溶剂，真空干燥，硅胶色谱柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇，10∶1，V/V)得到白色固体bpy-NH₂(2.5 g，83%)。¹H NMR(400 MHz，CDCl3)：δ 8.64(d，J=5.0 Hz，1H)，8.56(d，J=5.0 Hz，1H)，8.36(s，1H)，8.26(s，1H)，7.31(dd，J=5.0，1.6 Hz，1H)，7.16(dd，J=5.0，1.5 Hz，1H)，4.01(s，2H)，2.46 (s，3H)。

  1.2.2   配合物[Ir(ppy)₂(bpy-NH₂)]Cl (Ir-NH₂)的合成

  在氩气保护下，将三氯化铱(158 mg，0.5 mmol) 和2-苯基吡啶(194 mg，1.25 mmol)溶解在2-乙氧基乙醇和水(4∶1，V/V)中，110 ℃下反应回流24 h，冷却至室温，过滤得环金属铱二聚体[Ir(ppy)₂Cl]₂，将[Ir(ppy)₂Cl]₂(53.6 mg，0.05 mmol)与bpy-NH₂(19.9 mg，0.1 mmol)溶解在二氯甲烷和甲醇(2∶1，V/V)中，50 ℃条件下回流搅拌12 h，减压旋蒸除去溶剂，通过硅胶填充的色谱柱纯化(二氯甲烷/甲醇，50∶1，V/V)粗产物，得到黄色粉末 Ir-NH₂(22 mg，57%)。¹H NMR (400 MHz，DMSO-d₆)：δ 8.89(s，1H)，8.79(s，1H)，8.36~ 8.26(m，2H)，7.96(d，J=8.1 Hz，4H)，7.78(d，J=5.6 Hz，1H), 7.73(d，J=5.7 Hz，1H)，7.66(q，J=6.3，5.8 Hz，3H)，7.57(d，J=5.7 Hz，1H)，7.20(t，J=6.7 Hz，2H)，7.06(t，J= 7.5 Hz，2H)，6.94(t，J=7.4 Hz，2H)，6.24(d，J=7.5 Hz，2H)，4.01(s，2H)，2.58(s，3H)。

  1.2.3   配合物[Ir(ppy)₂(bpy-DHA)]Cl (CycIr-DHA)的合成

  在氩气氛围下，将DHA(60 mg，0.3 mmol)、EDCI (38 mg，0.2 mmol)加入到圆底烧瓶中，加入无水DMF (20 mL)溶解，再加入300 μL TEA，将反应装置放置在冰浴中，并做避光处理，搅拌20 min，将HOBT (21.6 mg，0.16 mmol)溶解在2 mL的无水DMF溶剂中，用注射器加入至反应装置，继续反应20 min。接着，将 Ir-NH₂(140 mg，0.2 mmol)溶解在3 mL无水DMF溶剂中，用注射器加入至反应装置中继续反应过夜。反应完成后将反应液转移至分液漏斗中，加入水和乙酸乙酯，用乙酸乙酯萃取，合并有机相并旋蒸浓缩粗产物，通过100~200目硅胶填充的色谱柱层析纯化(二氯甲烷/甲醇，20∶1，V/V)，得到黄色的纯品 CycIr-DHA(55 mg，31%)。¹H NMR(400 MHz，DMSO-d₆)：δ 8.73~8.69(m，1H)，8.64(d，J=5.5 Hz，1H)，8.39~8.29(m，1H)，8.29~8.23(m，2H)，7.95~7.89(m，4H)，7.82~7.77(m，1H)，7.70(dd，J=5.6，2.0 Hz，1H)，7.64~7.52(m，3H)，7.44~7.39(m，1H)，7.16(ddt，J=8.8，4.3, 2.0 Hz，3H)，7.06~6.94(m，3H)，6.93~6.87(m，2H)，6.80~6.71(m，1H)，6.20(td，J=7.1，6.6，3.3 Hz，2H)，4.59~4.35(m，2H)，2.87~2.55(m，2H)，2.53(d，J=2.0 Hz，3H)，2.07~1.96(m，1H)，1.68(dd，J=25.3，12.7 Hz，4H), 1.59~1.48(m，2H)，1.40~1.32(m，1H)，1.23(s，1H)，1.17(dd，J=6.9，4.9 Hz，6H)，1.13(d，J=5.4 Hz，3H)，1.07(d，J=7.5 Hz，1H)，0.95~0.91(m，1H)，0.88~0.81 (m，2H)。

  1.3   配合物的光物理性质检测

  取适量的配合物 Ir-NH₂、CycIr-DHA用DMSO配制成储备液，用PBS将配合物 Ir-NH₂、CycIr-DHA的储备液稀释至10 μmol·L^-1(DMSO/PBS，1∶ 99，V/V)，在2个比色皿中加入空白溶液(DMSO/PBS，1∶99，V/V)以扣除背景，再加入10 μmol·L^-1的配合物溶液(DMSO/PBS，1∶99，V/V)进行测量，每组数据重复3次。使用紫外分光光度计记录谱图，并确定配合物溶液中吸收最大的波长。随后，在荧光分光光度计中，以该最大吸收波长作为激发波长，测定配体和配合物的荧光发射光谱。

  1.4   细胞毒性检测

  采用MTT法测试DHA、Ir-NH₂、CycIr-DHA以及顺铂(CDDP)对A549、A2780、MCF-7这几种人源癌细胞系和正常人肺成纤维细胞(HLF)的细胞毒性，其中顺铂作为阳性对照。将5 000个细胞接种于96孔培养板中，并在37 ℃、5%的CO₂的环境中培养12 h。随后，向孔中加入含有体积分数为1%的DMSO的培养基测试药物，继续在相同条件下培养48 h。培养结束后，在避光条件下向孔中加入20 μL的MTT溶液，继续培养4 h。之后，移除孔中的培养基，并加入150 μL DMSO溶液以溶解由细胞生成的甲瓒晶体。在LabServ K3酶标仪上振荡1 min，以便充分溶解晶体，并在490 nm波长处测量吸光度。每组药物处理的实验均重复3次，以确保结果的准确性。

  1.5   配合物的脂溶性测试

  使用摇瓶法测定并计算 Ir-NH₂和 CycIr-DHA的脂水分配系数lg P_o/w。将适量的配合物，溶解在质量分数为0.9% 的NaCl溶液饱和的正辛醇中，充分振荡24 h，以确保水相和有机相达到饱和状态。静置一段时间后，将样品以2 000 r·min^-1的转速离心5 min后，使用滴管小心地分别吸取上层的正辛醇和下层的水相，并对它们进行吸光度测定。对正辛醇和水相中的吸光度的比值求对数计算出脂水分配系数lg P_o/w。每组实验均进行3次平行测定。

  1.6   细胞定位检测

  通过CLSM检测 CycIr-DHA在MCF-7中的分布情况。在共聚焦小皿中以5×10⁴ mL^-1的密度接种MCF-7，贴壁培养12 h。加入含有 CycIr-DHA(2.5 μmol·L^-1)的DMEM培养基继续培养12 h。用PBS洗涤3次除去培养基，在对应的孔内加入线粒体探针Mito-tracker green，溶酶体探针Lyso-tracker green和细胞核探针Hoechst 33342染料，在37 ℃避光条件下培养30 min后弃去染料，并用PBS洗涤细胞3次，在共聚焦显微镜下进行测试。线粒体探针：λ_ex=490 nm，λ_em=516 nm；溶酶体探针：λ_ex=488 nm，λ_em=(520± 20) nm；细胞核探针：λ_ex=346 nm，λ_em=460 nm。

  1.7   细胞内ROS检测

  将MCF-7以每孔3×10⁵个细胞的密度接种到6孔培养板中，待细胞贴壁后，将 CycIr-DHA(2.5、5 μmol·L^-1)、Ir-NH₂(5 μmol·L^-1)以及配体DHA加入到细胞中培养12 h，然后PBS洗涤2遍，加入500 μL含有10 μmol·L^-1 H2DCFDA(2', 7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯)的纯DMEM培养基中避光培养30 min，收集细胞，用PBS洗涤2遍，并用500 μL PBS重悬细胞，利用流式细胞仪对样本进行检测，每个浓度的实验均重复3次以确保数据的一致性。最后使用FlowJo 10.1软件对流式细胞数据进行分析。H2DCFDA：λ_ex=488 nm，λ_em=510~550 nm。

  将MCF-7以每孔5×10⁴个细胞的密度在共聚焦培养皿上接种12 h，然后用CycIr-DHA(2.5、5 μmol· L-1)和 Ir-NH₂(5 μmol·L^-1)处理24 h。之后用1×PBS清洗2遍，并用10 μmol·L^-1 H2DCFDA在37 ℃下再培养30 min。染色完成后，用PBS洗涤3遍。采用CLSM观察并进行荧光成像，随后利用NIS-Elements Viewer软件进行后续的图像处理。

  1.8   线粒体膜电位检测

  将MCF-7以每孔3×10⁵个细胞的密度接种于6孔板中，在5% CO₂的恒温箱中培养12 h，然后加入含有不同浓度的CycIr - DHA(2.5、5 μmol·L^-1) 和 Ir-NH₂(5 μmol·L^-1)的DMEM培养基继续培养24 h。收集细胞，用PBS洗涤2遍，将500 μL JC-1工作液加入到离心管中，避光条件下培养30 min。离心收集细胞，用JC-1染色缓冲液洗涤2遍，在每个离心管中加入500 μL JC-1染色缓冲液重悬。使用流式细胞仪对样品进行测试，通过FlowJo 10.1软件分析所得的流式数据。

  将MCF-7以每孔5×10⁴个细胞的密度在共聚焦培养皿上接种12 h，然后用不同浓度的 CycIr-DHA (2.5、5 μmol·L^-1)和Ir-NH₂(5 μmol·L^-1)处理24 h。结束后，除去培养基，用PBS洗涤3次，将1×JC-1工作液以每孔500 μL加入到共聚焦小皿中，在310 K避光条件下培养20 min。用JC-1染色缓冲液洗涤2次，并用CLSM进行荧光成像。JC-1 monomers：λ_ex= 490 nm，λ_em= (520±20) nm；JC - 1 aggregates：λ_ex=525 nm，λ_em=(580±20) nm。

  1.9   细胞凋亡检测

  将MCF-7以3×10⁵ mL^-1的密度接种在6孔板中，孵育12 h。用PBS洗涤除去培养基，然后向其中加入含有不同浓度的 CycIr-DHA(2.5、5 μmol·L^-1)和 Ir-NH₂(5 μmol·L^-1)的DMEM培养基，继续培养24 h，以CDDP作为阳性对照，用胰酶(不含EDTA)消化收集细胞，PBS洗涤细胞2次，加入500 μL的Binding buffer重悬细胞。将5 μL的V-FITC和5 μL的PI分别加入到每个孔中，阳性对照组单独加入5 μL的FITC和5 μL的PI，用于上机检测时调整补偿。在37 ℃避光培养20 min，30 min内使用流式细胞仪对样品进行检测。FITC：λ_ex=488 nm，λ_em=500~560 nm；PI：λ_ex=488 nm，λ_em=510~610 nm。

  1.10   细胞免疫荧光

  将MCF-7以4×10⁴ mL^-1的密度接种在共聚焦小皿中，在5% CO₂的恒温箱中培养12 h，加入5 μmol· L-1 CycIr-DHA、5 μmol·L^-1 Ir-NH₂、DHA，孵育24 h。弃去培养基，PBS洗涤2次，加入每孔500 μL预冷的4% 多聚甲醛，固定细胞15 min，弃去固定液，用PBS洗涤3次，加入每孔500 μL体积分数为0.2% 的TritonX-100促渗液，促渗15 min，然后弃去促渗液，用PBS洗涤3次，加入每孔500 μL质量分数为1.5%的牛血清蛋白，室温封闭30 min，加入一抗LC3兔多抗工作液至细胞中，摇床上4 ℃冰箱培养过夜。回收一抗LC3兔多抗并用PBS洗涤细胞3次，在加入稀释好的二抗FITC标记的羊抗兔lgG在室温下继续避光培养1 h后，去除二抗，PBS洗涤3次，加入每孔100 μL DAPI对细胞核避光染色5 min。去除染料并用PBS洗涤3次，在CLSM下进行拍摄。DAPI：λ_ex=405 nm，λ_em=425~475 nm；FITC：λ_ex=488 nm，λ_em= 510~545 nm。

  1.11   蛋白免疫印迹(western blot，WB)技术

  将MCF-7以2×106 mL^-1的密度接种到10 cm培养皿中，培养12 h，然后向其中加入含有不同浓度的 CycIr-DHA(0、2.5、5 μmol·L^-1)、Ir-NH₂(5 μmol·L^-1)、DHA的DMEM培养基，培养24 h，胰酶消化全收集细胞，并用预冷的PBS洗涤2次。按照RIPA细胞裂解试剂盒的操作指南来处理细胞，每孔加入150 μL裂解液，并将细胞悬浮液放置于冰上裂解20 min，每间隔5 min振荡1遍使其充分混匀，在4 ℃以13 000 r·min^-1离心15 min，收集上清液于离心管中，依据蛋白质标准曲线，对每个提取样品的蛋白质浓度进行测定，每个蛋白浓度平行测量3次，用来进行总蛋白质含量的定量分析。确定蛋白浓度后，用PBS将不同浓度的蛋白稀释至最小浓度，随后添加上样缓冲液，并在95 ℃下加热15 min，最后，将样品放置在室温下进行冷却，以便进行后续的实验步骤。

  参照SDS-PAGE凝胶配制试剂盒制备12% 凝胶，每孔上样的蛋白浓度在20~40 μg，电泳过程中待溴酚蓝指示剂跑至凝胶底部时停止电泳。接着在恒定电流200 mA下，冰浴下转膜1 h。将目的蛋白转移印到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。转印结束后，用MILL-Q水漂洗膜，用封闭液在室温下封闭2 h，封闭结束后将膜放入已配制好的一抗稀释液中，在4 ℃下孵育过夜。之后将膜用PBST洗涤4遍，每次5 min。用封闭液配制二抗，在室温下孵育1 h。将膜用PBST洗涤4遍，每次8 min。最后将膜用MILL-Q水清洗，放入显影液2 min，接着通过化学发光检测仪进行拍摄成像。

  1.12   3D细胞球毒性实验

  将MCF-7接种在超低吸附性的96孔板中，并在5% CO₂、310 K的条件下培养72 h。在此过程中，观察细胞聚集形成稳定的球状结构(细胞球直径>500 μm)。然后添加 CycIr-DHA(12.5 μmol·L^-1)、Ir-NH₂ (12.5 μmol·L^-1)和DHA(50 μmol·L^-1)。在接下来的5 d内，使用显微镜(4倍放大)定期观察并记录细胞球的形态和大小变化。第5天，当配合物 CycIr-DHA处理的细胞球直径＜400 μm时，停止监测，并统计细胞球在5 d内的大小变化，将细胞球用PBS洗涤2次，挑选形态完整、结构良好的细胞球进行活死染色实验，向每孔加入100 μL染色液（Calcein AM和PI），在310 K避光孵育30 min，染色结束后弃去染液，用PBS洗涤2次，将细胞球转移至2 mL离心管中，用1 mL枪头将细胞球吸到共聚焦小皿中使用共聚焦显微镜进行分析。Calcein AM：λ_ex=488 nm，λ_em=500~550 nm；PI：λ_ex=561 nm，λ_em=570~620 nm。

  2.   结果与讨论

  2.1   合成和表征

  以金属配合物前体Ir-NH₂作为对照配合物，其合成参考文献方法制备^[12]。将天然产物DHA引入到环金属铱二聚体[Ir(ppy)₂Cl]₂中，通过酰胺反应得到金属配合物 CycIr-DHA。合成路线如图 1所示，通过 ¹H NMR对配合物 Ir-NH₂及 CycIr-DHA的结构进行表征(图S1和S2，Supporting information)。

  图 1

  

  图 1.  配合物CycIr-DHA的合成路线

  Figure 1.  Synthetic route for complex CycIr-DHA

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  2.2   配合物的光学性质

  环金属铱配合物具有显著的斯托克斯位移、宽吸收范围、双/多光子吸收、长发射寿命和红光/近红外光发射等光物理特性，在生物医学领域具有重要应用^[22]。为了探究配合物的发光特性，我们对其进行了UV-Vis吸收和荧光发射光谱的测定（图 2A、2B）。在吸收光谱中，Ir-NH₂和 CycIr-DHA的吸收峰位置略有不同，Ir-NH₂的吸收峰在260 nm，CycIr-DHA的吸收峰在280 nm。另外CycIr-DHA的吸收峰强度略低于 Ir-NH₂，这可能是因为环金属化导致的电子结构变化影响了π-π*跃迁的能量^[23]。在405 nm的光激发下，CycIr-DHA的荧光发射峰强度远高于 Ir-NH₂，且发射波长发生部分红移(Ir-NH₂：620 nm，CycIr-DHA：630 nm)。这种增强的荧光强度和红移可能是由于DHA配体的引入增加了分子的共轭程度，从而降低了带隙，导致发射波长红移^[24]。

  图 2

  

  图 2.  Ir-NH₂和CycIr-DHA(10 μmol·L^-1) 在298 K时PBS（含1% DMSO, pH=7.40）中的(A) UV-Vis吸收和(B) 荧光发射谱图; (C) Ir-NH₂和CycIr-DHA的lg P_o/w

  Figure 2.  (A) UV-Vis absorption and (B) fluorescence emission spectra of Ir-NH₂ and CycIr-DHA (10 μmol·L^-1) in PBS (containing 1% DMSO, pH=7.40) at 298 K; (C) lg P_o/w of Ir-NH₂ and CycIr-DHA

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  抗癌剂的亲脂性影响其穿过细胞膜的能力，从而影响其药理活性，这种能力可以通过lg P_o/w来量化^[25]。如图 2C所示，Ir-NH₂的lg P_o/w约为0.73。相比之下，CycIr-DHA表现出显著增强的亲脂性，lg P_o/w约为1.64。这种亲脂性的增加表明 CycIr-DHA具有更高进入细胞的倾向，并且更容易参与细胞内的过程。

  2.3   细胞毒活性

  采用MTT实验测试DHA及配合物Ir - NH₂、CycIr-DHA对人源细胞株MCF-7、A549、A2780及正常细胞株HLF的细胞毒性，以CDDP为阳性对照药物。根据表 1的数据，DHA对各类肿瘤细胞和正常细胞均无明显毒性(IC₅₀>73.1 μmol·L^-1)。配合物 Ir-NH₂对MCF-7、A549、A2780均表现出较好的抗肿瘤活性，其IC₅₀分别为17.8、15.2、14.2 μmol·L^-1。而当二者通过酰胺键连接得到配合物CycIr-DHA时，其对上述肿瘤细胞的杀伤作用显著增强，效果超过了常用的化疗药物CDDP。特别是对MCF-7，IC₅₀为2.5 μmol·L^-1，有效抑制了MCF-7的增殖。基于这些发现，选择MCF-7作为模型，进一步研究 CycIr-DHA的抗癌作用机制。

  表 1

  

  表 1  DHA、Ir-NH₂、CycIr-DHA和CDDP对不同细胞株48 h的IC₅₀值

  Table 1.  IC 50 values of DHA, Ir-NH₂, CycIr-DHA, and CDDP on different cell lines for 48 h  μmol·L^-1

  下载: 导出CSV

  Compound	MCF-7	A549	A2780	HLF
  DHA	80.3±0.8	73.1±1.3	78.3±0.5	> 100
  Ir-NH2	17.8±1.1	15.2±0.3	14.2±0.9	38.4±0.2
  CycIr-DHA	2.5±0.1	5.5±0.1	4.3±0.1	7.3±0.1
  CDDP	8.3±0.1	11.7±0.1	8.6±0.1	7.2±0.1

  2.4   配合物的亚细胞器分布

  药物在细胞内的分布对其诱导的细胞死亡机制具有重要影响^[26]。配合物 CycIr-DHA在溶液里展现出优异的荧光发射特性，因此我们使用溶酶体探针Lyso - tracker green、线粒体探针Mito - tracker green及细胞核探针Hoechst 33342，通过CLSM分析了 CycIr-DHA在MCF-7内的分布情况。由图 3发现配合物 CycIr-DHA的红色荧光和线粒体绿色荧光之间存在明显重叠，皮尔逊相关系数(Pearson cor- relation coefficient，PCC)约为0.83。而配合物 CycIr-DHA在溶酶体、细胞核中的相关性最弱，PCC分别约为0.28、0.36。这表明 CycIr-DHA更容易在线粒体富集，这一结果表明配合物可能通过线粒体途径造成肿瘤细胞的死亡。

  图 3

  

  图 3.  配合物CycIr-DHA在MCF-7中亚细胞器中的CLSM图

  Figure 3.  CLSM images of subcellular organelles of complex CycIr-DHA in MCF-7

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  2.5   配合物诱导MCF-7内ROS的产生和线粒体功能损伤

  线粒体是细胞内生成ROS的主要场所，而过量的ROS可以损伤线粒体DNA、蛋白质和脂质，导致线粒体功能障碍^[27]。与正常细胞相比，肿瘤细胞能够产生更多的ROS，并且更加依赖于抗氧化防御系统的保护。因此，通过CLSM和流式细胞术使用荧光探针H2DCFDA来检测细胞内ROS水平。H 2DCFDA被细胞内ROS氧化后产生绿色荧光产物DCF(Dichlorofluorescein)。从图 4A中能够看出，在未处理药物的对照组MCF-7中，没有表现出绿色荧光，但在对照组 Ir-NH₂(5 μmol·L^-1)的细胞内有微弱的DCF荧光信号，说明Ir-NH₂可以诱导肿瘤细胞产生少量的ROS。在用相同浓度的 CycIr-DHA处理的MCF-7中，我们观察到明显的绿色荧光信号，这表明DHA的引入可诱导MCF-7内ROS水平升高。同时，流式细胞术的定量分析显示细胞内ROS的增加以药物浓度依赖性方式产生。当 CycIr-DHA加药浓度为2.5 μmol·L^-1时，ROS水平是未加药组的1.9倍；加药浓度为5 μmol·L^-1时，ROS水平是未加药组的2.4倍。另外，在相同浓度下，CycIr-DHA处理组的ROS水平约为 Ir-NH₂的1.7倍(图 4B和4C)。这表明ROS的产生可能是抑制肿瘤细胞增殖的原因之一。

  图 4

  

  图 4.  (A) Ir-NH₂和CycIr-DHA诱导MCF-7的ROS生成的CLSM图; (B) DHA、Ir-NH₂、CycIr-DHA对MCF-7的ROS生成的流式细胞图及(C) ROS水平表达量变化柱状图

  0: control; 1: DHA (5 μmol·L^-1); 2: Ir-NH₂ (5 μmol·L^-1); 3: CycIr-DHA (2.5 μmol·L^-1); 4: CycIr-DHA (5 μmol·L^-1).

  Figure 4.  (A) CLSM images of ROS generation in MCF-7 induced by Ir-NH₂ and CycIr-DHA; (B) ROS generation by flow cytometry and (C) histogram of ROS expression changes in MCF-7 induced by DHA, Ir-NH₂, and CycIr-DHA

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  线粒体是细胞内产生ROS的主要场所，同时也是调节细胞凋亡的重要细胞器。为了进一步研究ROS生成对线粒体膜电位(MMP)的影响，使用CLSM检测不同药物处理后的MMP探针JC-1的荧光强度变化。图 5A显示未加药物和Ir-NH₂处理后JC-1以聚集体的形式存在，发出红色荧光，MMP较高。CycIr-DHA(2.5、5 μmol·L^-1)处理后，JC-1的红色荧光减弱，绿色荧光增强，表明JC-1从聚集体转变为单体，说明了 CycIr-DHA可以损伤线粒体。此外，我们还通过流式细胞仪检测了 CycIr-DHA诱导线粒体损伤的能力。流式细胞术分析显示(图 5B)，未加药物和 Ir-NH₂处理后线粒体中的JC-1单体比例较低，Ir-NH₂处理后，JC-1单体的比例仅从14.7%增加到17.4%，变化不明显，表明线粒体膜电位高。相比之下，经过CycIr-DHA(2.5 μmol·L^-1)处理后，JC-1单体比例从14.7% 逐渐增加到26.6%；当药物浓度增加到5 μmol·L^-1时，JC-1单体比例进一步由14.7% 增加到47.2%。证实了配合物 CycIr-DHA可以诱导MCF-7线粒体膜电位显著降低，有助于肿瘤细胞的凋亡。

  图 5

  

  图 5.  (A) Ir-NH₂、CycIr-DHA对MCF-7的线粒体膜电位变化的CLSM图; (B) 流式细胞仪检测Ir-NH₂、CycIr-DHA对MCF-7的线粒体膜电位变化

  0: control; 2: Ir-NH₂ (5 μmol·L^-1); 3: CycIr-DHA (2.5 μmol·L^-1); 4: CycIr-DHA (5 μmol·L^-1).

  Figure 5.  (A) CLSM images of mitochondrial membrane potential changes in MCF-7 by Ir-NH₂ and CycIr-DHA; (B) Changes in mitochondrial membrane potential of MCF-7 treated with Ir-NH₂ and CycIr-DHA by flow cytometry

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  2.6   配合物诱导MCF-7细胞凋亡

  我们进一步利用流式细胞术和WB技术研究了 CycIr-DHA诱导的细胞凋亡机制。结果如图 6A和6B所示。与未加药物的对照组相比，DHA和 Ir-NH₂处理后没有表现出明显的细胞凋亡迹象，细胞仍处于正常细胞的特征区域。然而，低浓度 CycIr-DHA(2.5 μmol·L^-1)处理过的MCF-7的晚凋百分数从0.087% 增加到9.69%；当药物浓度增加至5 μmol·L^-1时，晚凋百分数增加到27.50%。这表明 CycIr-DHA能够以剂量依赖性方式诱导细胞发生凋亡。此外，通过WB实验探究了参与细胞凋亡的Bcl-2家族蛋白(抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax) 的表达水平变化，这一结果也进一步证实了 CycIr-DHA能够诱导肿瘤细胞凋亡。具体来说，当CycIr-DHA的浓度为2.5 μmol·L^-1时，Bax蛋白的表达量增加了2倍，而Bcl-2蛋白的表达量减少了30%。当药物浓度提高到5 μmol·L^-1时，Bax蛋白的表达量进一步增加了2.2倍，Bcl-2蛋白的表达量则大幅下降了90%。这些结果表明，Bax和Bcl-2蛋白的表达变化与 CycIr-DHA的浓度相关，即随着药物浓度的增加，促凋亡效应增强。在未添加CycIr-DHA的对照组中(未加药物、DHA以及Ir-NH₂组)，Bcl-2和Bax蛋白的表达水平虽然有所变化，但这些变化与 CycIr-DHA处理组相比，其促进凋亡的效果并不显著(图 6C和6D)。这进一步验证了 CycIr-DHA诱导MCF- 7凋亡的作用机制是通过调节Bax和Bcl-2蛋白的表达来实现的。

  图 6

  

  图 6.  DHA、Ir-NH₂、CycIr-DHA诱导MCF-7凋亡：(A) 流式细胞仪检测结果; (B) 细胞凋亡的定量分析; (C) WB分析; (D) Bcl-2、Bax蛋白定量柱状图

  0: control; 1: DHA (5 μmol·L^-1); 2: Ir-NH₂ (5 μmol·L^-1); 3: CycIr-DHA (2.5 μmol·L^-1); 4: CycIr-DHA (5 μmol·L^-1).

  Figure 6.  Apoptosis in MCF-7 induced by DHA, Ir-NH₂, and CycIr-DHA: (A) flow cytometry diagrams; (B) quantitative analysis of cell apoptosis; (C) WB analysis; (D) quantitative histogram of Bcl-2 and Bax protein

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  自噬是细胞的一种自然死亡机制，其中LC3-Ⅱ作为自噬过程中的关键蛋白，由LC3-Ⅰ通过一系列修饰转化而来，是评估自噬活性的重要指标^[28]。文献表明环金属铱表现出可诱导肿瘤细胞自噬的能力^[29]，我们通过CLSM和WB技术研究了配合物 CycIr-DHA诱导自噬的效果。图 7A展示了经5 μmol·L^-1 CycIr-DHA处理细胞24 h后，细胞内出现显著绿色荧光，表明自噬小体的形成。而对照化合物DHA与Ir-NH₂处理细胞后并没有产生自噬小体，这一结果证实了 CycIr-DHA具有诱导细胞自噬的能力。进一步地，我们利用WB技术定量分析了LC3蛋白的表达变化。如图 7B和7C所示，随着 CycIr-DHA浓度的增加，LC3-Ⅰ蛋白表达水平下降，而LC3-Ⅱ蛋白表达上升，这表明CycIr-DHA能够有效地促进自噬过程并呈现浓度依赖的趋势。这一结果进一步证实了 CycIr-DHA能够触发MCF-7的自噬过程，可能是其诱导癌细胞死亡的一个重要机制。

  图 7

  

  图 7.  (A) CycIr-DHA诱导MCF-7产生自噬小体; (B) LC3蛋白免疫印迹分析; (C) LC3蛋白表达量柱状图

  0: control; 1: DHA (5 μmol·L^-1); 2: Ir-NH₂ (5 μmol·L^-1); 3: CycIr-DHA (2.5 μmol·L^-1); 4: CycIr-DHA (5 μmol·L^-1).

  Figure 7.  (A) Autophagosome production in MCF-7 induced by CycIr-DHA; (B) LC3 protein immunoblotting analysis; (C) LC3 protein expression histogram

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  2.7   配合物诱导3D细胞球死亡性能

  为了评估 CycIr-DHA对实体瘤生长的抑制作用，我们采用了一种来源于MCF-7的3D细胞球模型来模拟实体瘤中的肿瘤微环境。在5 d的观察期内，未加药物对照组处理的肿瘤球体随时间的延长细胞球体积增大，从580到1 392 μm，呈约为2.4倍的增加趋势。另外2个对照组(DHA和 Ir-NH₂)在处理后也表现出类似的趋势，细胞球体的大小分别增加约1.7和1.4倍。与对照组相比，经过CycIr-DHA处理的肿瘤细胞球体积出现了明显的减小，其直径由580 μm降低至260 μm，减少了大约55%(图 8A和8B)。这一结果表明，CycIr-DHA对3D细胞球体的生长具有明显的抑制效果。进一步地，通过活死染色实验验证了 CycIr-DHA可以诱导3D细胞球死亡。如图 8C所示，对照组(未加药物组、DHA组和 Ir-NH₂组)的细胞显示出绿色荧光，细胞膜未受损害，细胞处于存活状态。与此相对，经 CycIr-DHA处理的肿瘤球体则表现出明显的红色荧光，这表明细胞功能受损，已经死亡。这种荧光颜色从绿色转变为红色的现象，表明CycIr-DHA可抑制细胞球增殖，并诱导细胞球死亡。

  图 8

  

  图 8.  (A) 用DHA、Ir-NH₂、CycIr-DHA处理5 d后的3D肿瘤细胞球图像; (B) MCF-7的3D细胞球体积随时间的变化; (C) 5 d后用Calcein AM/PI染色肿瘤细胞球中活/死细胞的CLSM图

  (B) MCTCs: multicellular tumor spheroids; (C) Calcein AM: λ_ex=488 nm, λ_em=500~550 nm.

  Figure 8.  (A) 3D tumor cell spheroid images after treatment with DHA, Ir-NH₂, and CycIr-DHA for 5 d; (B) 3D cell sphere volume change of MCF-7 over time; (C) CLSM images of live/dead cells in tumor cell spheres stained with Calcein AM/PI after 5 d

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  3.   结论

  通过在环金属铱中引入天然产物DHA成功合成了金属配合物 CycIr-DHA。CycIr-DHA对多种肿瘤细胞株MCF - 7、A549、A2780均表现出优于CDDP的抗肿瘤活性。其中对MCF-7杀伤抑制作用最强，IC₅₀值约为2.5 μmol·L^-1。共聚焦成像结果显示配合物 CycIr-DHA主要富集在线粒体，可诱导MCF-7产生氧化应激，导致线粒体功能损伤。此外，配合物CycIr-DHA还诱导肿瘤细胞的晚期凋亡，可调节凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达，同时上调自噬蛋白LC3-Ⅱ，促进细胞的自噬。多种死亡机制的叠加使得配合物不同于CDDP的抗肿瘤作用机制，并且表现出优于CDDP的抗肿瘤活性。此外，CycIr-DHA显著抑制3D细胞球体的生长，显示出优异的肿瘤治疗潜力。本研究为新型金属药物的开发提供了新的设计思路。

  
  Supporting information is available at http://www.wjhxxb.cn
  
• 1. [1]

     XIONG X L, LIU L Y, MAO Z W, ZOU T T. Approaches towards understanding the mechanism-of-action of metallodrugs[J]. Coord. Chem. Rev., 2022, 453:  214311.

  2. [2]

     GHOSH S. Cisplatin: The first metal based anticancer drug[J]. Bioorganic Chem., 2019, 88:  102925.

  3. [3]

     YANG J, WANG M M, DENG D P, LIN H, SU Y, SHAO C X, LI S H, YU Z H, LIU H K, SU Z. Consolidating organometallic complex Ir-CA empowers mitochondria-directed chemotherapy against resistant cancer via stemness and metastasis inhibition[J]. Inorg. Chem., 2024, 63(11):  5235-5245.

  4. [4]

     WANG Z G, XU Z F, ZHU G Y. A platinum(Ⅳ) anticancer prodrug targeting nucleotide excision repair to overcome cisplatin resistance[J]. Angew. Chem.-Int. Edit., 2016, 55(50):  15564-15568.

  5. [5]

     WU Y P, LI S M, CHEN Y C, HE W J, GUO Z J. Recent advances in noble metal complex based photodynamic therapy[J]. Chem. Sci., 2022, 13(18):  5085-5106.

  6. [6]

     GU Y Q, YANG K, YANG Q Y, LI H Q, HU M Q, MA M X, CHEN N F, LIU Y H, LIANG H, CHEN Z F. Rhodium (Ⅲ) -picolinamide complexes act as anticancer and antimetastasis agents via inducing apoptosis and autophagy[J]. J. Med. Chem., 2023, 66(14):  9592-9606.

  7. [7]

     SU X X, WANG W J, CAO Q, ZHANG H, LIU B, LING Y Y, ZHOU X T, MAO Z W. A carbonic anhydrase Ⅸ (CAIX)- anchored rhenium (Ⅰ) photosensitizer evokes pyroptosis for enhanced anti-tumor immunity[J]. Angew. Chem.-Int. Edit., 2022, 61(8):  e202115800.

  8. [8]

     XUE X L, FU Y, HE L, SALASSA L, HE L F, HAO Y Y, KOH M J, SOULIÉ C, NEEDHAM R J, HABTEMARIAM A, GARINO C, LOMACHENKO K A, SU Z, QIAN Y, PATERSON M J, MAO Z W, LIU H K, SADLER P J. Photoactivated osmium arene anticancer complexes[J]. Inorg. Chem., 2021, 60(23):  17450-17461.

  9. [9]

     ZAMORA A, VIGUERAS G, RODRíGUEZ V, SANTANA M D, RUIZ J. Cyclometalated iridium (Ⅲ) luminescent complexes in therapy and phototherapy[J]. Coord. Chem. Rev., 2018, 360:  34-76.

  10. [10]

      李世杰, 钱晓婷, 黄元镭, 薛旭玲, 钱勇, 苏志, 刘红科. 齐墩果酸- 环金属铱配合物的点击化学合成及抗肿瘤性能[J]. 无机化学学报, 2023,39,(2): 317-326. doi: 10.11862/CJIC.2022.289LI S J, QIAN X T, HUANG Y L, XUE X L, QIAN Y, SU Z, LIU H K. Click-chemistry synthesis and antitumor properties of cyclometalated iridium (Ⅲ) complex based on oleanolic acid[J]. Chinese J. Inorg. Chem., 2023, 39(2):  317-326. doi: 10.11862/CJIC.2022.289

  11. [11]

      LIU L, CHEN J, WANG M M, HUANG Y L, QIAN Y, XUE X L, SU Z, LIU H K. The cyclometalated iridium (Ⅲ) complex based on 9-Anthracenecarboxylic acid as a lysosomal-targeted anticancer agent[J]. J. Inorg. Biochem., 2022, 235:  111913.

  12. [12]

      WANG M M, XU F J, SU Y, GENG Y, QIAN X T, XUE X L, KONG Y Q, YU Z H, LIU H K, SU Z. A new strategy to fight metallodrug resistance: Mitochondria-relevant treatment through mitophagy to inhibit metabolic adaptations of cancer cells[J]. Angew. Chem.-Int. Edit., 2022, 61(27):  e202203843.

  13. [13]

      ZENG Y L, LIU L Y, MA T Z, LIU Y, LIU B, LIU W T, SHEN Q H, WU C, MAO Z W. Iridium (Ⅲ) photosensitizers induce simultaneous pyroptosis and ferroptosis for multi-network synergistic tumor immunotherapy[J]. Angew. Chem.-Int. Edit., 2024, 63(49):  e202410803.

  14. [14]

      LI J, CHEN H M, ZENG L L, REES T W, XIONG K, CHEN Y, JI L N, CHAO H. Mitochondria-targeting cyclometalated iridium(Ⅲ) complexes for tumor hypoxic imaging and therapy[J]. Inorg. Chem. Front., 2019, 6(4):  1003-1010.

  15. [15]

      LV M D, QIAN X T, LI S J, GONG J, WANG Q, QIAN Y, SU Z, XUE X L, LIU H K. Unlocking the potential of iridium and ruthenium arene complexes as anti-tumor and anti-metastasis chemotherapeutic agents[J]. J. Inorg. Biochem., 2023, 238:  112057.

  16. [16]

      陶钦, 吴健, 葛超, 王萌萌, 吕梦迪, 薛旭玲, 刘红科. 反式阿魏酸钌配合物的合成、表征、荧光光谱及其与DNA/蛋白作用[J]. 无机化学学报, 2020,36,(10): 1853-1864. TAO Q, WU J, GE C, WANG M M, LÜ M D, XUE X L, LIU H K. Synthesis, characterization, fluorescence and interactions with DNA/BSA properties of ruthenium ferulate complexes[J]. Chinese J. Inorg. Chem., 2020, 36(10):  1853-1864.

  17. [17]

      LIU L, KONG Y Q, HE L, WANG X X, WANG M M, XU H J, YANG C G, SU Z, ZHAO J, MAO Z W, HUANG Y, LIU H K. A rhein-based Rh(Ⅲ) arene complex with anti-tumor cell proliferative activity inhibits RNA demethylase FTO[J]. Chin. J. Chem., 2022, 40(10):  1156-1164.

  18. [18]

      WANG M M, XUE X L, SHENG X X, SU Y, KONG Y Q, QIAN Y, BAO J C, SU Z, LIU H K. Unveiling the anti-cancer mechanism for half-sandwich and cyclometalated Ir(Ⅲ)-based complexes with functionalized α-lipoic acid[J]. RSC Adv., 2020, 10(9):  5392-5398.

  19. [19]

      LI F Y, WANG X, DUAN W G, LIN G S. Synthesis and in vitro anticancer activity of novel dehydroabietic acid-based acylhydrazones[J]. Molecules, 2017, 22(7):  1087.

  20. [20]

      LV M D, ZHENG Y, WU J, SHEN Z Q, GUO B L, HU G J, HUANG Y L, ZHAO J Y, QIAN Y, SU Z, WU C, XUE X L, LIU H K, MAO Z W. Evoking ferroptosis by synergistic enhancement of a cyclopentadienyl iridium-betulin immune agonist[J]. Angew. Chem.-Int. Edit., 2023, 62(48):  e202312897.

  21. [21]

      LV M D, ZHENG Y, DAI X Y, ZHAO J Y, HU G J, REN M, SHEN Z Q, SU Z, WU C, LIU H K, XUE X L, MAO Z W. Ruthenium(Ⅱ)- arene complex triggers immunogenic ferroptosis for reversing drug resistance[J]. J. Med. Chem., 2024, 67(22):  20156-20171.

  22. [22]

      ZHOU J, LI J L, ZHANG K Y, LIU S J, ZHAO Q. Phosphorescent iridium(Ⅲ) complexes as lifetime-based biological sensors for photoluminescence lifetime imaging microscopy[J]. Coord. Chem. Rev., 2022, 453:  214334.

  23. [23]

      LIAO K Y, HSU C W, CHI Y, HSU M K, WU S W, CHANG C H, LIU S H, LEE G H, CHOU P T, HU Y, ROBERTSON N. Pt(Ⅱ) metal complexes tailored with a newly designed spiro-arranged tetradentate ligand; harnessing of charge-transfer phosphorescence and fabrication of sky blue and white OLEDs[J]. Inorg. Chem., 2015, 54(8):  4029-4038.

  24. [24]

      YANG X L, XU S P, ZHANG Y, ZHU C Y, CUI L S, ZHOU G J, CHEN Z, SUN Y H. Narrowband pure near-infrared (NIR) Ir(Ⅲ) complexes for solution-processed organic light-emitting diode (OLED) with external quantum efficiency over 16%[J]. Angew. Chem. - Int. Edit., 2023, 62(41):  e202309739.

  25. [25]

      NAYLOR M R, LY A M, HANDFORD M J, RAMOS D P, PYE C R, FURUKAWA A, KLEIN V G, NOLAND R P, EDMONDSON Q, TURMON A C, HEWITT W M, SCHWOCHERT J, TOWNSEND C E, KELLY C N, BLANCO M J, LOKEY R S. Lipophilic permeability efficiency reconciles the opposing roles of lipophilicity in membrane permeability and aqueous solubility[J]. J. Med. Chem., 2018, 61(24):  11169-11182.

  26. [26]

      LI Z, ZOU J H, CHEN X Y. In response to precision medicine: Current subcellular targeting strategies for cancer therapy[J]. Adv. Mater., 2023, 35(21):  2209529.

  27. [27]

      SABHARWAL S S, SCHUMACKER P T. Mitochondrial ROS in cancer: Initiators, amplifiers or an Achilles' heel?[J]. Nat. Rev. Cancer, 2014, 14(11):  709-721.

  28. [28]

      TANIDA I, MINEMATSU-IKEGUCHI N, UENO T, KOMINAMI E. Lysosomal turnover, but not a cellular level, of endogenous LC3 is a marker for autophagy[J]. Autophagy, 2005, 1(2):  84-91.

  29. [29]

      LU Y, WANG S S, LI M Y, LIU R, ZHU M F, YANG L M, WANG F Y, HUANG K B, LIANG H. Cyclometalated iridium (Ⅲ) complex based on isoquinoline alkaloid synergistically elicits the ICD response and IDO inhibition via autophagy-dependent ferroptosis[J]. Acta Pharm. Sin. B, 2024, 15(1):  424-437.

• 

  图 1  配合物CycIr-DHA的合成路线

  Figure 1  Synthetic route for complex CycIr-DHA

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  图 2  Ir-NH₂和CycIr-DHA(10 μmol·L^-1) 在298 K时PBS（含1% DMSO, pH=7.40）中的(A) UV-Vis吸收和(B) 荧光发射谱图; (C) Ir-NH₂和CycIr-DHA的lg P_o/w

  Figure 2  (A) UV-Vis absorption and (B) fluorescence emission spectra of Ir-NH₂ and CycIr-DHA (10 μmol·L^-1) in PBS (containing 1% DMSO, pH=7.40) at 298 K; (C) lg P_o/w of Ir-NH₂ and CycIr-DHA

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  图 3  配合物CycIr-DHA在MCF-7中亚细胞器中的CLSM图

  Figure 3  CLSM images of subcellular organelles of complex CycIr-DHA in MCF-7

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  图 4  (A) Ir-NH₂和CycIr-DHA诱导MCF-7的ROS生成的CLSM图; (B) DHA、Ir-NH₂、CycIr-DHA对MCF-7的ROS生成的流式细胞图及(C) ROS水平表达量变化柱状图

  Figure 4  (A) CLSM images of ROS generation in MCF-7 induced by Ir-NH₂ and CycIr-DHA; (B) ROS generation by flow cytometry and (C) histogram of ROS expression changes in MCF-7 induced by DHA, Ir-NH₂, and CycIr-DHA

  0: control; 1: DHA (5 μmol·L^-1); 2: Ir-NH₂ (5 μmol·L^-1); 3: CycIr-DHA (2.5 μmol·L^-1); 4: CycIr-DHA (5 μmol·L^-1).

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  图 5  (A) Ir-NH₂、CycIr-DHA对MCF-7的线粒体膜电位变化的CLSM图; (B) 流式细胞仪检测Ir-NH₂、CycIr-DHA对MCF-7的线粒体膜电位变化

  Figure 5  (A) CLSM images of mitochondrial membrane potential changes in MCF-7 by Ir-NH₂ and CycIr-DHA; (B) Changes in mitochondrial membrane potential of MCF-7 treated with Ir-NH₂ and CycIr-DHA by flow cytometry

  0: control; 2: Ir-NH₂ (5 μmol·L^-1); 3: CycIr-DHA (2.5 μmol·L^-1); 4: CycIr-DHA (5 μmol·L^-1).

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  图 6  DHA、Ir-NH₂、CycIr-DHA诱导MCF-7凋亡：(A) 流式细胞仪检测结果; (B) 细胞凋亡的定量分析; (C) WB分析; (D) Bcl-2、Bax蛋白定量柱状图

  Figure 6  Apoptosis in MCF-7 induced by DHA, Ir-NH₂, and CycIr-DHA: (A) flow cytometry diagrams; (B) quantitative analysis of cell apoptosis; (C) WB analysis; (D) quantitative histogram of Bcl-2 and Bax protein

  0: control; 1: DHA (5 μmol·L^-1); 2: Ir-NH₂ (5 μmol·L^-1); 3: CycIr-DHA (2.5 μmol·L^-1); 4: CycIr-DHA (5 μmol·L^-1).

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  图 7  (A) CycIr-DHA诱导MCF-7产生自噬小体; (B) LC3蛋白免疫印迹分析; (C) LC3蛋白表达量柱状图

  Figure 7  (A) Autophagosome production in MCF-7 induced by CycIr-DHA; (B) LC3 protein immunoblotting analysis; (C) LC3 protein expression histogram

  0: control; 1: DHA (5 μmol·L^-1); 2: Ir-NH₂ (5 μmol·L^-1); 3: CycIr-DHA (2.5 μmol·L^-1); 4: CycIr-DHA (5 μmol·L^-1).

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  图 8  (A) 用DHA、Ir-NH₂、CycIr-DHA处理5 d后的3D肿瘤细胞球图像; (B) MCF-7的3D细胞球体积随时间的变化; (C) 5 d后用Calcein AM/PI染色肿瘤细胞球中活/死细胞的CLSM图

  Figure 8  (A) 3D tumor cell spheroid images after treatment with DHA, Ir-NH₂, and CycIr-DHA for 5 d; (B) 3D cell sphere volume change of MCF-7 over time; (C) CLSM images of live/dead cells in tumor cell spheres stained with Calcein AM/PI after 5 d

  (B) MCTCs: multicellular tumor spheroids; (C) Calcein AM: λ_ex=488 nm, λ_em=500~550 nm.

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  表 1  DHA、Ir-NH₂、CycIr-DHA和CDDP对不同细胞株48 h的IC₅₀值

  Table 1.  IC 50 values of DHA, Ir-NH₂, CycIr-DHA, and CDDP on different cell lines for 48 h  μmol·L^-1

  Compound	MCF-7	A549	A2780	HLF
  DHA	80.3±0.8	73.1±1.3	78.3±0.5	> 100
  Ir-NH2	17.8±1.1	15.2±0.3	14.2±0.9	38.4±0.2
  CycIr-DHA	2.5±0.1	5.5±0.1	4.3±0.1	7.3±0.1
  CDDP	8.3±0.1	11.7±0.1	8.6±0.1	7.2±0.1

  下载: 导出CSV
•