English

• 还原型谷胱甘肽(GSH)是生物体内最重要的抗氧化剂之一，并且是细胞内含量最丰富的硫醇(浓度范围：1~15 mmol·L^-1)^[1]。GSH在维持细胞内氧化还原稳态发挥重要的作用^[2-3]。异常的GSH水平与许多疾病有关^[4-7]。因此，发展一种特异性地检测GSH的方法是非常重要的。

  利用荧光技术检测GSH含量已有许多报道^[8-10]，比如GR-DNTB和GSH与邻苯二甲醛的还原反应等。近年来，荧光探针技术具有原位成像、灵敏度高、对生物样品损伤小等优点，已经广泛应用于生物体系中各种分析物的检测^[11-19]。在细胞内，与半胱氨酸(Cys)和同型半胱氨酸(Hcy)相比，GSH是含量最高的生物硫醇。目前已报道了许多基于GSH的化学反应型荧光探针，例如二硫键的裂解反应^[20-21]、亲核加成^[22-23]、迈克尔加成^[24-26]、亲核取代反应^[27-29]等，但是这些反应型荧光探针对GSH检测具有较低的灵敏度和较小的斯托克斯位移等。

  三苯胺具有较强的紫外吸收、可任意调节的荧光发光性能、好的生物相容性等特点^[30-32]。另一方面，三苯胺中的氮原子有一对未键合的电子，这赋予了三苯胺优异的供电子能力，使得含三苯胺的荧光分子具有较高的荧光量子产率^[33]。因此，发展具有三苯胺类基团的荧光探针吸引了众多科研工作者的关注。

  本研究选择分子内电荷转移(ICT)的荧光调控机制，以2, 4-二硝基苯磺酰基作为吸电子基团，通过Knoevenagel缩合反应与三苯胺供电子基团连接，形成共轭体系，使ICT过程发生。因此，我们设计了以三苯胺基团作为供电子基团，2, 4-二硝基苯磺酰基作为反应位点，合成了检测GSH的荧光探针CDAS(图 1)。探针CDAS对GSH具有极低的检测限(7.70 mmol·L^-1)、较大的斯托克斯位移(179 nm)和高选择性。同时，探针CDAS能够用于HeLa细胞中GSH的荧光成像。

  图 1

  

  图 1.  探针CDAS与GSH的可能的反应机理

  Figure 1.  Proposed reaction mechanism of CDAS with GSH

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  1.   实验部分

  1.1   仪器与试剂

  合成反应采用ZNCL-GS10*70数显智能控温磁力搅拌器。核磁共振氢谱和碳谱数据由Bruker AVANCE-500M型核磁共振仪测得。高分辨质谱通过Bruker APEX Ⅱ47e型高分辨质谱仪测得。紫外光谱由UV-2550型紫外可见分光光度计(赛默飞世尔公司)测得。荧光光谱由FS5荧光光谱仪(英国爱丁堡公司)测定。细胞成像在荧光显微镜(徕卡DM 4000B，德国)下拍摄。

  化学试剂购自安耐吉化学剂有限公司，溶剂购自天津欧博凯化工有限公司，200~300目柱层析硅胶来自青岛海洋化工公司。所用试剂均为分析纯，使用时无需进一步的纯化。

  1.2   探针CDAS的制备与表征

  探针CDAS的合成路线见图 2^[34]，其中化合物1、2和CDA的合成步骤见Supporting information。探针分子的合成步骤：称取化合物CDA(1.0 g，2.6 mmol)于反应瓶中，在冰水浴条件下加入二氯甲烷(18 mL)，搅拌溶解，将三乙胺(0.7 mL)加入，再缓慢加入2，4-二硝基苯磺酰氯(1.1 g)，反应5 min后撤去冰水浴，常温搅拌6 h。反应结束后，加水猝灭，搅拌过夜，以二氯甲烷(3×15 mL)萃取，加入稀盐酸、饱和NaHCO₃水溶液和饱和食盐水洗涤至中性，最后用柱色谱分离进行提纯(V_乙酸乙酯∶V_石油醚=1∶10)，得到探针CDAS的黄色粉末状固体(1.42 g，产率为89.3%)。¹H NMR(500 MHz，DMSO-d₆)：δ 9.14(s，1H)，8.65(d，J=5 Hz, 1H)，8.31(d，J=5 Hz, 1H), 7.90~7.77(m，5H)，7.40~7.19(m，6H)，7.18~7.13(m，6H)，6.94(d，J=5 Hz，2H)。¹³C NMR(125 MHz, DMSO-d₆)：δ 151.98, 150.26, 148.62, 146.38, 143.95, 134.86, 134.15, 131.44，130.33，130.26，128.00, 127.88, 126.16, 126.08, 125.26，123.18，121.61，120.16，118.69，104.99。HRMS(m/z)：按C₃₃H₂₂N₄O₇S的计算值619.624 5([M+H]⁺)，实测值619.128 2。具体的核磁和高分辨谱图见Supporting information。探针CDAS的合成路线见图 2。

  图 2

  

  图 2.  探针CDAS的合成路线

  Figure 2.  Synthetic route of probe CDAS

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  1.3   探针CDAS的光谱测试

  用二甲基亚砜(DMSO)溶解探针CDAS配制成10 mmol·L^-1的母液，GSH和各种干扰物用蒸馏水溶解配制成100 mmol·L^-1的母液，测试时再稀释到相应的浓度。干扰实验：在磷酸盐缓冲溶液(PBS)和CH₃CN混合液(体积比1∶1，10 mmol·L^-1，pH=7.4)中，将探针CDAS稀释至5 μmol·L^-1，与各种干扰物质(终浓度为1 mmol·L^-1)共同作用30 min后测定其荧光光谱。激发狭缝和发射狭缝宽度均为3 nm。

  1.4   探针CDAS的细胞成像

  人宫颈癌细胞(HeLa细胞)购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所。HeLa细胞在DMEM培养基中加入10%胎牛血清、100 U·mL^-1青霉素和100 U·mL^-1链霉素，在恒温培养箱中培养。再将HeLa细胞(每孔3×10⁴细胞)接种于6孔培养板中过夜。接着，先用100 μmol·L^-1的GSH预孵化HeLa细胞30 min后，加入探针CDAS(10 μmol·L^-1)再孵化30 min。细胞用PBS洗3次，后用荧光显微镜(徕卡)拍摄。

  2.   结果与讨论

  2.1   探针CDAS对GSH的光谱响应

  首先测试探针CDAS在CH₃CN和PBS(10 mmol·L^-1，pH=7.4)中的荧光光谱。如图S1所示(Supporting information)，在CH₃CN中，探针的荧光发射强度要高于在PBS中。但是由于要应用到细胞环境中，因此选择体积比1∶1、10 mmol·L^-1、pH=7.4的体系进行后续实验。首先测试了探针CDAS对GSH的紫外可见和荧光响应。如图 3所示，单独探针CDAS紫外可见最大吸收波长大约在412 nm，是由于连接了吸电子的2，4-二硝基苯磺酰基，形成一个更好的“推-拉”电子共轭体系，具有更低的能量差。当加入GSH(220 μmol·L^-1)后，探针CDAS与GSH发生亲核取代反应，转化成CDA(图 1)，紫外可见吸收光谱蓝移至382 nm，同时在561 nm处发射荧光，并且伴随着较大的斯托克斯位移(179 nm)。上述实验结果说明探针CDAS可以用于检测GSH。

  图 3

  

  图 3.  在PBS和CH₃CN混合液(体积比1∶1, 10 mmol·L^-1, pH=7.4)中5 μmol·L^-1探针CDAS与GSH反应前后的紫外可见吸收光谱(A)和荧光发射光谱(B)

  Figure 3.  UV-Vis absorption spectra (A) and fluorescent emission spectra (B) of 5 μmol·L^-1 CDAS before and after the reaction with GSH in the mixed solution of PBS and CH₃CN (1∶1, V/V, 10 mmol·L^-1, pH=7.4)

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  2.2   探针CDAS对GSH的检测机理

  探针分子CDAS中的2，4-二硝基苯磺酰基与GSH的巯基发生亲核取代反应，释放出荧光基团CDA，发生了ICT过程(图 4A)。为了证实上述推测的反应机理，采用核磁共振氢谱和高分辨质谱来验证。如图S2所示，探针CDAS与GSH反应后，高分辨质谱出现m/z=387.149 2的峰，归属于CDA([M-H]^-)。同时，如图 4B所示，与探针本身的核磁氢谱对比，GSH和探针反应后出现的羟基氢应归属于荧光分子CDA。这个结果进一步表明探针CDAS与GSH发生亲核取代反应，释放出CDA，使得荧光强度增强。以上结果与预期的设想一致(图 1)。

  图 4

  

  图 4.  (A) 探针CDAS识别GSH的机理; (B) 探针CDAS与GSH反应前后的核磁共振氢谱图

  Figure 4.  (A) Mechanism of GSH recognition by probe CDAS; (B) ¹H NMR spectra of probe CDAS before and after the reaction with GSH

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  2.3   探针CDAS对GSH的灵敏性和响应时间

  接着测试探针CDAS对GSH的检测限(LOD)。根据之前有关计算探针对GSH的LOD的文献报道^[24-26]，以探针CDAS的荧光强度对GSH浓度作图，在20~80 μmol·L^-1范围内两者呈良好的线性关系(图 5A)，且其相关系数R²=0.992。通过LOD=3σ/k计算(σ为标准差，k为斜率)，探针CDAS对GSH的LOD为7.70 μmol·L^-1。同时，由于GSH在细胞内含量的浓度范围为1~15 mmol·L^{-1 [1]}，故探究探针CDAS对高浓度GSH的响应。如图 5B所示，当GSH浓度在1~15 mmol·L^-1之间时，探针CDAS的荧光强度基本保持不变，进一步说明探针CDAS在GSH浓度为220 μmol·L^-1时反应已经达到最大限度。此外，测试了探针CDAS对GSH的荧光响应时间，当加入220 μmol·L^-1 GSH后，荧光强度大约在60 s达到最大值(图 5C)，说明探针CDAS可以较快地检测GSH。以上结果表明探针CDAS能够灵敏、快速地检测GSH。

  图 5

  

  图 5.  (A) 探针CDAS的荧光强度与GSH浓度的线性关系; (B) CDAS对高浓度GSH的荧光响应; (C) CDAS (5 μmol·L^-1)加入GSH后的响应时间

  Figure 5.  (A) Linear relationship between the fluorescent intensity of probe CDAS and GSH concentration; (B) Fluorescent response of CDAS towards high concentration of GSH; (C) Response time of CDAS (5 μmol·L^-1) upon the addition of GSH

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  2.4   探针CDAS对GSH的选择性和pH适应性

  为了证实探针CDAS对GSH的选择性，选择相关生物硫醇(GSH、Cys、Hcy)、各种氨基酸[赖氨酸(Lys)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、精氨酸(Arg)、谷氨酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)]、阴离子(Cl^-、CO₃^2-、SO₃^2-、SO₄^2-、NO₃^-)和阳离子(Zn²⁺、Cu²⁺、Na⁺)进行检测实验。如图 6A所示，只有加入生物硫醇GSH、Cys和Hcy会导致荧光强度的变化，而其他氨基酸、阴离子和阳离子不能引起任何荧光变化。其中，探针CDAS对GSH的反应活性最高。接下来，研究探针CDAS在pH=5~10范围内对GSH的响应。如图 6B所示，探针CDAS在pH=5~10的范围内具有稳定性，荧光强度基本不变。加入GSH后，荧光强度在pH=7.0时最高，说明探针CDAS在生理条件下能够检测GSH。

  图 6

  

  图 6.  (A) 探针CDAS对GSH的选择性(c_GSH=220 μmol·L^-1, 其余分析物浓度为1 mmol·L^-1); (B) 探针CDAS在不同pH条件下对GSH的响应

  Figure 6.  (A) Selectivity of CDAS (5 μmol·L^-1) to GSH (c_GSH=220 μmol·L^-1, the concentrations of other analytes were 1 mmol·L^-1); (B) Response of probe CDAS (5 μmol·L^-1) to GSH under different pH conditions

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  2.5   探针CDAS在HeLa细胞检测GSH生物成像中的应用

  最后，探究CDAS在HeLa细胞中检测GSH成像的应用。首先，测定不同浓度的探针CDAS影响处理HeLa细胞24 h后细胞存活率的变化(图S3)，选择探针对细胞存活率大于90%的浓度10 μmol·L^-1用于细胞成像。如图 7A所示，由于细胞内GSH的含量较高，探针组有较弱的绿光。当加入GSH(220 μmol·L^-1)后，探针分子中的2，4-二硝基苯磺酰基与GSH的巯基发生亲核取代反应后释放出荧光分子CDA，ICT过程发生，呈现强的绿色荧光。同时，当细胞用NEM(一种硫醇捕获试剂)预处理后^[26]，再加入GSH和探针，再次观察到较强的绿色荧光。上述结果说明，探针CDAS可以用于HeLa细胞中内源性的GSH荧光成像。

  图 7

  

  图 7.  (A) 探针CDAS孵化HeLa细胞中GSH的荧光图像; (B) 利用ImageJ软件根据图A计算荧光强度

  Figure 7.  (A) Fluorescent images of GSH in HeLa cells incubated with probe CDAS; (B) Fluorescence intensities calculated from panel A using ImageJ software

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  3.   结论

  本文报道了一种基于ICT识别机理，以三苯胺为供电子基团、2，4-二硝基苯磺酰基为吸电子基团和响应基团检测GSH的荧光探针CDAS。探针CDAS能够特异性地检测GSH，而其他生物硫醇、氨基酸、阴离子和阳离子对其没有干扰。另外，探针CDAS对GSH的灵敏度较高，最低检测限为7.70 μmol·L^-1，CDAS对GSH有较大的斯托克斯位移和较快的响应时间。最后，探针CDAS能够用于HeLa细胞中GSH成像。

  
  Supporting information is available at http://www.wjhxxb.cn
  
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  图 1  探针CDAS与GSH的可能的反应机理

  Figure 1  Proposed reaction mechanism of CDAS with GSH

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  图 2  探针CDAS的合成路线

  Figure 2  Synthetic route of probe CDAS

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  图 3  在PBS和CH₃CN混合液(体积比1∶1, 10 mmol·L^-1, pH=7.4)中5 μmol·L^-1探针CDAS与GSH反应前后的紫外可见吸收光谱(A)和荧光发射光谱(B)

  Figure 3  UV-Vis absorption spectra (A) and fluorescent emission spectra (B) of 5 μmol·L^-1 CDAS before and after the reaction with GSH in the mixed solution of PBS and CH₃CN (1∶1, V/V, 10 mmol·L^-1, pH=7.4)

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  图 4  (A) 探针CDAS识别GSH的机理; (B) 探针CDAS与GSH反应前后的核磁共振氢谱图

  Figure 4  (A) Mechanism of GSH recognition by probe CDAS; (B) ¹H NMR spectra of probe CDAS before and after the reaction with GSH

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  图 5  (A) 探针CDAS的荧光强度与GSH浓度的线性关系; (B) CDAS对高浓度GSH的荧光响应; (C) CDAS (5 μmol·L^-1)加入GSH后的响应时间

  Figure 5  (A) Linear relationship between the fluorescent intensity of probe CDAS and GSH concentration; (B) Fluorescent response of CDAS towards high concentration of GSH; (C) Response time of CDAS (5 μmol·L^-1) upon the addition of GSH

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  图 6  (A) 探针CDAS对GSH的选择性(c_GSH=220 μmol·L^-1, 其余分析物浓度为1 mmol·L^-1); (B) 探针CDAS在不同pH条件下对GSH的响应

  Figure 6  (A) Selectivity of CDAS (5 μmol·L^-1) to GSH (c_GSH=220 μmol·L^-1, the concentrations of other analytes were 1 mmol·L^-1); (B) Response of probe CDAS (5 μmol·L^-1) to GSH under different pH conditions

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  图 7  (A) 探针CDAS孵化HeLa细胞中GSH的荧光图像; (B) 利用ImageJ软件根据图A计算荧光强度

  Figure 7  (A) Fluorescent images of GSH in HeLa cells incubated with probe CDAS; (B) Fluorescence intensities calculated from panel A using ImageJ software

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