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• 神经退行性疾病如阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)、帕金森病(Parkinson′s disease，PD)、克罗伊茨费尔特-雅各布病(Creutzfeldt Jakob disease，CJD)和肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)，都是由神经元细胞群的逐渐丧失、蛋白质聚集和氧化应激所引发的^[1-2]。淀粉样蛋白级联假说一直都是解释AD病因的主导理论，即β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)聚合形成的Aβ斑块或可溶性Aβ寡聚体会产生神经毒性，导致神经细胞凋亡^[3-7]。

  研究发现，在AD患者大脑淀粉样斑块中，有超出寻常量的金属铜、铁和锌的存在^[8-10]。AD患者大脑中铜、铁、锌的含量是同年龄对照组大脑的3~5倍^[11-12]。Fenton反应过程所涉及的氧化还原活性金属离子(如Cu^Ⅰ/Cu^Ⅱ、Fe^Ⅱ/Fe^Ⅲ)可能与受损细胞能量代谢有协同作用，催化氧气生成活性氧(reactive oxygen species，ROS)^[13-17]，导致氧化应激，这也是与年龄相关的神经退行性疾病的主要特征之一。体外实验表明，金属铜、锌离子能加速Aβ聚集，而Cu²⁺不仅会加快Aβ聚集，还会通过交联和氧化来改变Aβ。Cu²⁺和Fe³⁺在氧气存在下，会催化产生H₂O₂等ROS，增强Aβ的神经毒性，加速神经细胞凋亡。

  越来越多的证据表明，金属离子内稳态失衡在AD病理生理学中起着重要作用，这使得金属螯合疗法成为一种具有前景的治疗AD的策略^[18-22]。通过配体设计来提高金属螯合剂的靶向性和疗效，设计合成具有抗氧化性、靶向性的多功能螯合剂是治疗AD领域中人们感兴趣的课题之一^[23-27]。

  葡萄糖修饰药物分子后形成的新衍生物能提高药物分子的水溶性，减少药物分子的毒性，并改善其靶向性。人体大脑需要消耗大量的葡萄糖来维持身体正常功能(达到全身葡萄糖消耗量的30%)^[28]，这一需求由血脑屏障(blood brain barrier，BBB)中的葡萄糖转运蛋白(glucose transporter，GLUT)来满足。尽管有些选择性较强的GLUT(如GLUT 1)不能很好完成对葡萄糖修饰的药物分子的转运，然而BBB中有些选择性较差的GLUT(如GLUT 3和GLUT 4)则能完成对葡萄糖修饰的药物分子的转运，使葡萄糖修饰的药物分子顺利到达脑部，达到靶向药物的目的^[29]。作为我们继续研究金属螯合剂治疗AD^[30-32]的一部分，这里我们报道葡萄糖修饰的双席夫碱(统称H₂GL，如图 1所示)的合成以及它们抑制金属离子诱导的Aβ聚集、降低ROS的水平和缓解Aβ聚集产生的细胞毒性等生物活性。

  图 1

  

  图 1.  葡萄糖修饰的双席夫碱的结构

  Figure 1.  Structure of glucose-modified bis-Schiff bases

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  1.   实验部分

  1.1   仪器与试剂

  所有试剂与溶剂都是从试剂公司购买，如未特别指明，使用前所有试剂都未进行特别处理。不含葡萄糖的相同结构的双席夫碱(H₂L1、H₂L2、H₂L3)按文献方法^[33-35]合成。反应进程由薄层层析(TLC)监控，斑点用紫外灯显色或用5%硫酸甲醇溶液浸湿后加热显色。反应产物的核磁共振谱由Adilent ProPulse 600 MHz核磁共振仪(TMS为内标)测定。ESI质谱由Q-TOF Ultima API LC-MS液-质联用仪分析确定。采用Flashsmart元素分析仪测定配合物中碳、氢、氮含量。配合物中金属含量由ZA3300型原子吸收光谱测定。用NaH₂PO₄和Na₂HPO₄配制pH=6.6的缓冲液。用二次去离子水配制1.003×10^-5 mol·L^-1的H₂GL的水溶液储备液1 000 mL。用CuSO₄·5H₂O和ZnSO₄·7H₂O与二次去离子水分别配制1.003×10^-5 mol·L^-1的Cu²⁺和Zn²⁺的水溶液储备液1 000 mL。用二次去离子水配制1 mol·L^-1的NaNO₃溶液。

  Aβ储备液制备：将2 mg Aβ_1~40(人)溶于氢氧化钠(500 μL，20 mmol·L^-1)，经超声处理30 s后，用超纯水(1500 mL)稀释，再超声处理30 s后，用0.1 mol·L^-1的盐酸调pH到7.4，用0.22 μm的滤器(Millipore)过滤，由BCA蛋白试验测定Aβ储备液浓度后，将其置于-20 ℃下保存。Zn²⁺和Cu²⁺[200 μmol·L^-1于pH=7.4的HEPES(2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid)缓冲液中]溶液分别用Aldrich原子吸收标准溶液配制。螯合剂H₂GL1、H₂GL2和H₂GL3分别溶于超纯水中配成最终浓度为4 mmol·L^-1的溶液。实验所用水均为蒸馏去离子水并用超滤膜过滤所得。实验用大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞[PC12细胞，该细胞对神经生长因子(NGF)有可逆的神经元显形反应]由重庆工商大学食品科学与工程学院制药工程实验室提供。荧光光谱用瑞典生产的TECAN多功能酶标仪(λ_ex=530 nm，λ_em=590 nm)测得。

  1.2   合成

  合成路线如Scheme 1所示。

  Scheme1

  

  Scheme1.  Synthesis of glucose-modified bis-Schiff bases

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  1.2.1   化合物2的合成

  将葡萄糖(20 g，0.11 mol)、醋酸酐(65 mL，0.64 mol)、高氯酸(十几滴)全部加入250 mL圆底烧瓶中，常温搅拌至葡糖糖全部溶解为止(30 min以上)。然后将乙酰溴(25 mL，0.33 mol)加入圆底烧瓶中搅拌几分钟，再加入甲醇(16 mL)在常温下进行搅拌，TLC(V_乙酸乙酯∶V_石油醚=1∶2)监测反应是否完全(反应时间约为2 h)。反应结束后，将反应混合液倒入500 mL冰水中，搅拌下升至室温。用二氯甲烷萃取(250 mL×3)，合并有机相，有机相用饱和碳酸氢钠溶液洗3次，再用饱和食盐水洗1次，经无水硫酸钠干燥后，蒸发除去二氯甲烷，得粗产品，粗产品经硅胶柱色谱(V_乙酸乙酯∶V_石油醚=1∶3)纯化。得到白色固体产物41 g(79%)。

  1.2.2   化合物4的合成

  在化合物2(24.66 g，0.06 mol)、3(5.52 g，0.04 mol)、四丁基溴化铵(1.29 g，4 mmol)的混合物中加入40 mL四氢呋喃，使其溶解，再加入5%的氢氧化钠溶液(144 mL)。采用文献^[36]的反应装置，将反应混合物置于微波反应器中，在70 W、60 ℃下微波辐射反应15 min。将反应混合物倒入冰水中，有大量白色固体产生。过滤，用水将滤饼洗至中性，晾干得粗产物，粗产物经硅胶柱色谱(V_乙酸乙酯∶V_石油醚=1∶3)纯化得白色产物14 g(75%)。¹H NMR(600 MHz，DMSO-d₆)：δ 13.82(s，br，1H，ArOH)，9.01(s，1H，CHO)，7.30(d，J=8.4 Hz，1H)，6.42~6.38(m，2H)，5.58(d，J=7.8 Hz，1H)，5.36(t，J=10.2 Hz，1H)，5.02(dd，J=8.4，1.2 Hz，1H)，4.95(t，J=9.6 Hz，1H)，4.27~4.22(m，1H)，4.15(dd，J=6.0，6.6 Hz，1H)，4.03(d，J=10.2 Hz，1H)，1.98(s, 1H)，1.974(s，1H)，1.969(s，1H)，1.94(s，1H)。¹³C NMR(150 MHz，DMSO-d₆)：δ 192.4，170.4，169.8，166.4，164.8，160.2，133.7，114.1，107.5，104.0，96.8，72.3，71.1，68.5，62.7，20.7。ESI-HRMS(m/z)：C₂₁H₂₄O₁₂Na([M+Na]⁺)计算值491.116 5，实验值491.118 6。

  1.2.3   葡萄糖修饰的双席夫碱的合成

  将化合物4(2 mmol)溶于适量的无水乙醇中，再加入相应的二胺(1 mmol)，室温搅拌至有固体析出后，继续搅拌3 h。将反应混合物放入冰箱冷藏室静止过夜，过滤，滤饼用冷乙醇(-18 ℃)洗涤3次，晾干后得产品。

  化合物6a：¹H NMR(600 MHz，DMSO-d₆)：δ 13.82(s，br，2H，ArOH)，8.45(s，2H，CH=N)，7.30(d，J=9.0 Hz，2H)，6.42~6.37(m，4H)，5.58(d，J=8.4 Hz，2H)，5.36(t，J=9.9 Hz，2H)，5.02(dd，J=8.4，9.6 Hz，2H)，4.95(t，J=9.9 Hz，2H)，4.27~4.22(m，2H)，4.15(dd，J=6.0，12.0 Hz，2H)，4.03(d，J=10.8 Hz，2H)，3.87~3.79(m，4H)，1.98(s，6H)，1.974(s，6H)，1.969(s，6H)，1.94(s, 6H)。¹³C NMR(150 MHz，DMSO-d₆)：δ 170.4，170.0, 169.8，169.5，166.5，164.8，133.7，114.1，107.5，103.9, 96.8，72.3，71.3，71.0，68.5，62.1，57.9，20.8，20.74，20.72。ESI-HRMS(m/z)：C₄₄H₅₂N₂O₂₂Na([M+Na]⁺)计算值983.290 9，实验值983.295 1。

  化合物6b：¹H NMR(600 MHz，DMSO-d₆)：δ 13.96(s, br, 2H, ArOH), 8.45(s, 2H，CH=N)，7.31(d，J=8.4 Hz，2H)，6.43~6.37(m，4H)，5.59(d，J=8.4 Hz，2H)，5.38(t，J=9.9 Hz，2H)，5.03(dd，J=8.4，9.6 Hz，2H)，4.96(t，J=9.9 Hz, 2H), 4.29~4.23(m, 2H)，4.16(dd，J=6.0，12.0 Hz，2H)，4.04(d，J=10.8 Hz，2H)，3.60(m，4H)，2.00(s，6H)，1.99(s，6H)，1.98(s，6H)，1.97~1.92(m，8H)。¹³C NMR(150 MHz, DMSO-d₆)：δ 170.4, 170.0, 169.8, 169.5, 165.8, 165.2，160.2，133.7，114.1，107.4，104.0，96.8，72.3，71.3，71.1，68.5，62.1，54.9，31.8，20.9，20.8，20.75，20.2。ESI-HRMS(m/z)：C₄₅H₅₄N₂O₂₂Na([M+Na]⁺)计算值997.306 6，实验值997.303 4。

  化合物6c：¹H NMR(600 MHz，DMSO-d₆)：δ 13.99(s，br，3H，ArOH，NH)，8.35(s，2H，CH=N)，7.22(d，J=8.4 Hz，2H)，6.36(s，2H)，6.30(dd，J=8.4，10.4 Hz，2H)，5.58(d，J=8.4 Hz，2H)，5.38(t，J=9.9 Hz，2H)，5.02(t，J=8.4 Hz，2H)，4.95(t，J=9.9 Hz，2H)，4.28~4.22(m，2H)，4.16(dd，J=6.0，12.6 Hz，2H)，4.03(d，J=10.8 Hz，2H)，3.55(s，4H)，2.79(s，4H)，1.99(s，6H，1.986(s，6H)，1.98(s，6H)，1.94(s，6H)。¹³C NMR(150 MHz，DMSO-d₆)：δ 170.4, 170.0，169.8，169.5，166.5，164.8，133.7，114.1，107.5, 103.9, 96.8, 72.3, 71.3, 71.0, 68.5, 62.1，57.9，20.8，20.74，20.72。ESI-HRMS(m/z)：C₄₆H₅₇N₃O₂₂Na([M+Na]⁺)计算值1 026.333 1，实验值1 026.336 9。

  将合成的6a(或6b或6c)溶于适量的无水甲醇中，加入甲醇钠，室温下搅拌过夜至所有乙酰基被脱除(LC-MS监测)，加入IR-120(H⁺)凝胶中和。过滤，去除凝胶，蒸出甲醇后，用凝胶(G15)柱色谱纯化后得相应的葡萄糖修饰的双席夫碱。

  席夫碱H₂GL1：¹H NMR(600 MHz，DMSO-d₆)：δ 13.73(s，br，2H，ArOH)，8.43(s，2H，CH=N)，7.27(d，J=8.4 Hz，2H)，6.45(d，J=8.4 Hz，2H)，6.40(s，2H)，5.30(s，br，2H，OH)，5.13(s，br，2H，OH)，5.05(s，br，2H，OH)，4.87(d，J=7.8 Hz，2H)，4.55(s，br，2H，OH)，3.85~3.77(m，4H)，3.65(d，J=12.0 Hz，2H)，3.43(dd，J=5.4，12.0 Hz，2H)，3.24(t，J=8.4 Hz，2H)，3.18(t，J=7.8 Hz，2H)，3.12(t，J=9.3 Hz，2H)。¹³C NMR(150 MHz，DMSO-d₆)：δ 166.4，164.4，161.4，133.4，113.5，107.5，103.9，100.2，77.5，76.9，73.6，70.0，61.0，58.2。ESI-HRMS(m/z)：C₂₈H₃₆N₂O₁₄Na([M+Na]⁺)计算值647.206 4，实验值647.208 8。

  席夫碱H₂GL2：¹H NMR(600 MHz，CD₃OD)：δ 13.89(s，br，2H，ArOH)，8.35(s，2H，CH=N)，7.21(d，J=8.4 Hz，2H)，6.40(dd，J=2.1，8.4 Hz，2H)，6.36(s，2H)，5.33(s，br，2H，OH)，5.18(s，br，2H，OH)，5.08(s，br，2H，OH)，4.86(d，J=7.8 Hz，2H)，4.56(s，br，2H，OH)，3.65(d，J=12.0 Hz，2H)，3.55(s，4H)，3.46(dd，J=5.4，12.0 Hz，2H)，3.25(t，J=9.3 Hz，2H)，3.18(t，J=7.8 Hz，2H)，3.13(t，J=9.0 Hz，2H)，1.80(m，2H)。¹³C NMR(150 MHz，DMSO-d₆)：δ 165.8，164.3，161.6，133.5，113.3, 107.2, 104.1，100.2，77.5，76.9，73.6，70.1，61.1，40.5。ESI-HRMS(m/z)：C₂₉H₃₈N₂O₁₄Na([M+Na]⁺)计算值661.222 1，实验值661.224 7。

  席夫碱H₂GL3：¹H NMR(600 MHz，DMSO-d₆)：δ 8.31(s，2H，CH=N)，7.40(d，J=9.6 Hz，2H)，6.20~6.15(m，4H)，5.02(d，J=7.8 Hz，2H)，3.79(dd，J=2.1，12.0 Hz，2H)，3.61(dd，J=6.0，12.0 Hz，2H)，3.55~3.35(m，8H)，3.41(t，J=7.8 Hz，2H)，3.34(t，J=9.9 Hz，2H)，3.20(s，4H)。¹³C NMR(150 MHz，CD₃OD)：δ 176.4，171.0，164.5, 130.3, 120.8, 107.4, 104.7，98.8，76.1，75.4，72.8，69.3，60.5，57.4，38.0。ESI-HRMS(m/z)：C₃₀H₄₂N₃O₁₄([M+H]⁺)计算值668.266 7，实验值668.269 4。

  1.3   配体螯合金属离子(Cu²⁺、Zn²⁺)性能与配合物组成的简单分析

  三波长分光光度法测配体螯合金属离子(Cu²⁺、Zn²⁺)的性能：取13个50 mL容量瓶中，首先在每个容量瓶中加入5 mL的配体(H₂GL1或H₂GL2)储备液、5 mL的NaNO₃溶液，再分别加入0~5.5 mL(每次增加0.5 mL)及大大过量的硫酸锌储备液，用缓冲液稀释至刻度，在25 ℃恒温池箱中静置1 h后，用分光光度计扫描。H₂GL1或H₂GL2与Cu²⁺的螯合与Zn²⁺的相似，只是配体与Cu²⁺的浓度是后者的十分之一。测试H₂GL3螯合金属离子的性能时考虑了形成双核配合物的情况，将容量瓶增加到26个。

  按文献^[35]方法合成配合物，将所合成的配合物在105 ℃下真空干燥72 h后，用元素分析仪测其C、H、N含量。定量的配合物经浓硫酸与浓硝酸处理后，容量瓶定容，再用原子吸收光谱测金属含量，从而初步确定配合物组成。

  1.4   生物活性测试

  1.4.1   Aβ比浊度测定

  取198 μL的HEPES缓冲溶液(50 mmol·L^-1 HEPES，150 mmol·L^-1 NaCl，pH=7.4)，加入20 μmol·L^-1的Aβ_1~40和40 μmol·L^-1的Zn²⁺或Cu²⁺，在室温下反应5 min后，加入2 μL的H₂GL1、H₂GL2和H₂GL3的储备液，使螯合剂在样品溶液中的浓度为40 μmol·L^-1。在37 ℃条件下孵化24 h，每个样品溶液分别移至96孔板的一个孔中，样品溶液的浊度通过405 nm处的吸光度获得，相同条件下，以Aβ_1~40溶液作对照(Ctrl)，相同实验做3组，以计算误差。

  1.4.2   BCA蛋白分析

  样品的配制方法与1.4.1节中的相同，但Aβ_1~40的浓度为100 μmol·L^-1，金属离子的浓度与Aβ_1~40相同，每个含有Zn²⁺(或Cu²⁺)的样品准备12份。样品溶液在37 ℃下孵化48 h后，从只含Aβ_1~40的样品和含有Zn²⁺或Cu²⁺的样品中取出3份，在14 000 r·min^-1下高速离心20 min。取出上层清液用Micro BCA protein Assay Kit测定蛋白浓度。另外剩下的9份Zn²⁺(或Cu²⁺)的样品分成3组，分别加入与金属等物质的量的螯合剂H₂GL以及氯碘羟喹(cliquinol，CQ)，然后再在37 ℃并不断摇动下孵化24 h，样品在14 000 r·min^-1下高速离心20 min。取出上层清液用Micro BCA protein Assay Kit测定蛋白浓度。相同实验做3组，以计算误差。

  1.4.3   ROS的测定

  ROS的测定由HRP/Amplex Red实验完成。将试剂按以下次序加入到96孔板中，使样品溶液体积为100 μL：0.2 μmol·L^-1 Aβ_1~40、0.2或0.4 μmol·L^-1 Cu²⁺、0.2或0.4 μmol·L^-1螯合剂H₂GL1(或H₂GL2或H₂GL3)、10 μmol·L^-1抗坏血酸，用只含有Aβ_1~40和Cu²⁺的溶液作为对照组。样品在室温下孵化30 min后，向每个孔中加入50 μL新配制的工作液，其中含有0.1 μL的Amplex Red(Sigama-Aldrich)和0.2 U·mL^-1的HRP(Sigama-Aldrich)，继续在室温下孵化30 min，荧光光谱用TECAN多功能酶标仪测定。相同实验做3组以计算误差。

  1.4.4   MTT实验分析细胞毒性

  将PC12细胞加到含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37 ℃、CO₂体积分数5%的培养箱中培养。细胞毒性检测时，将对数生长期的PC12细胞接种于12孔板中，孵化过夜后，将实验分为正常细胞对照组(Ctrl)、Aβ_1~40-M²⁺(Zn²⁺、Cu²⁺)组、Aβ_1~40-M²⁺(Zn²⁺、Cu²⁺)+不同待测螯合剂(H₂GL1、H₂GL2和H₂GL3)组，按照分组，分别加入不同浓度的待测样品(20 μmol·L^-1)、10 μmol·L^-1 Aβ_1~40和20 μmol·L^-1的Cu²⁺，继续孵化48 h后，加入质量浓度为0.5 mg·mL^-1的MTT，在37 ℃孵化2 h。最后去掉上清液，用DMSO在室温下裂解细胞，溶解甲臜盐，然后用酶标仪检测570 nm处吸光度值。

  1.4.5   超氧化物歧化酶活性分析

  按照MTT实验的分组，在PC12细胞中加入不同浓度的待测样品和10 μmol·L^-1 Aβ_1~40和10 μmol·L^-1 CuCl₂，作用24 h后，PC12细胞中的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性分析按照试剂盒说明书操作，最后在450 nm处检测吸光度。通过以下公式计算SOD活性(R_a)：

  $ R_{\mathrm{a}}=\left(A_{\text {control }}-A_{\text {sample }}\right) / A_{\text {control }} \times 100 \%$

  (1)

  其中A_control为对照组吸光度，A_sample为样品吸光度。

  2.   结果与讨论

  2.1   合成

  要得到目标产物，首先要合成葡萄糖修饰的水杨醛。开始，我们用以前我们报道的方法^[37]合成，即用全乙酰基保护的葡萄糖作反应物，在BF₃·Et₂O存在下，于干燥的二氯甲烷中与2，4-二羟基苯甲醛在0 ℃下反应，然而，未得到相应的产物。通过改进文献方法^[38]，在相转移催化剂四丁基溴化铵和5%的NaOH水溶液的条件下，在水溶性溶剂中微波加热至60 ℃，以乙酰基保护的葡萄糖溴代苷(2)为反应物与2，4-二羟基苯甲醛(3)反应10~15 min，得到四乙酰基保护的葡萄糖修饰的水杨醛4。文献^[38]报道的方法是用氯仿作溶剂，但是氯仿毒性极强，且不易分解，对环境危害极大。因此我们改用水溶性溶剂。然而，水溶性溶剂中，NaOH水溶液存在下，长时间加热反应，保护基团乙酰基会被部分脱出，影响产物的分离收率。改用微波辐射促进这样的糖苷化反应，极大地缩短反应时间，从而避免乙酰基部分脱除，提高产物的分离收率。对这2种加热模式的反应，我们作了简单对照，结果见表 1。

  表 1

  

  表 1  常规加热模式和微波加热模式反应结果对比

  Table 1.  Comparison of the reaction results under conventional heating mode and microwave heating mode

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  Entry	Solvent	Heating mode	Time / min	Isolated yield / %
  1	CH3Cl	Conventional	300	72
  2	DMF	Conventional	300	27
  3	DMF	Microwave	15	69
  4	1, 4-Dioxane	Conventional	300	25
  5	1, 4-Dioxane	Microwave	15	64
  6	CH3CN	Conventional	300	26
  7	CH3CN	Microwave	15	68
  8	THF	Conventional	300	30
  9	THF	Microwave	15	75

  表 1的结果显示，在常规加热模式下，在氯仿中反应，产物的收率可达72%，但是在水溶性溶剂中，反应收率不理想，这是因为在水溶性溶剂中，在有水和强碱存在下，长时间加热，会发生皂化反应，脱除乙酰基，我们用LC-MS分析也验证了收率不高的原因。在微波加热模式下，因为反应时间只有15 min，因此，反应收率和在氯仿中常规加热的反应结果相近，在70%左右。

  以四乙酰基保护的葡萄糖修饰的水杨醛与二胺在乙醇中缩合，得到乙酰基保护的葡萄糖修饰的双席夫碱，该化合物在无水甲醇中，NaOCH₃存在下，常温搅拌过夜，顺利脱出保护基，得到葡萄糖修饰的双席夫碱。

  2.2   配体螯合金属性能及配合物组成

  对于配位平衡(略去离子电荷)：

  $ m \mathrm{M}+n \mathrm{H}_2 \mathrm{GL} \rightleftharpoons \mathrm{M}_m\left(\mathrm{H}_2 \mathrm{GL}\right)_n$

  其稳定常数如下式计算：

  $ K=\frac{c_{\mathrm{M}_m\left(\mathrm{H}_2 \mathrm{GL}\right)_n}}{{{c_{\mathrm{M}}}^m c_{\mathrm{H}_2 \mathrm{GL}}}^n} $

  (2)

  依据师同顺等改进的Sanchez法^[39]，在配合物紫外可见光谱图中，选出3个不同波长λ₁、λ₂、λ₃，其吸光度差值ΔA：

  $ \Delta A={A}_{2}-\frac{M{A}_{1}+N{A}_{3}}{M+N} $

  (3)

  其中A₁、A₂、A₃分别为λ₁、λ₂、λ₃对应的吸光度，M=|λ₁-λ₃|，N=|λ₁-λ₂|。依据三波长法原理，可得到线性公式(详细推导方法见文献^[39])：

  $ \lg \frac{1}{c_{\mathrm{M}^{2+}}}=\frac{1}{m} \lg \left(K n b^{n-1}\right)+\frac{n}{m} \lg \left(x^{1 / n}-x^{1 / n-1}\right)$

  (4)

  其中x=ΔA_∞/ΔA，A_∞是配体浓度不变时不断增加金属离子浓度，配合物浓度趋向于一个极限值时的吸光度；b为配体H₂GL的初始浓度。

  在一定的离子强度(0.1 mol·L^-1 NaNO₃)和pH(6.6)条件下，保持配体的浓度不变，逐渐增大金属离子的浓度以至大大过量，测得的紫外可见光谱图如图 2a、2c、S1a、S1c、S2a、S2c(Supporting information)所示。以lg(1/$ {c}_{\mathrm{M}^{2+}} $)对lg(x^1/n-x^1/n-1)作图(图 2b、2d、S1b、S1d、S2b、S2d)并拟合直线方程，从截距可求出稳定常数，结果如下：

  $ \begin{aligned} & \mathrm{Cu}^{2+}+\mathrm{H}_2 \mathrm{GL} 1 \rightleftharpoons\left[\mathrm{Cu}\left(\mathrm{H}_2 \mathrm{GL} 1\right)\right]^{2+} \quad K=2.4 \times 10^{10} ; \mathrm{Zn}^{2+}+\mathrm{H}_2 \mathrm{GL} 1 \rightleftharpoons\left[\mathrm{Zn}\left(\mathrm{H}_2 \mathrm{GL} 1\right)\right]^{2+} \quad K=5.1 \times 10^5 \\ & \mathrm{Cu}^{2+}+\mathrm{H}_2 \mathrm{GL} 2 \rightleftharpoons\left[\mathrm{Cu}\left(\mathrm{H}_2 \mathrm{GL} 2\right)\right]^{2+} \quad K=8.5 \times 10^9 ; \mathrm{Zn}^{2+}+\mathrm{H}_2 \mathrm{GL} 2 \rightleftharpoons\left[\mathrm{Zn}\left(\mathrm{H}_2 \mathrm{GL} 2\right)\right]^{2+} \quad K=3.7 \times 10^5 \\ & \mathrm{Cu}^{2+}+\mathrm{H}_2 \mathrm{GL} 3+\mathrm{H}_2 \mathrm{O} \rightleftharpoons\left[\mathrm{Cu}\left(\mathrm{H}_2 \mathrm{GL} 3\right)\left(\mathrm{H}_2 \mathrm{O}\right)\right]^{2+} \quad K=8.7 \times 10^7 ; \mathrm{Zn}^{2+}+\mathrm{H}_2 \mathrm{GL} 3+\mathrm{H}_2 \mathrm{O} \rightleftharpoons\left[\mathrm{Zn}\left(\mathrm{H}_2 \mathrm{GL} 3\right)\left(\mathrm{H}_2 \mathrm{O}\right)\right]^{2+} \quad K=2.5 \times 10^5 \\ & \mathrm{Cu}^{2+}+\left[\mathrm{Cu}\left(\mathrm{H}_2 \mathrm{GL} 3\right)\left(\mathrm{H}_2 \mathrm{O}\right)\right]^{2+} \rightleftharpoons\left[\mathrm{Cu}_2\left(\mathrm{H}_2 \mathrm{GL} 3\right)\left(\mathrm{H}_2 \mathrm{O}\right)\right]^{4+} \quad K=7.5 \times 10^7 \\ & \mathrm{Zn}^{2+}+\left[\mathrm{Zn}\left(\mathrm{H}_2 \mathrm{GL} 3\right)\left(\mathrm{H}_2 \mathrm{O}\right)\right]^{2+} \rightleftharpoons\left[\mathrm{Zn}_2\left(\mathrm{H}_2 \mathrm{GL} 3\right)\left(\mathrm{H}_2 \mathrm{O}\right)\right]^{4+} \quad K=2.5 \times 10^5 \end{aligned} $

  图 2

  

  图 2.  H₂GL1溶液中逐渐增大金属离子(a: Cu²⁺、c: Zn²⁺)浓度时的紫外可见光谱图; Sanchez法求稳定常数的图(b: 铜配合物、d: 锌配合物)

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  对于配合物的组成，通过元素分析和原子吸收光谱进行确定，其组成如表 2所示。

  表 2

  

  表 2  配合物组成分析

  Table 2.  Analysis of complex composition

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  Complex	Mass fraction / %
  	C			H			N			Cu or Zn
  	Calcd.	Found		Calcd.	Found		Calcd.	Found		Calcd.	Found
  [Cu(GL1)]	49.01	48.96		4.88	4.90		4.08	4.06		9.26	9.24
  [Zn(GL1)]	48.08	48.01		4.98	5.01		4.07	4.06		9.51	9.50
  [Cu(GL2)]	49.75	49.69		5.18	5.20		4.00	3.99		9.08	9.06
  [Zn(GL2)]	49.62	49.58		5.17	5.20		3.99	3.98		9.32	9.30
  [Cu2(GL3)(H2O)]	44.50	44.46		4.98	5.00		5.19	5.17		15.70	15.67
  [Zn2(GL3)(H2O)]	44.29	44.24		4.96	4.99		5.17	5.16		16.08	16.05

  从表 2配合物的组成分析结果来看，配体H₂GL1和H₂GL2与金属离子的配位比是1∶1，配体H₂GL3与金属离子的配位比是1∶2。结合相关文献^[40]，配合物的可能结构如图S4所示。

  2.3   生物活性

  2.3.1   抑制金属离子诱导的Aβ聚集

  Cu²⁺、Zn²⁺能与Aβ形成复合物进而加速Aβ聚集，这是诱导AD的众多因素中的一种。金属螯合剂能螯合因金属内稳态失衡产生的多余金属离子和M-Aβ复合物中的金属离子，因而能抑制金属离子诱导的Aβ聚集^[41-44]。我们用比浊度实验来检测葡萄糖修饰的双席夫碱对Cu²⁺、Zn²⁺诱导的Aβ聚集的干预作用，结果见图 3a。从图 3a中的结果来看，H₂GL1、H₂GL2和H₂GL3对Cu²⁺诱导的Aβ聚集的抑制率分别是79%、83%和86%，对Zn²⁺离子诱导的Aβ聚集的抑制率分别是69%、74%和77%。也就是说，在pH=7.4时，葡萄糖修饰的双席夫碱更能抑制Cu²⁺诱导的Aβ聚集，这可能是在pH=7.4时，Zn²⁺更能诱导Aβ聚集。而H₂GL3的抑制率最高，这和我们以前报道的结果^[31]相符。这些席夫碱抑制金属离子诱导的Aβ聚集的能力都强于CQ。

  图 3

  

  图 3.  (a) 在37 ℃下, Cu²⁺或Zn²⁺、Aβ与H₂GL在pH 7.4的缓冲液中孵化24 h后, 样品溶液进行比浊度分析(A_{405 nm})后计算的抑制率; (b) M²⁺与Aβ在37 ℃下孵化48 h后, 再加入螯合剂在相同温度下又共同孵化24 h后, 上层清液中Aβ的含量

  Figure 3.  (a) Inhibitory rates calculated by the result of turbidity (A_{405 nm}) of Aβ solution with Cu²⁺ or Zn²⁺ in the presence of H₂GL at 37 ℃ and pH 7.4 for 24 h; (b) Contents of Aβ in the supernatant after M²⁺ and Aβ were incubated at 37 ℃, pH 7.4 for 48 h, followed by the addition of chelators and further co-incubation at the same temperature for another 24 h

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  BCA蛋白实验结果(图 3b)显示，在没有金属离子存在下，Aβ_1~40溶液静置48 h，其中游离的Aβ含量依然是99%，但是Aβ与金属离子共同孵化48 h，其中游离的Aβ下降到40%左右。当Aβ与金属离子的样品在37 ℃下孵化48 h后，加入螯合剂继续共同孵化24 h，含有螯合剂H₂GL和CQ的样品上层清液中可溶性Aβ的百分含量显著增加。H₂GL1、H₂GL2、H₂GL3分别使含Zn²⁺的上层清液中可溶性Aβ的百分含量由39%上升到83%、80%、79%；分别使含Cu²⁺的上层清液中可溶性Aβ的百分含量由41%上升到85%、81%、80%。螯合剂CQ也能增加可溶性Aβ的百分含量，CQ使含Zn²⁺的上层清液中可溶性Aβ的百分含量上升到64%，含Cu²⁺的上升到66%。

  2.3.2   降低Cu²⁺-Aβ催化产生的ROS浓度

  Cu²⁺与Aβ形成的复合物，在抗坏血酸钠等还原剂的存在下，能催化ROS(如H₂O₂等)的生成，加速神经细胞凋亡^[45-47]。加入金属螯合剂，可以将Cu²⁺-Aβ复合物中的Cu²⁺螯合以破坏复合物，从而减少ROS的生成，缓解氧化应激^[48-50]。葡萄糖修饰的双席夫碱对Cu²⁺-Aβ催化产生的ROS的影响用HRP/Amplex-Red实验和DCFH-DA荧光探针法检测，结果如图 4所示。

  图 4

  

  图 4.  在Cu²⁺-Aβ处理的PC12细胞中, 螯合剂对H₂O₂浓度(a)和ROS水平(纵坐标: 每毫克蛋白的荧光强度) (b)的影响

  Figure 4.  Effect of the chelators on the concentration of H₂O₂ (a) and the level of ROS (vertical axis: fluorescence intensity per milligram of protein) (b) in PC12 cells treated by Cu²⁺-Aβ

  L1 (red)=H₂GL1, L1 (green)=H₂L1; L2 (red)=H₂GL2, L2 (green)=H₂L2; L3 (red)=H₂GL3, L3 (green)=H₂L3

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  图 4a显示，如果只是Aβ与PC12细胞共同孵化24 h，PC12细胞中H₂O₂的浓度很低，只有0.084 μmol·L^-1；当Cu²⁺、Aβ与PC12细胞共同孵化24 h，PC12细胞中H₂O₂浓度大幅度增加，达到1.26 μmol·L^-1；当葡萄糖修饰的双席夫碱(H₂GL2、H₂GL2、H₂GL3)与Cu²⁺、Aβ、PC12细胞共同孵化24 h，PC12细胞中H₂O₂的浓度分别是0.43、0.41、0.38 μmol·L^-1。而CQ与Cu²⁺、Aβ、PC12细胞共同孵化24 h，H₂O₂浓度是0.56 μmol·L^-1。荧光探针DCFH检测PC12细胞中的ROS水平(图 4b)的结果显示，当Cu²⁺、Aβ与PC12细胞共同孵化24 h，PC12细胞中ROS水平(以荧光强度表示)是184，当葡萄糖修饰的双席夫碱(H₂GL2、H₂GL2、H₂GL3)与Cu²⁺、Aβ、PC12细胞共同孵化24 h，PC12细胞中ROS水平分别是73、68、60。当CQ与Cu²⁺、Aβ、PC12细胞共同孵化24 h，细胞中ROS水平是94。另外，对未葡萄糖官能化的双席夫碱类似物的抗氧化活性也做了检测，它们的抗氧化活性都弱于相同类型的葡萄糖官能化的双席夫碱，这可能是因为葡萄糖上多羟基的缘故。

  2.3.3   增强PC12细胞中SOD活性

  SOD能有效清除细胞中的ROS，可减少AD脑模型大鼠中τ蛋白的磷酸化，过表达的Mn-SOD能减少Aβ介导的神经细胞凋亡，改善线粒体呼吸功能等作用^[51-52]。仿酶研究表明，SOD的活性中心可能就是金属螯合物的配位中心^[53]。我们用NBT分析法检测葡萄糖修饰的双席夫碱对Cu²⁺-Aβ作用的PC12细胞中SOD活性的影响，结果见图 5。

  图 5

  

  图 5.  (a) H₂GL对Cu²⁺-Aβ作用的PC12细胞中SOD活性的影响; (b) H₂GL3与Cu²⁺形成的配合物可能的结构

  Figure 5.  (a) Effect of H2GL on SOD activity in PC12 cells treated with Cu²⁺-Aβ; (b) Possible structure of the complex formed by H₂GL3 and Cu²⁺

  Vertical axis: enzyme activity per milligram of protein.

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  图 5a的结果显示，Cu²⁺-Aβ作用PC12细胞24 h后，细胞内SOD活性显著下降，从92 U·mg^-1降到23 U·mg^-1。而Cu²⁺、Aβ与葡萄糖修饰的双席夫碱共同与PC12细胞孵化24 h时，随着双席夫碱浓度的增加，SOD活性逐渐增加，当H₂GL2、H₂GL2或H₂GL3的浓度增加到50 μmol·L^-1时，细胞内SOD活力分别增加到39、41、55 U·mg^-1，当双席夫碱浓度增加到100 μmol·L^-1时，胞内SOD活力分别增加到56、58、77 U·mg^-1。H₂GL3的加入对细胞内SOD活力增加的影响要明显好于H₂GL1和H₂GL2，这可能是由于H₂GL3能与Cu²⁺形成如图 5b所示的双核铜配合物，能更好地模拟SOD。

  2.3.4   螯合剂缓解Aβ聚集产生的细胞毒性

  在考察葡萄糖修饰的双席夫碱抑制Aβ聚集产生的细胞毒性前，我们先用MTT实验检测了葡萄糖修饰的双席夫碱(H₂GL1、H₂GL2、H₂GL3)自身的毒性，作为对比，同时也检测了不含葡萄糖的结构相同的双席夫碱(H₂L1、H₂L2、H₂L3)的毒性(图 6)。将螯合剂以0、12.5、25、50、100 μmol·L^-1的浓度分别与PC12孵化48 h后，观察细胞的存活率，结果发现，即使含葡萄糖的双席夫碱(H₂GL1、H₂GL2、H₂GL3)浓度达到100 μmol·L^-1，细胞存活率都在90%以上，分别是92%、93%、95%(图 6a)。而不含葡萄糖的双席夫碱(H₂L1、H₂L2、H₂L3)在浓度为50 μmol·L^-1时，细胞存活率大幅下降，分别是61%、62%、70%。这说明葡萄糖修饰后，螯合剂自身的毒性大大降低。

  图 6

  

  图 6.  (a) 螯合剂的毒性; (b) 不含葡萄糖结构的双席夫碱

  Figure 6.  (a) Cytotoxicity of the chelators; (b) Bis-Schiff bases not containing the glucose structure

  Vertical axis: cell viability expressed as a percentage compared to the control group.

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  因为Cu²⁺会加速Aβ聚集，形成从Aβ寡聚物到纤维状聚集物的不同形态的聚集体，这些聚集体都有细胞毒性，会加速神经细胞凋亡。另外Cu-Aβ复合物会催化分子氧生成ROS，导致氧化应激，也会促使神经细胞凋亡。加入金属螯合剂会缓解金属离子诱导的Aβ聚集，从而缓解Aβ聚集产生的细胞毒性，同时螯合Cu-Aβ复合物中的Cu²⁺，减少ROS的生成，因而提高细胞生存率^[52-57]。从图 7a可以看出，在浓度小于20 μmol·L^-1时，单独的Aβ、Cu²⁺或Zn²⁺与PC12细胞共孵化48 h，细胞存活率下降幅度不大，这与文献结果一致^[58]。在Aβ、Cu²⁺一起与PC12细胞共孵化48 h，细胞存活率下降到42%。Aβ、Cu²⁺、葡萄糖修饰的双席夫碱(H₂GL1、H₂GL2、H₂GL3)一起与PC12细胞共孵化48 h，细胞存活率分别是75%、76%和83%。Zn²⁺的情况与Cu²⁺类似，在螯合剂(H₂GL1、H₂GL2、H₂GL3)存在下，能将细胞存活率从45%分别提高到79%、80%和87%。CQ能将Cu²⁺-Aβ作用的细胞存活率从42%提高到69%，将Zn²⁺-Aβ作用的细胞存活率从45%提高到71%。另外，对不含葡萄糖的相同类型的双席夫碱也进行了考察(图 7b)，不含葡萄糖的同类双席夫碱虽然也能提高Cu²⁺-Aβ作用的PC12细胞存活率，但其增加幅度远不如葡萄糖官能化的双席夫碱，这可能是因为含葡萄糖的双席夫碱自身毒性小和具有多个羟基，能更有效降低ROS水平。

  图 7

  

  图 7.  (a) 葡萄糖修饰的双席夫碱对M²⁺-Aβ作用的PC12细胞的存活率的影响; (b) 葡萄糖修饰的双席夫碱和不含葡萄糖的双席夫碱对Cu²⁺-Aβ作用的PC12细胞的存活率的影响

  Figure 7.  (a) Effect of glucose-modified bis-Schiff bases on the viability of M²⁺-Aβ-treated PC12 cells; (b) Effect of glucose-modified bis-Schiff bases and bis-Schiff bases not containing the glucose on the viability of Cu²⁺-Aβ-treated PC12 cells

  Vertical axis: cell viability expressed as a percentage compared to the control group; L1 (red)=H₂GL1, L1 (green)=H₂L1; L2 (red)=H₂GL2, L2 (green)=H₂L2; L3 (red)=H₂GL3, L3 (green)=H₂L3.

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  因为Zn²⁺不会催化氧气产生ROS，但在Zn²⁺-Aβ存在下，细胞的存活率还是下降，这说明Aβ聚集物是促进细胞凋亡的一个重要原因。而在Cu²⁺-Aβ存在下，细胞存活率更低，说明除了Aβ聚合物的神经毒性外，氧化应激也是促使神经细胞凋亡的原因。

  3.   结论

  用微波辐射加热的方法快速合成葡萄糖修饰的水杨醛衍生物，进而合成葡萄糖修饰的双席夫碱，并对这些化合物治疗因金属离子内稳态失衡引发的AD的生物活性做了一些体外实验研究，发现这些葡萄糖修饰的席夫碱能有效降低双席夫碱自身的毒性，作为金属螯合剂能有效抑制Cu²⁺、Zn²⁺诱导的Aβ聚集，降低Cu²⁺-Aβ作用的细胞中的ROS水平，增强Cu²⁺-Aβ作用的细胞中SOD活力，大幅缓解Cu²⁺-Aβ作用引起的Aβ聚集产生的细胞毒性，提高细胞生存率。由于含有葡萄糖的缘故，其自身细胞毒性远低于没有葡萄糖修饰的同类双席夫碱。因此，这类化合物有望成为一种治疗AD的药物。

  
  Supporting information is available at http://www.wjhxxb.cn
  
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  图 1  葡萄糖修饰的双席夫碱的结构

  Figure 1  Structure of glucose-modified bis-Schiff bases

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  Scheme1  Synthesis of glucose-modified bis-Schiff bases

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  图 2  H₂GL1溶液中逐渐增大金属离子(a: Cu²⁺、c: Zn²⁺)浓度时的紫外可见光谱图; Sanchez法求稳定常数的图(b: 铜配合物、d: 锌配合物)

  Conditions: 0.1 mol·L^-1 NaNO₃, pH=6.6, 25 ℃.

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  图 3  (a) 在37 ℃下, Cu²⁺或Zn²⁺、Aβ与H₂GL在pH 7.4的缓冲液中孵化24 h后, 样品溶液进行比浊度分析(A_{405 nm})后计算的抑制率; (b) M²⁺与Aβ在37 ℃下孵化48 h后, 再加入螯合剂在相同温度下又共同孵化24 h后, 上层清液中Aβ的含量

  Figure 3  (a) Inhibitory rates calculated by the result of turbidity (A_{405 nm}) of Aβ solution with Cu²⁺ or Zn²⁺ in the presence of H₂GL at 37 ℃ and pH 7.4 for 24 h; (b) Contents of Aβ in the supernatant after M²⁺ and Aβ were incubated at 37 ℃, pH 7.4 for 48 h, followed by the addition of chelators and further co-incubation at the same temperature for another 24 h

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  图 4  在Cu²⁺-Aβ处理的PC12细胞中, 螯合剂对H₂O₂浓度(a)和ROS水平(纵坐标: 每毫克蛋白的荧光强度) (b)的影响

  Figure 4  Effect of the chelators on the concentration of H₂O₂ (a) and the level of ROS (vertical axis: fluorescence intensity per milligram of protein) (b) in PC12 cells treated by Cu²⁺-Aβ

  L1 (red)=H₂GL1, L1 (green)=H₂L1; L2 (red)=H₂GL2, L2 (green)=H₂L2; L3 (red)=H₂GL3, L3 (green)=H₂L3

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  图 5  (a) H₂GL对Cu²⁺-Aβ作用的PC12细胞中SOD活性的影响; (b) H₂GL3与Cu²⁺形成的配合物可能的结构

  Figure 5  (a) Effect of H2GL on SOD activity in PC12 cells treated with Cu²⁺-Aβ; (b) Possible structure of the complex formed by H₂GL3 and Cu²⁺

  Vertical axis: enzyme activity per milligram of protein.

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  图 6  (a) 螯合剂的毒性; (b) 不含葡萄糖结构的双席夫碱

  Figure 6  (a) Cytotoxicity of the chelators; (b) Bis-Schiff bases not containing the glucose structure

  Vertical axis: cell viability expressed as a percentage compared to the control group.

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  图 7  (a) 葡萄糖修饰的双席夫碱对M²⁺-Aβ作用的PC12细胞的存活率的影响; (b) 葡萄糖修饰的双席夫碱和不含葡萄糖的双席夫碱对Cu²⁺-Aβ作用的PC12细胞的存活率的影响

  Figure 7  (a) Effect of glucose-modified bis-Schiff bases on the viability of M²⁺-Aβ-treated PC12 cells; (b) Effect of glucose-modified bis-Schiff bases and bis-Schiff bases not containing the glucose on the viability of Cu²⁺-Aβ-treated PC12 cells

  Vertical axis: cell viability expressed as a percentage compared to the control group; L1 (red)=H₂GL1, L1 (green)=H₂L1; L2 (red)=H₂GL2, L2 (green)=H₂L2; L3 (red)=H₂GL3, L3 (green)=H₂L3.

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  表 1  常规加热模式和微波加热模式反应结果对比

  Table 1.  Comparison of the reaction results under conventional heating mode and microwave heating mode

  Entry	Solvent	Heating mode	Time / min	Isolated yield / %
  1	CH3Cl	Conventional	300	72
  2	DMF	Conventional	300	27
  3	DMF	Microwave	15	69
  4	1, 4-Dioxane	Conventional	300	25
  5	1, 4-Dioxane	Microwave	15	64
  6	CH3CN	Conventional	300	26
  7	CH3CN	Microwave	15	68
  8	THF	Conventional	300	30
  9	THF	Microwave	15	75

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  表 2  配合物组成分析

  Table 2.  Analysis of complex composition

  Complex	Mass fraction / %
  	C			H			N			Cu or Zn
  	Calcd.	Found		Calcd.	Found		Calcd.	Found		Calcd.	Found
  [Cu(GL1)]	49.01	48.96		4.88	4.90		4.08	4.06		9.26	9.24
  [Zn(GL1)]	48.08	48.01		4.98	5.01		4.07	4.06		9.51	9.50
  [Cu(GL2)]	49.75	49.69		5.18	5.20		4.00	3.99		9.08	9.06
  [Zn(GL2)]	49.62	49.58		5.17	5.20		3.99	3.98		9.32	9.30
  [Cu2(GL3)(H2O)]	44.50	44.46		4.98	5.00		5.19	5.17		15.70	15.67
  [Zn2(GL3)(H2O)]	44.29	44.24		4.96	4.99		5.17	5.16		16.08	16.05

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