English

• 0.   引言

  光热治疗(PTT)是一种创新的肿瘤治疗方式，其通过将光转化为热来消融局部实体瘤，具有良好的抗肿瘤行为。各种碳基纳米材料、半导体聚合物和低分子量的光热试剂具有近红外光(NIR)吸收，已被用于PTT。在众多的光热试剂中，普鲁士蓝(PB)具有较高的光热转换效率、较高的T₂-磁共振成像(T₂-MRI)弛豫率，在肿瘤的诊断和光热治疗中表现出巨大的潜能^[1]。并且，PB中同时存在Fe(Ⅲ)/Fe(Ⅱ)^[2]，能够与肿瘤内的H₂O₂发生类过氧化物酶反应(POD-like)，在肿瘤细胞内原位产生羟基自由基(·OH)^[3]，导致肿瘤细胞线粒体不可逆转的破坏和DNA链断裂，从而杀死癌细胞^[4]。结合PB的光热性能，基于光热转化催化可以进一步促进PB的POD-like活性，因此PB能够作为肿瘤催化治疗的候选材料。但是由于肿瘤微环境(TME)中H₂O₂的不足，导致不能够产生足够的·OH，限制了PB的应用。因此，解决细胞内H₂O₂的不足是拓宽PB在肿瘤治疗应用中的关键问题。

  纳米催化治疗是近年来发展起来的一种利用纳米催化剂在体内启动催化反应从而治疗各种疾病的治疗方法，利用肿瘤细胞和正常细胞的微环境不同，实现纳米材料靶向作用，催化内源性H₂O₂，从而在肿瘤细胞内原位产生·OH，造成肿瘤细胞线粒体不可逆转的破坏和DNA链断裂，从而杀死癌细胞^[5]。而催化治疗的效率比较低，难以达到满意的治疗效果。虽然协同精准的化疗可以提升催化治疗的效果，但长期使用化疗药物会导致耐药性^[6]。为了避免化疗的耐药性，科研人员正在探索无化疗的增强催化治疗的策略。想提升催化治疗的效果，需要解决TME对催化反应的限制，因此，调控TME是提升催化治疗的先决条件^[7]。

  肿瘤细胞内含有高浓度的谷胱甘肽(GSH，0.5~10 mmol·L^-1)，会消耗芬顿/类芬顿反应过程中产生的·OH，减弱催化效果。除了高浓度的GSH的影响，肿瘤细胞内H₂O₂不足也会导致难以达到满意的催化治疗疗效。目前，许多研究都集中在提高肿瘤中H₂O₂的水平上，以解决内源性H₂O₂不足的问题^[8-10]。直接输送H₂O₂或负载葡萄糖氧化酶(GOx)来催化氧化肿瘤内葡萄糖原位生成H₂O₂的策略已经取得了很大的进展。然而，在血液循环过程中不可避免的H₂O₂泄漏以及肿瘤的缺氧环境导致GOx的催化效率有限^[11-13]。由过氧基团和金属离子组成的金属过氧化物被认为是一种补充肿瘤细胞内H₂O₂含量的候选者。有研究发现，过氧化铜(CuO₂)可以通过TME产生Cu²⁺和H₂O₂，同时补充内源性H₂O₂。产生的Cu²⁺可以将细胞内GSH氧化成还原性谷胱甘肽(GSSG)，从而消耗GSH，减少GSH对·OH的清除作用^[14-17]。另一方面，Cu²⁺被GSH还原为Cu⁺，在肿瘤的酸性环境中，Cu⁺的催化性能远高于Fe²⁺，从而提高催化活性^[18-21]。光热治疗与催化治疗协同治疗，可以进一步提升催化治疗的效果。光热治疗可以将NIR转化为热，随着温度的提高，可以提高·OH的生成效率^[22-24]；另一方面，光热治疗产生的热本身可以激起肿瘤细胞的原位死亡。

  基于此，我们设计了一种具有H₂O₂自供的光热增强类酶活性的多功能纳米酶CuO₂/PB，如图 1所示。通过在PB中引入CuO₂合成多功能纳米酶CuO₂/PB，并利用TME中的弱酸性触发H₂O₂的生成，解决内源性H₂O₂不足的问题。利用PB的光热效应，可以增强CuO₂/PB的POD-like活性和GSH的消耗，进一步促进·OH的生成。此外，将CuO₂/PB用于T₂-MRI成像，这种成像引导下的光热治疗和催化治疗为优化癌症治疗提供了一种新的策略。

  图 1

  

  图 1.  CuO₂/PB的(a) 合成过程和(b) 催化治疗机理示意图

  Figure 1.  Schematic illustrations of (a) synthetic procedure and (b) catalytic therapy mechanism of CuO₂/PB

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  1.   实验部分

  1.1   实验试剂

  三水合氯化铜(CuCl₂·3H₂O)、过氧化氢(H₂O₂)、3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)、亚甲基蓝(MB)、高锰酸钾(KMnO₄)、氢氧化钠(NaOH)和铁氰化钾(K₃[Fe(CN)₆])购买于阿拉丁试剂上海有限公司。4T1细胞、293T细胞和Balb/c雌性小鼠(3~4周)购买于武汉光谷国际生物医药有限公司。GSH、5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、新亚铜试剂、细胞计数试剂盒-8(CCK-8)购买于北京兰杰科技有限公司。实验程序经湖北大学批准。

  实验中使用的仪器包括JSM6510LV扫描电镜(SEM，JEOL，Japan)、透射电镜(TEM，FEI&America，加速电压：200 kV)、红外光谱仪(FTIR，PerkinElmer，US，室温，KBr压片，400~4 000 cm^-1)、X射线光电子能谱仪(XPS，Thermo Fisher Scientific Inc，Waltham，MA，USA，单色Al Kα源，ESCALAB 250Xi X射线)、紫外可见分光光度计(岛津UV-2600i，185~900 nm)。

  1.2   CuO₂的合成

  将0.03 g的CuCl₂·3H₂O分散在30 mL的去离子水中，在室温下搅拌，超声至完全溶解后，加入30 mL的氢氧化钠溶液(0.01 mmol·L^-1)和10 μL的H₂O₂(30%)，静置30 min后，高速离心、洗涤多次，烘干得到CuO₂。

  1.3   复合材料的合成

  将0.06 g的CuO₂分散在60 mL的去离子水中，加入60 mL的铁氰化钾(1 mg·mL^-1)并在室温下搅拌24 h。当反应结束后，高速离心、洗涤多次，烘干得到CuO₂/PB。

  将0.658 g的铁氰化钾和1.323 g的柠檬酸钠分散在100 mL的去离子水中，室温下搅拌24 h。反应结束后，高速离心、洗涤多次，烘干得到PB。按质量比1∶1将CuO₂与PB充分物理混合得到CuO₂+PB。

  1.4   光热性能测试

  将1.0 mL的CuO₂/PB的悬浮液(0、0.05、0.1、0.2 mg·mL^-1)转移到离心管中，用NIR进行照射。每隔30 s，用红外热成像仪来监测并记录温度，在相同条件下以水为对照组进行对照实验。文中光热实验均使用0.2 mg·mL^-1的CuO₂/PB，在808 nm、1 W·cm^-2的条件下进行。根据下述公式计算CuO₂/PB的光热转换效率(θ)：

  $ \eta=\frac{h s\left(T_{\max }-T_{\mathrm{sur}}\right)-Q_{\mathrm{dis}}}{I\left(1-10^{-A_{\mathrm{808}}}\right)} $

  (1)

  $ \tau_s=\frac{m_{\mathrm{D}} c_{\mathrm{D}}}{h s} $

  (2)

  $ T=-\tau_{\mathrm{s}} \ln \theta $

  (3)

  $ \theta=\frac{T-T_{\text {sur }}}{T_{\max }-T_{\text {sur }}} $

  (4)

  其中，Q_dis(mW)是由于容器吸收光而造成的热损失，计算结果为0 mW；A₈₀₈是溶液在808 nm处的吸光度；h(W·cm^-2·K^-1)为热导率；T(K)是随时间变化的温度；T_sur(K)是环境温度；T_max(K)是溶液最高温度；I(W)为激光功率；s(cm²)为容器口的面积；τ_s(s)为系统时间常数；m_D(g)和c_D(J·g^-1·K^-1)分别为溶剂的质量和热容。

  1.5   CuO₂/PB的催化性能

  通过KMnO₄与H₂O₂的反应评价CuO₂/PB的催化性能，具体方法如下：将3 mL KMnO₄(10 μg·mL^-1)溶液分别与1.84 mL H₂SO₄溶液(0.1 mol·L^-1)、100 μL CuO₂/PB(10 mg·mL^-1)、100 μL CuO₂/PB(10 mg·mL^-1)+1.84 mL H₂SO₄溶液(0.1 mol·L^-1)、1 mL H₂O₂(50 mmol·L^-1)+1.84 mL H₂SO₄(0.1 mol·L^-1)溶液混合。反应30 min后，离心，测试紫外可见光谱。

  使用新亚铜试剂来检测Cu⁺：在CuO₂/PB(0.2 mg·mL^-1)和GSH(10 mmol·L^-1)的混合液中加入4 mmol·L^-1新亚铜试剂，离心取上清液测量其在457 nm的吸光度值。通过MB的降解实验来检测生成的·OH：在25 mL的MB溶液中(pH=5.8或7.4，或添加10 mmol·L^-1 GSH)加入5 mg的CuO₂/PB，吸附平衡后，加入25 μL的30% H₂O₂。30 min后离心，取上清液测量其在665 nm处的吸光度值。

  使用TMB来评估CuO₂/PB的POD-like活性：在H₂O₂(10 mmol·L^-1)的磷酸盐缓冲液(PBS，pH=5.8)中加入CuO₂/PB(0.2 mg·mL^-1)和TMB(5 mg·mL^-1)。反应后离心，取上清液测量其在652 nm处的吸光度值。使用DTNB来评估CuO₂/PB消耗GSH的能力：在GSH的PBS(pH=5.8)中加入CuO₂/PB(0.2 mg·mL^-1)，反应后离心，取上清液并加入DTNB(1 mg·mL^-1)以测量其在412 nm处的吸光度值。

  1.6   细胞毒性

  4T1细胞(癌细胞)和293T细胞(正常细胞)在37 ℃和含5%(体积分数)CO₂湿化气氛的高糖细胞培养基(DMEM)中孵育。然后将CuO₂/PB加入96孔板中，继续培养24 h。使用100 μL 0.1 mg·mL^-1 CCK-8测定细胞活力。将4T1细胞和293T细胞以每孔4 000个细胞的密度接种到孔板中，培养12 h。将CuO₂/PB(质量浓度从0~0.2 mg·mL^-1)加入96孔板中继续培养24 h。然后用PBS将细胞冲洗3次，添加CCK-8溶液(0.1 mg·mL^-1，100 μL)，于37 ℃下培养3 h。检测每个孔中的溶液在450 nm处的吸光度(A)。激光组细胞用NIR(808 nm，1 W·cm^-2，10 min)在相同的条件下进行实验。以未加入材料的培养基的吸光度(A_n)作为对照组，只含有CCK-8培养基的吸光度(A_b)作为空白对照组。根据以下公式计算细胞活力(R_cv)：

  $ R_{\mathrm{cv}}=\left(A-A_{\mathrm{b}}\right) /\left(A_{\mathrm{n}}-A_{\mathrm{b}}\right) \times 100 \% $

  1.7   T₂-MRI表征

  通过临床磁共振扫描仪(3.0 T)进行T₂-MRI实验。在离心管中配制不同质量浓度的CuO₂/PB(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg·mL^-1)进行体外T₂-MRI测试。给小鼠静脉注射(100 μL 0.2 mg·mL^-1)CuO₂/PB，不同时间(0、0.5、1、2和3 h)后依次进行体内T₂-MRI测试。给小鼠注入相同量的PBS作为对照。

  1.8   动物及肿瘤模型

  在雌性鼠皮下注射0.1 mL的4T1癌细胞建立小鼠模型。当肿瘤体积达到约100 cm³时，将小鼠分为3组，分别用0.2 mg·mL^-1 PBS、0.2 mg·mL^-1 CuO₂/PB、0.2 mg·mL^-1 CuO₂/PB+NIR进行处理。给药24 h后，采用NIR照射(激发波长808 nm，功率1 W·cm^-2，时间5 min)。记录14 d内小鼠的体重和肿瘤体积变化。14 d的治疗结束后，解剖小鼠取出肿瘤组织，进行苏木精尹红(H&E)染色。

  2.   结果与讨论

  2.1   材料的表征

  图 2a~2d为CuO₂和CuO₂/PB的SEM和TEM图像。从图中可以看出，CuO₂纳米粒子粒径大约为30 nm，而CuO₂/PB的PB表面上分布着较小的CuO₂立方体，其粒径大约为200 nm。

  图 2

  

  图 2.  (a) CuO₂和(b) CuO₂/PB的SEM图像; (c) CuO₂和(d) CuO₂/PB的TEM图像; (e) CuO₂、CuO₂/PB和CuO₂+PB的FTIR谱图; (f) CuO₂/PB的XPS全谱图; CuO₂/PB的(g) O1^s、(h) Fe2^p和(i) Cu2^p XPS谱图

  Figure 2.  SEM images of (a) CuO₂ and (b) CuO₂/PB; TEM images of (c) CuO₂ and (d) CuO₂/PB; (e) FTIR spectra of CuO₂, CuO₂/PB, and CuO₂+PB; (f) XPS survey spectrum of CuO₂/PB; (g) O1^s, (h) Fe2^p, and (i) Cu2^p XPS spectra of CuO₂/PB

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  图 2e显示了CuO₂、CuO₂/PB和CuO₂+PB(物理混合)的红外光谱图。对于CuO₂，在521 cm^-1处的吸收峰归因于Cu—O的伸缩振动^[24]，在1 000 cm^-1处的吸收峰归因于O—O的伸缩振动。对于PB，在2 115 cm^-1左右的特征峰归因于—C≡N—键的伸缩振动^[25]。CuO₂/PB在2 115 cm^-1左右的峰出现了蓝移，且520和1 000 cm^-1的吸收峰强度明显减弱，不同于CuO₂+PB物理混合，这表明CuO₂/PB是一种新物质而不是CuO₂和PB简单的物理混合，证明了CuO₂/PB的成功合成。

  进一步使用XPS表征了CuO₂/PB的化学组成和价态。图 2f中CuO₂/PB的全谱图表明其是由Cu、Fe、C、N、O组成。图 2g为O1s高分辨XPS谱图，在532.8 eV处的峰归属于O₂^2-[24]，在531.5 eV处的峰归属于CuO₂的C—O键^[26]。图 2h、2i显示了铁和铜化合价态的变化。图 2h是Fe2p高分辨谱图，图中在712.4和723.9 eV处的结合能归属于Fe³⁺，在708.3和721.1 eV处的结合能归属于Fe^2+[25]。从图 2i中可以看出，Cu2p谱图分裂出4个特征峰，其中954.9和934.9 eV处的峰分别归属于Cu²⁺2p_1/2和Cu²⁺2p_3/2，在953.5和933.5 eV处的峰分别归属于Cu⁺2p_1/2和Cu⁺2p_3/2^[27]。结果证实CuO₂/PB中存在Cu⁺/Cu²⁺和Fe²⁺/Fe³⁺的混合价态，这表明CuO₂/PB的催化能力较强。

  2.2   光热性能

  通过体外光热实验考察了CuO₂/PB的光热性能，结果如图 3所示。图 3a显示了相同质量浓度(0.2 mg·mL^-1)的CuO₂/PB在不同PBS(pH=5.8或7.4)中温度随时间的变化曲线。在pH=7.4的PBS中CuO₂/PB的温度升高至37.6 ℃，而在pH=5.8的PBS中CuO₂/PB的温度升高至44.1 ℃，这可能是受CuO₂/PB质子化的影响^[28]。TME偏酸性而正常细胞微环境偏中性，这有利于CuO₂/PB选择性地进行光热治疗，避免损伤正常细胞。图 3b显示了在NIR照射10 min后，0.2 mg·mL^-1的CuO₂/PB的温度升高了16.1 ℃，而相同条件下水的温度只升高了4.0 ℃，表明了CuO₂/PB良好的光热性能。此外，由图可知CuO₂/PB的光热性能和其质量浓度呈正相关。图 3c表明CuO₂/PB的光热性能也和激光功率呈正相关。图 3d是NIR激光照射10 min获得的CuO₂/PB的红外热成像图，也证实了该材料具有良好的光热响应能力。图 3e为0.2 mg·mL^-1的CuO₂/PB悬浮液的升温降温曲线，计算可得其光热效率为27.3%。最后，通过5次冷热循环评估了CuO₂/PB的光热稳定性。图 3f显示5次循环后，CuO₂/PB悬浮液的温度依然可以升高18.6 ℃，这表明CuO₂/PB具有光热稳定性。

  图 3

  

  图 3.  (a) CuO₂/PB在不同环境下的温度曲线; (b) 不同质量浓度CuO₂/PB在pH=5.8时的温度曲线; CuO₂/PB的(c) 光热功率图像、(d) 红外热像图、(e) 光热转换效率图像、(f) 光热循环图像

  Figure 3.  (a) Temperature curves of CuO₂/PB in different environments; (b) Temperature curves of CuO₂/PB with different concentrations at pH=5.8 of CuO₂/PB; (c) Photothermal power curves, (d) infrared thermal image, (e) photothermal transfer efficiency curves, and (f) photothermal cycle image of CuO2/PB

  Conditions: (a) 0.2 mg·mL^-1, 808 nm, 1 W·cm^-2; (b) 808 nm, 1 W·cm^-2; (c) 0.2 mg·mL^-1, 808 nm; (d) 808 nm, 1 W·cm^-2, 10 min; (e) 0.2 mg·mL^-1, 808 nm, 1 W·cm^-2; (f) 0.2 mg·mL^-1, 808 nm, 1 W·cm^-2.

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  2.3   CuO₂/PB的催化性能

  为了证明CuO₂/PB的催化机制，首先通过KMnO₄溶液检测了H₂O₂生成。如图 4a所示，单独的酸性环境对于KMnO₄溶液吸光度的影响可以忽略，而在H₂O₂存在下KMnO₄溶液的特征吸收峰消失；当CuO₂/PB在酸性环境和KMnO₄溶液中时，KMnO₄溶液的特征吸收也明显降低，这表明了酸性环境下产生了更多的H₂O₂。此外，为了验证CuO₂/PB在GSH环境中Cu²⁺被还原为Cu⁺，选择新亚铜试剂作为Cu⁺的指示剂。如图 4b所示，在CuO₂/PB和GSH反应后的上清液中加入新亚铜试剂，溶液在457 nm处产生了特征吸收峰，这是由于新亚铜试剂与Cu⁺反应生成了配合物，证明了Cu²⁺被GSH还原为Cu⁺。因此，根据实验和文献报道^[28-29]，推测CuO₂/PB消耗GSH产生·OH的机制如下：

  $ \mathrm{CuO}_2+\mathrm{H}^{+} \rightarrow \mathrm{Cu}^{2+}+\mathrm{H}_2 \mathrm{O}_2 $

  (5)

  $ \mathrm{Fe}^{3+}+\mathrm{GSH} \rightarrow \mathrm{Fe}^{2+}+\mathrm{GSSG} $

  (6)

  $ \mathrm{Cu}^{2+}+\mathrm{GSH} \rightarrow \mathrm{Cu}^{+}+\mathrm{GSSG} $

  (7)

  $ \mathrm{Fe}^{2+}+\mathrm{H}_2 \mathrm{O}_2 \rightarrow \mathrm{Fe}^{3+}+\cdot \mathrm{OH} $

  (8)

  $ \mathrm{Cu}^{+}+\mathrm{H}_2 \mathrm{O}_2 \rightarrow \mathrm{Cu}^{2+}+\cdot \mathrm{OH} $

  (9)

  图 4

  

  图 4.  (a) 不同处理条件下KMnO₄溶液的吸收光谱图; (b) 不同处理条件下新亚铜试剂的吸收光谱图; (c) 不同环境中CuO₂/PB降解MB溶液的吸收光谱图; (d) CuO₂/PB与H₂O₂反应后上清液的吸收光谱图; (e) 在CuO₂/PB与GSH反应后的上清液加入DTNB溶液的吸收光谱图

  Figure 4.  (a) Absorption spectra of KMnO₄ solutions under different treatment conditions; (b) Absorption spectra of newcuprous reagents under different treatment conditions; (c) Absorption spectra of MB solution degraded by CuO₂/PB in different environments; (d) Absorption spectra of the supernatant after the reaction of CuO₂/PB and H₂O₂; (e) Absorption spectra of the supernatant after CuO₂/PB incubated with GSH and added to DTNB solution

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  通过模拟在TME中CuO₂/PB对MB的降解实验，进一步考察了CuO₂/PB的催化性能。如图 4c所示，MB本身的降解和H₂O₂对于MB的影响可以忽略。加入CuO₂/PB后，吸光度有所下降是由于CuO₂/PB对MB有一定的吸附作用。在吸附平衡后，加入H₂O₂反应40 min后，中性环境中吸光度微微下降，而在酸性环境中吸光度下降明显，在酸性环境和GSH环境中吸光度几乎接近于零。这归因于CuO₂/PB催化H₂O₂产生的·OH降解MB，且在酸性环境中CuO₂/PB催化性能胜于中性环境。这是由于酸性环境中CuO₂/PB与H⁺反应生成了H₂O₂和Cu²⁺。且GSH的存在有利于Cu²⁺向Cu⁺的转化，Cu⁺更易于催化H₂O₂生成·OH。

  接下来测试了模拟TME弱酸性(pH=5.8)下光热增强CuO₂/PB的POD-like活性和GSH消耗能力。首先使用TMB作为·OH的探针来评估CuO₂/PB的POD-like活性。图 4d显示了有无NIR照射下CuO₂/PB和H₂O₂反应后的吸收光谱图。有NIR照射的溶液在652 nm处的吸收值增加得更明显，表明了光热增强了CuO₂/PB的POD-like活性，生成了更多的·OH。使用DTNB考察了CuO₂/PB消耗GSH的能力，结果如图 4e显示。在CuO₂/PB和GSH反应后的上清液中加入DTNB，在412 nm处的吸光度明显降低，表明CuO₂/PB消耗了GSH。在相同的条件下，经NIR照射，412 nm处的吸光度降得更明显，表明在NIR照射下CuO₂/PB消耗了更多的GSH。这归因于NIR照射增强了CuO₂/PB消耗GSH的能力。主要原因是NIR介导的热增加了反应体系的温度，提高了化学反应速率。

  2.4   细胞毒性和磁共振成像

  为了证明纳米酶的安全性，比较了CuO₂/PB对4T1细胞和293T细胞的细胞毒性。如图 5a所示，用0.2 mg·mL^-1的CuO₂/PB处理的4T1细胞的细胞存活率大约为61%，而在相同条件下，用NIR处理的4T1细胞的细胞存活率下降至50%，这归因于光热增强了多功能纳米酶的催化治疗活性。图 5b显示了不同浓度的CuO₂/PB处理293T细胞后，其细胞存活率接近80%，这归因于正常细胞偏中性的微环境限制了CuO₂/PB的催化性能。结果表明，CuO₂/PB可以选择性地杀死肿瘤细胞而对正常细胞基本没有伤害。

  图 5

  

  图 5.  (a) 不同处理条件下4T1细胞的细胞活力; (b) CuO₂/PB处理293T细胞的细胞活力; (c) CuO₂/PB的弛豫性能(体外MRI); (d) 肿瘤部位的T₂-MRI信号强度随时间变化图; (e) 静脉注射CuO₂/PB后小鼠的体内T₂-MRI图

  Figure 5.  (a) Cell viability of 4T1 cells under different treatment conditions; (b) Cell viability of 293T cells treated with CuO₂/PB; (c) Relaxation properties of CuO₂/PB (in vitro MRI); (d) T₂-MRI signal intensity changed over time at the tumor site; (e) In vivo T₂-MRI images of mice after intravenous CuO₂/PB injection

  Inset in c: T₂-MRI images of CuO₂/PB aqueous solution.

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  CuO₂/PB的T₂-MRI结果如图 5c~5e所示。图 5c显示了CuO₂/PB的成像能力与其质量浓度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg·mL^-1)呈正相关，T₂-MRI信号随着质量浓度增加而增强。计算得到CuO₂/PB的弛豫率为147.87 mmol^-1·mL·s^-1，高于其他纳米粒子。图 5d显示了小鼠经尾静脉注射CuO₂/PB后肿瘤部位T₂-MRI信号强度逐渐降低，表明CuO₂/PB在肿瘤部位累积。图 5e为小鼠的T₂-MRI图，由图可见肿瘤部位T₂加权图像逐渐变暗，也进一步证明了CuO₂/PB在肿瘤部位的累积。

  2.5   小鼠治疗效果

  CuO₂/PB小鼠抗肿瘤效果如图 6所示。图 6a显示了注射PBS的小鼠肿瘤体积不受控制，而用CuO₂/PB处理的小鼠肿瘤生长比PBS组要慢，这是由于H₂O₂自供和多功能纳米酶的催化治疗。接受CuO₂/PB+NIR治疗的小鼠对肿瘤抑制效果最好，证实了催化治疗与光热治疗的协同作用。图 6b为小鼠热成像图(808 nm，1.0 W·cm^-2，10 min)，该图表明10 min内小鼠温度升高至45.5 ℃。在治疗期间没有观察到小鼠体重明显减轻和死亡，如图 6c所示，说明CuO₂/PB在治疗期间副作用较小。图 6d记录了治疗过程中小鼠的实时照片。肿瘤切片的H&E染色如图 6e所示，CuO₂/PB+NIR组比其他治疗组能引起更多的肿瘤细胞凋亡和坏死，进一步证明了CuO₂/PB可以实现光热增强的催化治疗。

  图 6

  

  图 6.  (a) 不同治疗组小鼠的肿瘤体积变化; (b) 小鼠的热成像图; (c) 不同治疗组小鼠的体重变化; (d) 治疗过程中小鼠的实时照片; (e) H&E染色图

  Figure 6.  (a) Changes in tumor volume of mice in different treatment groups; (b) Thermal imagings of mice; (c) Weight changes of mice in different treatment groups; (d) Real-time photographs of mice during treatment; (e) H&E staining diagram

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  3.   结论

  我们制备了一种集MRI、光热治疗与催化治疗于一体的多功能纳米酶CuO₂/PB。CuO₂/PB在肿瘤的酸性环境中释放出Cu²⁺，通过芬顿反应将自供给的H₂O₂转化为·OH，杀死癌细胞，并且随着Fe³⁺/Fe²⁺和Cu²⁺/Cu⁺的自循环价态变化，可以持续消耗GSH，降低肿瘤的抗氧化防御作用。在NIR激光照射下，CuO₂/PB的催化性能进一步增强。细胞实验证明了NIR激光照射可以增强催化效果，杀死肿瘤细胞。动物实验也证明了CuO₂/PB实现了H₂O₂自我供应的催化治疗和光热治疗的联合治疗。这项工作为H₂O₂自供协同光热增强催化治疗提供了新思路。

  
  
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  图 1  CuO₂/PB的(a) 合成过程和(b) 催化治疗机理示意图

  Figure 1  Schematic illustrations of (a) synthetic procedure and (b) catalytic therapy mechanism of CuO₂/PB

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  图 2  (a) CuO₂和(b) CuO₂/PB的SEM图像; (c) CuO₂和(d) CuO₂/PB的TEM图像; (e) CuO₂、CuO₂/PB和CuO₂+PB的FTIR谱图; (f) CuO₂/PB的XPS全谱图; CuO₂/PB的(g) O1^s、(h) Fe2^p和(i) Cu2^p XPS谱图

  Figure 2  SEM images of (a) CuO₂ and (b) CuO₂/PB; TEM images of (c) CuO₂ and (d) CuO₂/PB; (e) FTIR spectra of CuO₂, CuO₂/PB, and CuO₂+PB; (f) XPS survey spectrum of CuO₂/PB; (g) O1^s, (h) Fe2^p, and (i) Cu2^p XPS spectra of CuO₂/PB

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  图 3  (a) CuO₂/PB在不同环境下的温度曲线; (b) 不同质量浓度CuO₂/PB在pH=5.8时的温度曲线; CuO₂/PB的(c) 光热功率图像、(d) 红外热像图、(e) 光热转换效率图像、(f) 光热循环图像

  Figure 3  (a) Temperature curves of CuO₂/PB in different environments; (b) Temperature curves of CuO₂/PB with different concentrations at pH=5.8 of CuO₂/PB; (c) Photothermal power curves, (d) infrared thermal image, (e) photothermal transfer efficiency curves, and (f) photothermal cycle image of CuO2/PB

  Conditions: (a) 0.2 mg·mL^-1, 808 nm, 1 W·cm^-2; (b) 808 nm, 1 W·cm^-2; (c) 0.2 mg·mL^-1, 808 nm; (d) 808 nm, 1 W·cm^-2, 10 min; (e) 0.2 mg·mL^-1, 808 nm, 1 W·cm^-2; (f) 0.2 mg·mL^-1, 808 nm, 1 W·cm^-2.

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  图 4  (a) 不同处理条件下KMnO₄溶液的吸收光谱图; (b) 不同处理条件下新亚铜试剂的吸收光谱图; (c) 不同环境中CuO₂/PB降解MB溶液的吸收光谱图; (d) CuO₂/PB与H₂O₂反应后上清液的吸收光谱图; (e) 在CuO₂/PB与GSH反应后的上清液加入DTNB溶液的吸收光谱图

  Figure 4  (a) Absorption spectra of KMnO₄ solutions under different treatment conditions; (b) Absorption spectra of newcuprous reagents under different treatment conditions; (c) Absorption spectra of MB solution degraded by CuO₂/PB in different environments; (d) Absorption spectra of the supernatant after the reaction of CuO₂/PB and H₂O₂; (e) Absorption spectra of the supernatant after CuO₂/PB incubated with GSH and added to DTNB solution

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  图 5  (a) 不同处理条件下4T1细胞的细胞活力; (b) CuO₂/PB处理293T细胞的细胞活力; (c) CuO₂/PB的弛豫性能(体外MRI); (d) 肿瘤部位的T₂-MRI信号强度随时间变化图; (e) 静脉注射CuO₂/PB后小鼠的体内T₂-MRI图

  Figure 5  (a) Cell viability of 4T1 cells under different treatment conditions; (b) Cell viability of 293T cells treated with CuO₂/PB; (c) Relaxation properties of CuO₂/PB (in vitro MRI); (d) T₂-MRI signal intensity changed over time at the tumor site; (e) In vivo T₂-MRI images of mice after intravenous CuO₂/PB injection

  Inset in c: T₂-MRI images of CuO₂/PB aqueous solution.

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  图 6  (a) 不同治疗组小鼠的肿瘤体积变化; (b) 小鼠的热成像图; (c) 不同治疗组小鼠的体重变化; (d) 治疗过程中小鼠的实时照片; (e) H&E染色图

  Figure 6  (a) Changes in tumor volume of mice in different treatment groups; (b) Thermal imagings of mice; (c) Weight changes of mice in different treatment groups; (d) Real-time photographs of mice during treatment; (e) H&E staining diagram

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