English

• 0.   引言

  天然酶作为高效的生物催化剂，能够在温和条件下选择性地催化各种反应，广泛应用于能源、环境、生物医药等领域。然而，天然酶成本较高、稳定性较低、回收和储存困难，限制了其更广泛的应用。与之相比，人工酶凭借低成本、优异的催化活性和高稳定性，展现出巨大的应用前景^[1-2]。迄今为止已经开发出许多类型的人工酶，包括金属配合物、生物分子、聚合物、超分子和无机纳米结构材料^[3-6]，其在生物传感、免疫分析、临床诊断、神经保护和疾病治疗等领域显示出广泛的应用前景。

  在人工酶中，基于单原子金属的纳米酶近年来引起了极大关注。当金属以单原子形态固定在载体上时，其表面自由能达到最大，从而提高了催化活性和选择性。与传统纳米酶相比，单原子纳米酶在催化活性、选择性、稳定性和生物安全性等方面都实现了突破^[7-8]。目前已经提出了多种制备高质量单原子催化剂的方法，如一锅法、热解法、湿化学法和原子层沉积法等^[9]。然而，这些合成方法通常需要特殊设备、复杂的操作或昂贵的前体，同时金属原子在合成过程中也存在自发聚集的趋势，因此单原子催化剂的制备仍面临着严峻的挑战^[10]。通过之前的报道发现，碳纳米笼(CNC)具有独特的多孔结构、大的比表面积、优异的吸附性能、高纯度以及有序框架，有利于锚定外来物质^[11]，有望在后续研究中得到应用。

  我们通过浸渍吸附法对溶液中阴离子的吸附将单原子Pt固定在多孔CNC载体上，在70 ℃下进行轻柔干燥，成功构建了以CNC为载体的单原子Pt(SA‐Pt/CNC)纳米酶。我们系统研究了所制备的SA‐Pt/CNC的类过氧化物酶活性，并结合计算机图像识别技术，探讨了其在生物传感检测领域的应用前景。

  1.   实验部分

  1.1   试剂与仪器

  CNC由实验室自制^[11]；六水合氯铂酸(H₂PtCl₆· 6H₂O)、3，3′，5，5′‐四甲基联苯胺(TMB)、维生素C (VC)、邻苯二胺(OPD)购自阿拉丁试剂有限公司；H₂O₂(30%)购自上海沃凯生物技术有限公司；辣根过氧化物酶(HRP)购自源叶生物科技有限公司。

  实验中使用的仪器包括透射电子显微镜(日立HT7700，工作电压：100 kV，灯丝电压：20 V，灯丝电流：10 μA)、场发射高分辨透射电子显微镜(FEI Talos F200X，加速电压：200 kV；样品倾斜角度：±30°)、X射线光电子能谱(Shimadzu KRA TOS Axis Supra单色化X射线源：Al Kα，最大功率：600 W，束斑300 μm×700 μm)、紫外可见分光光度计(岛津UV‐ 3600Plus，激发光：碘钨灯，300~3 300 nm)。

  1.2   SA⁃Pt/CNC的制备

  将0.5 mg的H₂PtCl₆·6H₂O溶解于5 mL超纯水中，配制成溶液待用。称取20 mg的CNC并将其分散在20 mL超纯水中制成CNC分散液。然后，将配制好的5 mL H₂PtCl₆·6H₂O溶液缓慢滴加到上述CNC分散液中，混合均匀后置于70 ℃油浴中加热12 h。将反应混合物过滤后得到黑色粉末产物，用超纯水和无水乙醇各洗涤3次，于70 ℃烘箱中干燥，即可得到所需的SA‐Pt/CNC纳米酶。

  1.3   SA⁃Pt/CNC纳米酶类过氧化物酶的活性测定

  首先配制pH值为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、7.5的醋酸-醋酸钠缓冲液、2.0 mg·mL^-1 TMB溶液(溶剂为二甲基亚砜，文中如无特别指出，溶液的溶剂均为水)、2.0 mg·mL^-1 OPD溶液、200 μg·mL^-1 SA ‐ Pt/ CNC分散液、100 ng·mL^-1 HRP溶液、100 mmol·L^-1 H₂O₂溶液。然后分别以TMB、OPD为底物检测SA‐Pt/CNC类过氧化物酶的活性：室温(298 K)下，在试管中加入0.5 mL TMB分散液或OPD溶液、0.5 mL SA‐Pt/CNC溶液、0.5 mL醋酸-醋酸钠缓冲液(pH=4) 与0.5 mL H₂O₂溶液。反应10 min后，立即使用紫外可见分光光度计检测500~800 nm区间内溶液的光吸收曲线。

  1.4   SA⁃Pt/CNC⁃VC试纸的制备

  将空白试纸(直径6 mm) 浸入TMB(0.8 mmol· L^-1)、SA ‐ Pt/CNC(0.2 mg·mL^-1) 和H₂O₂(100 mmol·L^-1) 的混合物中30 min，试纸的颜色由白色变为蓝色。取出干燥即制得SA‐Pt/CNC‐VC试纸。

  1.5   SA⁃Pt/CNC⁃VC试纸颜色与浓度相关的线性方程的确定

  分别在SA‐Pt/CNC‐VC试纸上滴加10 μL不同质量浓度(0.50、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg·mL^-1)的VC样品。静置10 min后对每张试纸进行拍照并运用Image J软件读取图像颜色信息。根据读取到的颜色数据信息，绘制VC浓度与颜色信息数据对应的关系图，确定相关线性方程。

  2.   结果与讨论

  2.1   SA⁃Pt/CNC纳米酶的制备与表征

  采用CNC作为载体，通过其吸附氯铂酸前驱体溶液中的阴离子，并在70 ℃温和条件下干燥，将单原子Pt固定在CNC的多孔结构中，成功构建了SA‐Pt/CNC纳米酶，制备路径如图 1所示。CNC作为单原子纳米酶载体的优势在于其独特的多孔结构、大的比表面积、优异的吸附性能、高纯度以及有序框架^[11-13]。丰富的多级孔道结构为单原子Pt提供了大量分散空间，有效避免了Pt单原子团聚，保持了其单原子特征。同时，这些孔道还产生了独特的空间限域效应，进一步稳定了Pt单原子的存在。另外，CNC本身纯度高、框架有序，也有利于保持整个纳米酶体系的结构稳定性。

  图 1

  

  图 1.  SA‐Pt/CNC的合成路线

  Figure 1.  Synthetic route of SA‐Pt/CNC

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  利用TEM和HRTEM表征技术对SA‐Pt/CNC纳米酶的微观结构和元素分布进行了分析。如图 2a所示，SA‐Pt/CNC呈现出均匀的立方体结构，载体主体结构的边长在10~20 nm之间。图 2b和2c为SA‐Pt/CNC的高角度环形暗场(HAADF)图，由于图中点的亮度正比于原子序数的平方，因此亮点能够反映真实的原子。由图可知，在材料的表面有大量孤立存在的Pt单原子。同时由于尺度到达原子级别后，比表面积急剧增大，导致金属表面自由能急剧增加，图像中也可观察到小部分Pt亚纳米团簇。EDS元素映射图(图 2d~2f)进一步证实了Pt单原子在CNC上的均匀分布，表明以CNC为载体的单原子纳米酶的成功合成。此外，通过对浸渍溶液反应前后Pt溶度含量的测量，我们计算出了SA‐Pt/CNC纳米酶中Pt的质量分数约为0.83%。

  图 2

  

  图 2.  SA‐Pt/CNC的(a) TEM图、(b、c) HAADF图和(d~f) EDS元素映射图

  Figure 2.  (a) TEM image, (b, c) HAADF image, and (d‐f) EDS element mappings of SA‐Pt/CNC

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  为深入分析SA‐Pt/CNC纳米酶表面的元素组成和化学价态分布，采用XPS技术进行表征。如图 3a所示，XPS全谱图证实SA‐Pt/CNC主要由C和Pt元素组成，C为主体元素。值得注意的是，531.0 eV处出现了一个弱O1s峰，这来源于材料表面氧空位吸附的氧物种，从侧面说明了纳米酶表面存在氧吸附位点。这些吸附位点可能有助于吸附分子(如H₂O₂) 的H—O键的解离。图 3b为Pt4f内层电子结合能谱图。Pt4f_7/2和Pt4f_5/2峰分别位于71.9和75.0 eV附近，表明Pt元素以零价为主，同时还存在少量+2价态。这一结果证实了Pt在纳米酶表面主要以单原子形式分散，同时也存在少量氧化形式。

  图 3

  

  图 3.  SA‐Pt/CNC的(a) XPS全谱图和(b) Pt4f XPS谱图

  Figure 3.  (a) XPS survey spectrum and (b) Pt4f XPS spectrum of SA‐Pt/CNC

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  2.2   SA⁃Pt/CNC纳米酶类过氧化物酶活性

  过氧化物酶是一类能催化过氧化物分解反应的酶，其应用广泛，在临床诊断、食品工业、医药工业、环境监测、生物技术和生物燃料电池等领域中发挥多种重要作用，包括作为生物标志物、食品加工改良剂、药物制备辅助工具、环境污染监测工具、生物技术的组成部分以及生物燃料电池的催化剂等^[14-15]。为了研究SA‐Pt/CNC的类过氧化物酶活性，以TMB为底物，检测在SA ‐Pt/CNC存在的条件下TMB被H₂O₂氧化生成明亮蓝色物质的情况。从图 4a、4b中可以看出，H₂O₂+TMB体系最终呈现出近无色透明的状态，652 nm处的极弱吸收峰说明该条件下TMB发生了极其少量的氧化反应；SA‐Pt/CNC+ H₂O₂+TMB体系呈现出显著的蓝色，这说明SA‐Pt/ CNC可以有效地催化H₂O₂氧化TMB，具有较高类过氧化物酶活性。为了进一步证实SA‐Pt/CNC的类过氧化物酶活性，我们又使用了OPD作为底物进行测试。图 4b结果表明只有SA‐Pt/CNC+H₂O₂+OPD体系明显生成了氧化产物，与TMB底物测试结果一致。

  图 4

  

  图 4.  底物为(a) TMB和(c) OPD时SA‐Pt/CNC的类过氧化物酶活性以及(b) 对应a的比色反应

  Figure 4.  Peroxidase‐like activity of SA‐Pt/CNC under substrates (a) TMB and (c) OPD and (b) colorimetric reactions corresponding to a

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  与天然酶HRP类似，SA‐Pt/CNC纳米酶的类过氧化物酶活性也对pH值和底物浓度十分敏感。如 图 5a所示(混合物中TMB、H₂O₂、SA‐Pt/CNC浓度分别为0.8 mg·mL^-1、25 mmol·L^-1、50 μg·mL^-1，293 K)，SA‐Pt/CNC和HRP的酶活性随pH值变化的趋势相似，均在中性条件下活性最低，而在pH=4左右达到最高。这表明SA‐Pt/CNC在pH=2~5范围内具有较高的类过氧化物酶催化活性。因此，后续研究反应体系其他影响因素时，均采用pH=4的缓冲溶液。图 5b显示(保持pH=4，混合物中H₂O₂、SA‐Pt/CNC的浓度分别为25 mmol·L^-1、50 μg·mL^-1，293 K)，当底物TMB浓度在0.2~2.0 mmol·L^-1范围内，SA‐Pt/CNC和HRP的相对酶活性均随TMB浓度升高而增加，说明TMB浓度对二者的催化活性影响基本一致。 图 5c(保持pH=4，混合物中TMB、H₂O₂、SA‐Pt/CNC的浓度分别为0.8 mg·mL^-1、25 mmol·L^-1、50 μg·mL^-1)是反应温度对两者相对酶活性的影响。由于HRP属天然蛋白质酶，在低温和高温条件下均会失活，其最佳活性温度约为293 K。而SA‐Pt/CNC作为无机纳米酶，其类过氧化物酶活性主要源自材料表面Pt原子，且活性随温度升高而逐渐增强，并在333 K后仍呈上升趋势。这说明SA‐Pt/CNC能够在较高温度下保持较强的催化活性和稳定性，体现出比天然酶更优异的热稳定性能。

  图 5

  

  图 5.  SA‐Pt/CNC与HRP在不同条件下的活性比较

  (a) pH; (b) TMB concentration; (c) Temperature.

  Figure 5.  Comparison of activity between SA‐Pt/CNC and HRP under different conditions

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  2.3   SA⁃Pt/CNC的酶促反应动力学分析

  通过改变H₂O₂的浓度研究了SA‐Pt/CNC纳米酶的酶促反应动力学。在相同的实验条件下(pH=4，室温)测试H₂O₂的浓度对SA‐Pt/CNC的酶促TMB氧化反应速率的影响。如图 6a所示，酶促反应的初始反应速率(v)随着底物H₂O₂的浓度(c)升高而增大，并且v^-1与c^-1成正比关系(图 6b)，表明SA‐Pt/CNC的酶促反应动力学过程遵循典型的Michaelis‐Menten方程：

  图 6

  

  图 6.  (a) H₂O₂浓度对初始反应速率的影响及(b) 相应的双倒数曲线

  Figure 6.  (a) Effect of H₂O₂ concentration on the initial reaction rate and (b) corresponding double reciprocal curve

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  $ v=v_{\max } c /\left(K_{\mathrm{m}}+c\right) $

  (1)

  其中v为初始速率(mmol·L^-1·s^-1)，v_max为最大反应速率(mmol·L^-1·s^-1)，K_m为米氏常数(mmol·L^-1)。

  将反应速率和底物浓度代入Michaelis‐Menten方程，计算相对应的K_m。如表 1所示，SA‐Pt/CNC的K_m(3.01 mmol·L^-1)小于HRP(K_m=3.70 mmol·L^-1)，说明 SA‐Pt/CNC比HRP对H₂O₂有更相近的亲和力。催化常数(K_cat)是在底物浓度处于饱和状态下，衡量一个酶催化一个反应快慢的参数，其等于最大反应速率除以总的酶浓度。计算得出SA ‐ Pt/CNC的K_cat是HRP的6.6倍，表明SA‐Pt/CNC作为类过氧化物酶具有较高的催化活性。考虑到CNC的多孔性，SA‐Pt/ CNC对H₂O₂的吸附更多，其与底物结合得更牢固。因此，SA‐Pt/CNC比HRP对底物H₂O₂具有更强的亲和力，进而有利于催化反应的进行。

  表 1

  

  表 1  SA⁃Pt/CNC与HRP动力学参数对比

  Table 1.  Comparison of kinetic parameters between SA⁃Pt/CNC and HRP

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  Enzyme	Substrate	cE* / (mmol·L-1)	Km / (mmol·L-1)	vmax / (mmol·L-1·s-1)	Kcat / s-1	Ref.
  SA‐Pt/CNC	H2O2	2.13×10-6	3.01	4.86×10-2	2.28×104	This work
  HRP	H2O2	2.50×10-8	3.70	8.71×10-5	3.48×103	[16]
  *The concentration of nanozyme.

  2.4   SA-Pt/CNC纳米酶的类过氧化物酶活性的应用

  VC是一种对人体至关重要的水溶性维生素，在增强免疫系统、促进铁吸收以及合成胶原蛋白等方面发挥着关键作用^[17]。因此，准确检测食品中VC的含量极为必要。虽然分光光度法广泛应用于科研和工业领域，但在民用场景由于仪器和操作限制，VC的检测通常只能通过肉眼比色进行定性和粗略定量分析，缺乏准确性。为解决此问题，我们基于SA‐Pt/CNC纳米酶的类过氧化物酶活性，开发了一种结合计算机视觉识别的准确测量VC的新方法。该方法将单原子纳米酶的高效催化性能与Image J的强大图像处理能力结合，使检测过程更便捷、更精准。

  如图 7所示，首先使用SA‐Pt/CNC纳米酶、H₂O₂和显色剂TMB构建催化反应体系，并制备蓝色试纸用于VC浓度检测。随后，通过Image J建立试纸颜色与VC浓度之间的定量关系曲线，并基于此开发便携式测试APP(APP代码见附件，Supporting infor‐ mation)。在实际操作中，测试者只需使用智能手机拍摄试纸照片并上传，即可快速获取VC浓度。

  图 7

  

  图 7.  SA‐Pt/CNC纳米酶检测VC的示意图

  Figure 7.  Schematic diagram of SA‐Pt/CNC nanozyme detection for VC

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  图 8展示了不同浓度VC滴加到蓝色试纸上1 min后，通过普通智能手机采集的试纸图像。图 9则给出了经Image J处理后获得的颜色数值与VC浓度之间的线性关系曲线，该曲线关系函数可被嵌入到便携式测试APP软件中，最终实现VC的实时检测。该新方法将单原子纳米酶的优异催化性能、智能手机的便携性和计算机视觉技术有机结合，为快速、便携、准确地检测食品中的VC含量提供了全新解决途径，具有重要的应用价值。

  图 8

  

  图 8.  不同浓度的VC样品在试纸上呈现的颜色照片

  Figure 8.  Color photos of VC samples with different concentrations presented on test strips

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  图 9

  

  图 9.  VC的浓度与颜色强度对应的线性图

  Figure 9.  Linear graph of the concentration and color intensity of VC

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  3.   结论

  采用浸渍吸附法成功制备了一种基于CNC载体的单原子Pt纳米酶(SA ‐ Pt/CNC)，通过TEM、HRTEM、XPS等对该单原子纳米酶的结构进行了表征，并系统研究了其类过氧化物酶活性。进一步的酶促反应动力学分析揭示，相较于天然酶，SA‐Pt/ CNC纳米酶展现出更优越的酶效应和更广泛的适用范围。基于SA‐Pt/CNC纳米酶的类过氧化物酶活性，提出了一种新型的可用于VC浓度检测的方法，对比传统方法，该方法大大提升了读数的便捷性和准确性。

  Supporting information is available at http://www.wjhxxb.cn

  
  
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  图 1  SA‐Pt/CNC的合成路线

  Figure 1  Synthetic route of SA‐Pt/CNC

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  图 2  SA‐Pt/CNC的(a) TEM图、(b、c) HAADF图和(d~f) EDS元素映射图

  Figure 2  (a) TEM image, (b, c) HAADF image, and (d‐f) EDS element mappings of SA‐Pt/CNC

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  图 3  SA‐Pt/CNC的(a) XPS全谱图和(b) Pt4f XPS谱图

  Figure 3  (a) XPS survey spectrum and (b) Pt4f XPS spectrum of SA‐Pt/CNC

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  图 4  底物为(a) TMB和(c) OPD时SA‐Pt/CNC的类过氧化物酶活性以及(b) 对应a的比色反应

  Figure 4  Peroxidase‐like activity of SA‐Pt/CNC under substrates (a) TMB and (c) OPD and (b) colorimetric reactions corresponding to a

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  图 5  SA‐Pt/CNC与HRP在不同条件下的活性比较

  Figure 5  Comparison of activity between SA‐Pt/CNC and HRP under different conditions

  (a) pH; (b) TMB concentration; (c) Temperature.

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  图 6  (a) H₂O₂浓度对初始反应速率的影响及(b) 相应的双倒数曲线

  Figure 6  (a) Effect of H₂O₂ concentration on the initial reaction rate and (b) corresponding double reciprocal curve

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  图 7  SA‐Pt/CNC纳米酶检测VC的示意图

  Figure 7  Schematic diagram of SA‐Pt/CNC nanozyme detection for VC

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  图 8  不同浓度的VC样品在试纸上呈现的颜色照片

  Figure 8  Color photos of VC samples with different concentrations presented on test strips

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  图 9  VC的浓度与颜色强度对应的线性图

  Figure 9  Linear graph of the concentration and color intensity of VC

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  表 1  SA⁃Pt/CNC与HRP动力学参数对比

  Table 1.  Comparison of kinetic parameters between SA⁃Pt/CNC and HRP

  Enzyme	Substrate	cE* / (mmol·L-1)	Km / (mmol·L-1)	vmax / (mmol·L-1·s-1)	Kcat / s-1	Ref.
  SA‐Pt/CNC	H2O2	2.13×10-6	3.01	4.86×10-2	2.28×104	This work
  HRP	H2O2	2.50×10-8	3.70	8.71×10-5	3.48×103	[16]
  *The concentration of nanozyme.

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