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• 次氯酸(HClO)/次氯酸盐(ClO^-)在日常生活中广原平衡等众多生理过程发挥着重要作用^[2]。但ClO^-泛用作漂白剂和消毒剂^[1]。同时，ClO^-也是一种重要浓度失衡会引发动脉粥样硬化、肺损伤、神经元变的生物活性氧物种(ROS)，在细胞信号传导和氧化还性、关节炎甚至癌症等多种恶性疾病^[3]。因此，生物样本中ClO^-的实时检测具有重要意义，有助于理解ClO^-的生理功能及其在相关疾病中扮演的角色。

  常用的检测ClO^-的方法包括高效液相色谱(HPLC)、表面增强拉曼光谱(SERS)、毛细管电泳(CE)、电化学分析和紫外可见光谱等，其中基于荧光探针的荧光分析技术因其灵敏度高、响应快速和实时无损成像等诸多优点受到广泛关注^[4]。近年来，针对ClO^-的荧光探针取得了一定进展，设计策略通常是以硫族化合物^[5-8]、C=C^[9-11]、螺内酰胺^[12-14]、脲^[15-17]和C=N^[18-27]等为识别基团，利用ClO^-的强氧化性对识别基团进行氧化而引起探针的荧光变化，达到检测的目的。其中，以C=N为官能团的席夫碱荧光探针制备简便且易结晶纯化，因而备受青睐^[23]。席夫碱荧光探针由于亚胺异构化或光诱导电子转移(PET)过程，通常荧光微弱；ClO^-的氧化作用能够导致席夫碱分解产生相应的荧光活性醛或者酸^{[24, 26]}，便于建立ClO^-的定量分析方法。

  苯并色烯衍生物是一类重要的含氧杂环化合物，在配位化学、发光材料和荧光探针等领域有广泛的应用^[28-29]。我们使用苯并色烯‐2‐甲醛(1a)和二氨基马来腈缩合制备了席夫碱探针1(图 1)，并通过单晶X射线衍射等手段表征了其结构。探针1在近纯水体系中荧光微弱，其与ClO^-作用后在530 nm处的荧光发射显著增强。探针1对ClO^-检测选择性优异、灵敏度高且响应快速。通过质谱和理论计算推测了探针对ClO^-的传感机理。此外，探针1还成功用于活细胞、斑马鱼和拟南芥中ClO^-的荧光分析。

  图 1

  

  图 1.  探针1的合成路线图

  Figure 1.  Synthetic route of probe 1

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  1.   实验部分

  1.1   试剂与仪器

  用于合成的起始原料和溶剂均是商业购买直接使用，未进行纯化。化合物 1a参考文献方法合成^[29]。光谱性质测试中，所有溶剂为光谱纯试剂，水为超纯水。元素分析在Vario EL元素分析仪上进行。核磁共振光谱在Bruker AV400 NMR核磁共振仪上室温下测得；ESI ‐ MS谱图在Bruker Daltonics Esquire 6000质谱仪上获得。荧光光谱在Varian CARY Eclipse分光光度计上测定。UV光谱用Purkinje General TU‐1800分光光度计记录。pH值在上海雷磁pHS‐3C上测定。细胞、斑马鱼和拟南芥成像在蔡司LSM880共聚焦激光扫描显微仪上完成。紫外可见和荧光光谱数据用Origin软件包处理。

  1.2   探针1的合成

  探针1的合成路线如图 1所示。将1a(2.10 g，10 mmol)和二氨基马来腈(1.08 g，10 mmol)溶于无水乙醇(50 mL)中，加入2滴冰醋酸后加热回流，用薄层色谱监测直至反应完全。减压蒸馏除去溶剂，用95% 乙醇重结晶，得到探针1。¹H NMR (400 MHz，DMSO ‐ d₆)：δ 8.21~8.23(d，J=8.4 Hz，1H，Ar ‐ H)，8.17 (s，1H，CH=N)，8.13(s，1H，Ar‐H)，7.89(s，2H，NH₂)，7.87(s，2H，Ar‐H)，7.57~7.60(t，J=7.2 Hz，1H，Ar‐H)，7.41~7.45(t，J=7.2 Hz，1H，Ar‐H)，7.16~7.18(d，J=8.4 Hz，1H，Ar‐H)，5.27(s，2H，CH₂)。13C NMR(101 MHz, DMSO ‐ d₆)：δ 154.31, 153.70, 132.41, 130.47, 130.24, 129.85, 129.50, 129.08，128.04，126.71，124.82, 122.25, 117.92, 115.76, 114.96，114.15，103.68，64.43。元素分析(C₁₈H₁₂N₄O) 计算值(%)：C：71.99；H：4.03；N：18.66。实验值(%)：C：72.06；H：3.96；N：18.54。ESI‐ MS([M+H]+)：m/z=301.109 3(计算值：301.108 9)。

  1.3   探针1的光谱性质测试

  探针1用DMSO配成1 mmol·L^-1的储备液，测试前使用磷酸盐缓冲溶液(PBS，20 mmol·L^-1，pH 7.4) 稀释原液，配制成浓度为10 μmol·L^-1的探针溶液(DMSO/H₂O，体积比1∶99)。选择性和竞争性响应测试中所用ROS参考文献配制^[30]。荧光光谱测试中激发波长为395 nm，激发和发射狭缝宽度分别为5和10 nm。

  1.4   晶体结构测定

  将探针1重结晶得到适合单晶衍射分析的橘色片状单晶。选取尺寸为0.20 mm×0.18 mm×0.06 mm的探针1晶体，置于Bruker APEX Ⅱ CCD单晶衍射仪上，在室温下进行单晶X射线衍射分析。采用经石墨单色化的Mo Kα射线(λ=0.071 073 nm) 作为衍射光源。采用SHELXT程序^[31]对探针1的晶体结构进行解析并用SHELXL程序^[32]对各原子坐标和温度因子进行精修，氢原子坐标均由理论加氢确定。探针1的晶体学数据见表 1。

  表 1

  

  表 1  探针1的晶体学数据

  Table 1.  Crystallographic data of probe 1

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  Parameter	1		Parameter	1
  Empirical formula	C18H12N4O		F(000)	624
  Formula weight	300.32		Z	4
  Temperature / K	293(2)		Dc / (Mg·m-3)	1.414
  Crystal system	Monoclinic		μ / mm-1	0.092
  Space group	P21/c		θ range / (°)	2.255‐24.992
  a / nm	0.864 8(8)		Independent reflection (Rint)	1 761 (0.027 1)
  b / nm	1.283 0(10)		Observed reflection [I > 2σ(I)]	2 485
  c / nm	1.287 0(11)		Goodness‐of‐fit on F2	1.023
  β/(°)	98.97(3)		Final R indices [I > 2σ(I)]	R1=0.044 7, wR2=0.113 0
  V / nm3	1.411(2)		R indices (all data)	R1=0.066 4, wR2=0.126 5

  1.5   生物成像实验

  细胞成像实验选用巨噬细胞(RAW 264.7)为研究对象。在RAW 264.7细胞的培养皿中分别加入浓度为0、10、20、30和40 μmol·L^-1的探针1，37 ℃下培养24 h后，通过MTT法评价探针的细胞毒性^[33]。使用包含探针1(10 μmol·L^-1) 的培养基孵育RAW 264.7细胞30 min，激光共聚焦成像。培养基中随后加入ClO^- (20 μmol·L^-1)孵育30 min后，再次进行成像。RAW 264.7细胞用脂多糖(LPS，5 μg·mL^-1)和佛波酯(PMA，5 μg·mL^-1)孵育2 h，然后与10 μmol·L^-1探针1一起孵育30 min，激光共聚焦成像。细胞用LPS(5 μg·mL^-1)和PMA(5 μg·mL^-1)孵育2 h，再使用N‐乙酰半胱氨酸(NAC，600 μmol·L^-1)孵育2 h，然后与10 μmol·L^-1探针1孵育30 min，激光共聚焦成像。激发波长405 nm，绿色通道光谱波长范围为490~ 571 nm。

  活体成像实验采用斑马鱼考察探针1对ClO^-的识别能力。2日龄斑马鱼培养液中加入探针1(10 μmol·L^-1)孵育1 h，激光共聚焦成像，之后再加入ClO^-(20 μmol·L^-1)孵育1 h，再次进行成像。斑马鱼用LPS(5 μg·mL^-1)和PMA(5 μg·mL^-1)孵育2 h，然后用探针1(10 μmol·L^-1)孵育1 h，激光共聚焦成像。斑马鱼用LPS(5 μg·mL^-1)和PMA(5 μg·mL^-1)孵育2 h，再使用NAC(600 μmol·L^-1) 孵育2 h，然后与10 μmol·L^-1探针1孵育1 h，激光共聚焦成像。

  植物成像实验在拟南芥根尖上进行。用探针1 (10 μmol·L^-1)处理拟南芥30 min，对根尖激光共聚焦成像。用探针1(10 μmol·L^-1)预处理的拟南芥分别在含20和50 μmol·L^-1的ClO^-培养液中培养30 min，对根尖激光共聚焦成像。

  2.   结果与讨论

  2.1   探针1的晶体结构

  探针1的晶体结构椭球图见图 2。该晶体属于单斜晶系，晶体的空间群为P2₁/c。探针1中N1— C14键长为0.127 1(2) nm，证明席夫碱亚胺键的形成。除sp²杂化的C13原子外，探针1的其它非氢原子几乎共面，说明分子中存在良好的共轭效应。

  图 2

  

  图 2.  探针1的30% 概率水平的晶体结构椭球图

  Figure 2.  Crystal structure of probe 1 drawn at 30% ellipse probability level

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  2.2   探针1对ClO^-的荧光识别

  对探针1进行详细表征后，利用荧光光谱研究探针对ClO^-的特异性识别。如图 3a所示，395 nm激发下，探针1溶液(10 μmol·L^-1)几乎无荧光；加入ClO^- (50 μmol·L^-1)后在530 nm处出现强荧光发射峰，365 nm紫外灯下探针溶液颜色由暗变绿(图 3a插图)。而加入其它代表性阳离子(Ca²⁺、Cu²⁺、Fe³⁺、Mg²⁺、Na⁺)、阴离子(Cl^-、HS^-、NO₃^-、SO₄^2-)、生物硫醇(半胱氨酸、同型半胱氨酸、谷胱甘肽，缩写分别为Cys、Hcy、GSH)和活性氧(H₂O₂、ONOO^-、·OH、¹O₂)后，探针荧光发射几乎不变(图 3b)。同时，其它潜在干扰物(50 μmol·L^-1)共存对1+ClO^-的荧光发射无明显影响，表明探针1对ClO^-的荧光开启识别具有良好的选择性。

  图 3

  

  图 3.  (a) 探针1和加入50 μmol·L^-1不同分析物后的荧光发射谱，插图表示紫外灯照射下探针1溶液加入ClO^-前后荧光颜色变化; (b) 50 μmol·L^-1共存潜在干扰物对探针1和1+ClO^-在530 nm处荧光强度的影响; (c) 不同浓度ClO^-存在时探针1的荧光光谱; (d) 探针1在530 nm处荧光强度与ClO^-浓度的线性关系

  Figure 3.  (a) Fluorescence spectra of probe 1 before and after adding different analytes (50 μmol·L^-1), where the inset shows the fluorescence color change of probe 1 solution with and without ClO^-; (b) Influence of co‐existence of potential competitive analytes (50 μmol·L^-1) on the emission intensity of probe 1 and 1+ClO^- at 530 nm; (c) Fluorescence spectra of 1 in the presence of different concentrations of ClO^-; (d) Linear relationship between fluorescence intensity of probe 1 at 530 nm with the concentration of ClO^-

  In figure b: 1: blank, 2: Ca²⁺, 3: Cu²⁺, 4: Fe³⁺, 5: Mg²⁺, 6: Na⁺, 7: Cl^-, 8: HS^-, 9: NO₃^-, 10: SO₄^2-, 11: Cys, 12: Hcy, 13: GSH, 14: H₂O₂, 15: ONOO^-, 16: ·OH, 17: ¹O₂.

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  之后，我们考察了不同浓度ClO^-对探针1荧光光谱的影响。如图 3c所示，随着ClO^-浓度的梯度增加，探针1在530 nm处的荧光强度逐渐增强。当ClO^-加入量达到50 μmol·L^-1时体系荧光发射强度趋于稳定。数据拟合结果表明(图 3d)，探针在530 nm处的荧光强度和ClO^-浓度在7.5~50.0 μmol·L^-1范围内线性相关(R²=0.992)，表明探针1可以定量检测ClO^-。经计算得出检出限LOD=0.32 μmol·L^-1 (LOD=3σ/k，其中σ指空白标准偏差，k是线性方程的斜率)，与已报道的部分席夫碱类ClO^-荧光探针相当^[24]，说明探针1对ClO^-具有较高的灵敏度，可用于低浓度ClO^-的灵敏定量检测。

  此外，探讨了探针1对ClO^-的响应时间。如图S1 (Supporting information)所示，探针1溶液中加入50 μmol·L^-1的ClO^-溶液后，其530 nm处的荧光强度立即增强并在20 s内达到峰值，表明探针可以实时检测ClO^-。图S2表明，探针1和1+ClO^-在530 nm处荧光强度在2.0~13.0的pH范围内基本保持稳定，且二者间巨大的荧光差异证实探针检测ClO^-的工作pH范围较宽，有望用于复杂生物样品中ClO^-的便捷检测。

  2.3   探针1与ClO^-的作用机理

  通过ESI‐MS实验证实了探针1与ClO^-的反应模式。如图 4a所示，探针1的甲醇溶液中加入ClO^-后，在m/z 211.073 9处出现归属于苯并色烯‐2‐甲醛(1a) 的[M+H]⁺离子峰(m/z 211.067 1，计算值211.075 9)。结合文献关于ClO^-诱导的亚胺键断裂的报道^[27]，我们推测ClO^-促使探针1水解，生成相应的1a，从而发射其特征绿色荧光。

  图 4

  

  图 4.  (a) 化合物1a及探针1加ClO^-前后的ESI‐MS谱图; (b) DFT计算优化的探针1和化合物1a的结构及HOMO/LUMO

  Figure 4.  (a) ESI‐MS spectra of compound 1a and 1 with and without ClO^-; (b) Optimized structures and HOMO/LUMO of 1 and 1a by DFT calculation

  The inset shows the possible reaction mechanism between probe 1 and ClO^-.

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  利用密度泛函理论(DFT)计算优化了探针1的结构，并与已经报道的1a的结构^[34]进行了比对(图 4b)。计算结果表明，探针1和1a的HOMO和LUMO电子云均分散在整个分子，表明2个分子中存在明显的共轭效应。但探针1的末端胺基表现出光诱导电子转移(PET)作用，从而猝灭其荧光发射。1a分子内不仅没有PET效应，而且呈现显著的聚集诱导发光(AIE)活性^[34]，故探针与ClO^-作用后发射显著的绿色荧光。上述结果证实了图 4a插图所示的ClO^-诱导的探针1的分解反应模式。

  2.4   探针1的生物成像应用

  细胞成像实验前，采用MTT法确定探针的细胞毒性。梯度浓度的探针1(0~40 μmol·L^-1)分别与RAW 264.7细胞孵化24 h，结果表明40 μmol·L^-1的探针1与细胞孵化后细胞存活率仍高于80%(图S3)，充分证实探针1具有较低的细胞毒性，可用于生物成像应用。

  之后，我们测试了探针1对细胞内ClO^-的荧光成像。如图 5和S4所示，孵化探针1(10 μmol·L^-1)的RAW 264.7细胞在绿色通道呈现微弱荧光；细胞继续孵化ClO^-(50 μmol·L^-1)，细胞内绿色通道荧光明显增强；预孵化细胞内源性ClO^-刺激剂LPS(5 μg· mL^-1) 和PMA(5 μg·mL^-1)的细胞再孵化探针，绿色通道荧光信号显著；而预孵化LPS(5 μg·mL^-1)和PMA (5 μg·mL^-1)的细胞，再孵化抗氧剂NAC(600 μmol· L-1)，最后孵化探针(10 μmol·L^-1)，绿色通道荧光信号微弱。因此，探针1能够检测细胞内源性和外源性ClO^-。

  图 5

  

  图 5.  RAW 264.7细胞共聚焦荧光图像: (a) 37 ℃下, 10 μmol·L^-1探针1孵化细胞30 min; (b) 孵化探针的细胞加入50 μmol·L^-1的ClO^-继续孵化30 min; (c) LPS (5 μg·mL^-1)和PMA (5 μg·mL^-1)孵化细胞2 h，再加入10 μmol·L^-1探针1继续孵化30 min; (d) 37 ℃下LPS (5 μg·mL^-1)和PMA (5 μg·mL^-1)孵化细胞2 h，再加入NAC (600 μmol·L^-1) 孵化2 h，最后加入10 μmol·L^-1探针1继续孵化30 min

  Figure 5.  Confocal fluorescence images of RAW 264.7 cells: (a) cells incubated with 10 μmol·L^-1 of probe 1 for 30 min at 37 ℃; (b) cells incubated with probe 1, and then with 50 μmol·L^-1 of ClO^- for another 30 min; (c) cells incubated with LPS (5 μg·mL^-1) and PMA (5 μg·mL^-1) for 2 h, and then with 10 μmol·L^-1 of probe 1 for another 30 min; (d) cells incubated with LPS (5 μg·mL^-1) and PMA (5 μg·mL^-1) for 2 h at 37 ℃, then with NAC (600 μmol·L^-1) for 2 h, and finally with 10 μmol·L^-1 of probe 1 for 30 min

  Scale bar: 10 μm.

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  斑马鱼成像结果表明，孵化探针1(10 μmol·L^-1) 的斑马鱼腹腔荧光微弱；继续孵化ClO^-(50 μmol· L-1)，或先孵化LPS(5 μg·mL^-1)和PMA(5 μg·mL^-1)再孵化探针的斑马鱼腹腔发射强绿色荧光；而顺序孵化LPS(5 μg·mL^-1)/PMA(5 μg·mL^-1) 和NAC(600 μmol·L^-1)的细胞，再孵化探针(10 μmol·L^-1)，绿色通道荧光信号微弱(图 6和S5)。因此，探针1能够检测斑马鱼体内ClO^-浓度变化。类似地，拟南芥使用探针处理，其根尖发射弱的绿色荧光；继续使用不同浓度ClO^-培养，绿色通道呈现浓度依赖的荧光信号增强(图 7和S6)，表明探针可以检测植物组织中的ClO^-。因此，探针1可用于多种生物样本中ClO^-浓度变化的监测。

  图 6

  

  图 6.  斑马鱼共聚焦荧光图像: (a) 37 ℃下, 10 μmol·L^-1探针1孵化斑马鱼1 h; (b) 孵化探针的斑马鱼加入50 μmol·L^-1的ClO^-继续孵化1 h; (c) 37 ℃下LPS (5 μg·mL^-1)和PMA (5 μg·mL^-1)孵化斑马鱼2 h，再加入10 μmol·L^-1探针1继续孵化1 h; (d) 37 ℃下LPS (5 μg·mL^-1)和PMA (5 μg·mL^-1)孵化斑马鱼2 h，再加入NAC (600 μmol·L^-1)孵化2 h, 最后加入10 μmol·L^-1探针1继续孵化1 h

  Figure 6.  Confocal fluorescence images of zebrafish: (a) zebrafish incubated with 10 μmol·L^-1 of probe 1 for 1 h at 37 ℃; (b) zebrafish incubated with probe 1, and then with 50 μmol·L^-1 of ClO^- for another 1 h; (c) zebrafish incubated with LPS (5 μg·mL-1) and PMA (5 μg·mL-1) for 2 h at 37 ℃, and then with 10 μmol·L^-1 of probe 1 for another 1 h; (d) zebrafish incubated with LPS (5 μg·mL-1) and PMA (5 μg·mL-1) for 2 h at 37 ℃, then with NAC (600 μmol·L^-1) for 2 h, and finally with 10 μmol·L^-1 of probe 1 for 1 h

  Scale bar: 200 μm.

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  图 7

  

  图 7.  拟南芥根尖共聚焦荧光图像: (a) 拟南芥用10 μmol·L^-1探针1培养30 min; 探针处理的拟南芥再分别使用(b) 20 μmol·L^-1和(c) 50 μmol·L^-1的ClO^-继续培养30 min

  Figure 7.  Confocal fluorescence images of Arabidopsis thaliana root tips: (a) Arabidopsis thaliana treated with 10 μmol·L^-1 of probe 1 for 30 min; Arabidopsis thaliana treated with 10 μmol·L^-1 of probe 1 for 30 min, and then with (b) 20 μmol·L^-1 and (c) 50 μmol·L^-1 of ClO^- for another 30 min

  Scale bar: 50 μm.

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  3.   结论

  以苯并色烯‐2‐甲醛和二氨基马来腈为原料，通过简单的席夫碱缩合构建了荧光探针1。探针在富水体系中荧光微弱，其选择性地与ClO^-作用后绿色荧光显著增强，可用于ClO^-的荧光开启检测。通过质谱和理论计算验证了ClO^-介导的探针分解反应机理。此外，探针成功用于RAW 264.7细胞、斑马鱼和拟南芥内ClO^-水平的荧光成像，具有潜在广泛的应用前景。

  Supporting information is available at http://www.wjhxxb.cn

  
  
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  图 1  探针1的合成路线图

  Figure 1  Synthetic route of probe 1

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  图 2  探针1的30% 概率水平的晶体结构椭球图

  Figure 2  Crystal structure of probe 1 drawn at 30% ellipse probability level

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  图 3  (a) 探针1和加入50 μmol·L^-1不同分析物后的荧光发射谱，插图表示紫外灯照射下探针1溶液加入ClO^-前后荧光颜色变化; (b) 50 μmol·L^-1共存潜在干扰物对探针1和1+ClO^-在530 nm处荧光强度的影响; (c) 不同浓度ClO^-存在时探针1的荧光光谱; (d) 探针1在530 nm处荧光强度与ClO^-浓度的线性关系

  Figure 3  (a) Fluorescence spectra of probe 1 before and after adding different analytes (50 μmol·L^-1), where the inset shows the fluorescence color change of probe 1 solution with and without ClO^-; (b) Influence of co‐existence of potential competitive analytes (50 μmol·L^-1) on the emission intensity of probe 1 and 1+ClO^- at 530 nm; (c) Fluorescence spectra of 1 in the presence of different concentrations of ClO^-; (d) Linear relationship between fluorescence intensity of probe 1 at 530 nm with the concentration of ClO^-

  In figure b: 1: blank, 2: Ca²⁺, 3: Cu²⁺, 4: Fe³⁺, 5: Mg²⁺, 6: Na⁺, 7: Cl^-, 8: HS^-, 9: NO₃^-, 10: SO₄^2-, 11: Cys, 12: Hcy, 13: GSH, 14: H₂O₂, 15: ONOO^-, 16: ·OH, 17: ¹O₂.

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  图 4  (a) 化合物1a及探针1加ClO^-前后的ESI‐MS谱图; (b) DFT计算优化的探针1和化合物1a的结构及HOMO/LUMO

  Figure 4  (a) ESI‐MS spectra of compound 1a and 1 with and without ClO^-; (b) Optimized structures and HOMO/LUMO of 1 and 1a by DFT calculation

  The inset shows the possible reaction mechanism between probe 1 and ClO^-.

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  图 5  RAW 264.7细胞共聚焦荧光图像: (a) 37 ℃下, 10 μmol·L^-1探针1孵化细胞30 min; (b) 孵化探针的细胞加入50 μmol·L^-1的ClO^-继续孵化30 min; (c) LPS (5 μg·mL^-1)和PMA (5 μg·mL^-1)孵化细胞2 h，再加入10 μmol·L^-1探针1继续孵化30 min; (d) 37 ℃下LPS (5 μg·mL^-1)和PMA (5 μg·mL^-1)孵化细胞2 h，再加入NAC (600 μmol·L^-1) 孵化2 h，最后加入10 μmol·L^-1探针1继续孵化30 min

  Figure 5  Confocal fluorescence images of RAW 264.7 cells: (a) cells incubated with 10 μmol·L^-1 of probe 1 for 30 min at 37 ℃; (b) cells incubated with probe 1, and then with 50 μmol·L^-1 of ClO^- for another 30 min; (c) cells incubated with LPS (5 μg·mL^-1) and PMA (5 μg·mL^-1) for 2 h, and then with 10 μmol·L^-1 of probe 1 for another 30 min; (d) cells incubated with LPS (5 μg·mL^-1) and PMA (5 μg·mL^-1) for 2 h at 37 ℃, then with NAC (600 μmol·L^-1) for 2 h, and finally with 10 μmol·L^-1 of probe 1 for 30 min

  Scale bar: 10 μm.

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  图 6  斑马鱼共聚焦荧光图像: (a) 37 ℃下, 10 μmol·L^-1探针1孵化斑马鱼1 h; (b) 孵化探针的斑马鱼加入50 μmol·L^-1的ClO^-继续孵化1 h; (c) 37 ℃下LPS (5 μg·mL^-1)和PMA (5 μg·mL^-1)孵化斑马鱼2 h，再加入10 μmol·L^-1探针1继续孵化1 h; (d) 37 ℃下LPS (5 μg·mL^-1)和PMA (5 μg·mL^-1)孵化斑马鱼2 h，再加入NAC (600 μmol·L^-1)孵化2 h, 最后加入10 μmol·L^-1探针1继续孵化1 h

  Figure 6  Confocal fluorescence images of zebrafish: (a) zebrafish incubated with 10 μmol·L^-1 of probe 1 for 1 h at 37 ℃; (b) zebrafish incubated with probe 1, and then with 50 μmol·L^-1 of ClO^- for another 1 h; (c) zebrafish incubated with LPS (5 μg·mL-1) and PMA (5 μg·mL-1) for 2 h at 37 ℃, and then with 10 μmol·L^-1 of probe 1 for another 1 h; (d) zebrafish incubated with LPS (5 μg·mL-1) and PMA (5 μg·mL-1) for 2 h at 37 ℃, then with NAC (600 μmol·L^-1) for 2 h, and finally with 10 μmol·L^-1 of probe 1 for 1 h

  Scale bar: 200 μm.

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  图 7  拟南芥根尖共聚焦荧光图像: (a) 拟南芥用10 μmol·L^-1探针1培养30 min; 探针处理的拟南芥再分别使用(b) 20 μmol·L^-1和(c) 50 μmol·L^-1的ClO^-继续培养30 min

  Figure 7  Confocal fluorescence images of Arabidopsis thaliana root tips: (a) Arabidopsis thaliana treated with 10 μmol·L^-1 of probe 1 for 30 min; Arabidopsis thaliana treated with 10 μmol·L^-1 of probe 1 for 30 min, and then with (b) 20 μmol·L^-1 and (c) 50 μmol·L^-1 of ClO^- for another 30 min

  Scale bar: 50 μm.

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  表 1  探针1的晶体学数据

  Table 1.  Crystallographic data of probe 1

  Parameter	1		Parameter	1
  Empirical formula	C18H12N4O		F(000)	624
  Formula weight	300.32		Z	4
  Temperature / K	293(2)		Dc / (Mg·m-3)	1.414
  Crystal system	Monoclinic		μ / mm-1	0.092
  Space group	P21/c		θ range / (°)	2.255‐24.992
  a / nm	0.864 8(8)		Independent reflection (Rint)	1 761 (0.027 1)
  b / nm	1.283 0(10)		Observed reflection [I > 2σ(I)]	2 485
  c / nm	1.287 0(11)		Goodness‐of‐fit on F2	1.023
  β/(°)	98.97(3)		Final R indices [I > 2σ(I)]	R1=0.044 7, wR2=0.113 0
  V / nm3	1.411(2)		R indices (all data)	R1=0.066 4, wR2=0.126 5

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