人工聚肽是以天然氨基酸为单体进行聚合反应，通过酰胺键而形成的聚氨基化合物，性质与天然肽、聚氨基酸和蛋白质类似。由人工聚肽形成的材料具有良好的生物亲和性[1-2]和可降解性[3]。聚肽或其改性低聚物表现出自组装[4]、液晶行为[5]等独特结构性质，具有较强可塑性[6]，在生物、医药和天然高分子材料领域具有很大的应用潜力[7-8]。我们课题组先前研究了蛋白酶催化聚合寡聚苯丙胺酸[9]。寡聚苯丙胺酸经聚乙二醇化修饰或者与谷氨酸、赖氨酸等共聚，可制备得到两亲性大分子，用于药物包埋、基因载体等[7, 10-13]。聚酪氨酸在疏水性和生物相容性等方面的性质与聚苯丙胺酸相似，同样能被应用于药物输送、基因治疗等领域[14-15]。除此以外，聚酪氨酸分子的每个酚羟基在氧化过程中会产生两个电子，因此被当作电活性标记应用于电化学生物传感器的信号放大[16-17]。
氨基酸聚合法有固相法[18]、α-氨基酸-N-羧内酸酐开环聚合法(NCA法)[19]和酶催化法[20]。与其它聚合方法相比，酶催化法具有反应条件温和、环境更友好、副反应少等优点，而且避免了繁琐的保护和去保护步骤[21]。各类蛋白酶中，丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶可被用来催化氨基酸酯分子间缩聚反应，制备氨基酸聚合物。据现有报道，木瓜蛋白酶、糜蛋白酶等已被用于催化L-苯丙氨酸酯聚合合成聚L-苯丙氨酸[22]。本研究采用菠萝蛋白酶为催化剂催化合成寡聚酪氨酸的聚合反应。菠萝蛋白酶催化合成氨基酸聚肽的逆水解反应是亲核取代反应。根据图 1所示的反应机理，水解反应是酶催化L-酪氨酸甲酯聚合的副反应。水解副反应不仅降低反应物L-酪氨酸甲酯的稳定性，而且会导致聚合氨基酸产物的分解，从而降低聚合反应得率。因此，为提高聚合产率必须对菠萝蛋白酶催化的反应混合物体系的组成进行考察。
菠萝蛋白酶(酶活力单位64.16 U)购自上海源叶生物科技有限公司；L-酪氨酸甲酯盐酸盐(＞98.0%)购自上海笛柏生物科技有限公司；α-氰基-4-羟基肉桂酸(CCA)购自MilliporeSigma公司；二甲亚砜(DMSO, 99.7%)、磷酸二氢钠(≥99.0%)、磷酸氢二钠(≥99.0%)等试剂购自上海国药集团化学有限公司。
Nicolet 6700型傅里叶变换红外光谱仪(FTIR，美国赛默飞世尔科技有限公司)；Microflex LT型基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS，美国布鲁克道尔顿公司)；Bruker AMX 400型核磁共振仪(NMR，美国布鲁克道尔顿公司)；Lab RAM HR Evolution型显微共聚焦拉曼光谱仪(法国HORIBA Jobin Yvon S.A.S.公司)；D8 Advance型X射线衍射仪(XRD，美国布鲁克道尔顿公司)。
在0.2 mol/L的磷酸缓冲溶液(pH=8.0)中加入0.7 g(1.5 mmol)的L-酪氨酸甲酯盐酸盐、体积分数为7.5%的DMSO和2.4 U菠萝蛋白酶，反应混合物的总体积为3 mL，于50 ℃下震荡反应5 h。反应结束后，离心，沉淀用去离子水和冰的乙醇各洗2次，冷冻干燥后得到O-L-Try，按照式(1)计算产率(Y)。在相同条件下，以不加酶的反应混合物进行对照实验。
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$ Y = \frac{{{m_2}}}{{{m_1}}} \times 100\% $ |
(1) |
式中，Y为O-L-Try产率(%)，m1为O-L-Try的产量(g)，m2为L-酪氨氨酸甲酯盐酸盐的使用量(g)。
反应混合物总体积为3 mL。将0.7 g L-酪氨酸甲酯盐酸盐加入体积分数分别为2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%的DMSO磷酸缓冲液中，磷酸缓冲液(pH=7.5)浓度为0.2 mol/L。然后加入2.4 U的菠萝蛋白酶于50 ℃恒温振荡器中(1000 r/min)反应5 h后终止反应，收集产物，计算O-L-Try的产率。
反应混合物总体积为3 mL。将0.7 g L-酪氨酸甲酯盐酸盐加入到体积分数为7.5%的DMSO磷酸缓冲液中，磷酸缓冲液浓度为0.2 mol/L, pH值分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。然后加入2.4 U的菠萝蛋白酶于50 ℃恒温振荡器中(1000 r/min)反应5 h后终止反应，收集产物，计算O-L-Try的产率。
反应混合物总体积为3 mL。将0.7 g L-酪氨酸甲酯盐酸盐加入到体积分数为7.5%的DMSO磷酸缓冲液，磷酸缓冲液(pH=7.5)浓度为0.2 mol/L。然后加入2.4 U的菠萝蛋白酶分别于20、30、40、50、60和70 ℃的恒温振荡器中(1000 r/min)反应5 h后终止反应，收集产物，计算O-L-Try的产率。
反应混合物总体积为3 mL。将0.7 g L-酪氨酸甲酯盐酸盐加入到体积分数为7.5%的DMSO磷酸缓冲液中，磷酸缓冲液(pH=7.5)浓度为0.2 mol/L。然后加入2.4 U的菠萝蛋白酶于50 ℃恒温振荡器中(1000 r/min)反应，在反应1、2、3、4、5、6、7、8 h后终止反应，收集产物，计算O-L-Try的产率。
反应混合物总体积为3 mL。将0.7 g L-酪氨酸甲酯盐酸盐加入到体积分数为7.5%的DMSO磷酸缓冲液中，磷酸缓冲液(pH=7.5)浓度为0.2 mol/L。然后分别加入1.2、2.4、4.8、7.2和9.7 U的菠萝蛋白酶于50 ℃恒温振荡器中(1000 r/min)反应5 h后终止反应，收集产物，计算O-L-Try的产率。
配制饱和的α-氰基-4-羟基肉桂酸(CCA)溶液。将聚合产物样品溶于DMSO溶液(20 μL)中，将总体积为15 μL的聚合产物样品溶液与CCA基质溶液混合，移取0.5 μL样品和CCA基质混合物点到钢靶上，钢靶上的样品干燥后在MALDI-TOF上测定。通过软件收集m/z的各个峰值，获得聚合产物的相对分子质量和聚合度(DP)。
DMSO是水解酶如糖苷酶和蛋白酶催化逆水解反应合成化合物的常用共溶剂[23-24]。DMSO对菠萝蛋白酶催化氨基酸聚合有促进作用[7]。其作用有两个方面：1)提高底物的相容性[25]，2)降低水的活性[26]。为了维持酶的活性构型，反应体系中必须有水的存在。然而，水的存在是蛋白酶催化氨基酸聚合反应的不利因素，会造成产率的下降。当在反应体系中加入DMSO等共溶剂后形成非水体系，体系中水活性下降，从而降低了其水解底物或者产物的能力[26]。由图 2可知，随着体系中DMSO量的增加，菠萝蛋白酶活性下降。然而，当DMSO体积分数从2.5%增加到7.5%时，O-L-Try的产率从26.1%显著上升到约61.8%。这是因为DMSO体积分数在一定范围内增加时，不仅促进了反应底物L-酪氨酸甲酯在酶溶液中的溶解程度，而且降低了体系中水的活度，有利于促进聚合反应进行。当DMSO体积分数进一步增加到7.5%~15%时，聚合反应产率明显下降。过多的DMSO会剥夺菠萝蛋白酶分子结构中维持活性构象的必需水，从而导致其活性下降[26]。
非水体系所加必需水的pH值对酶的催化活性有着重要的影响[26]。从图 3可知，菠萝蛋白酶催化L-酪氨酸聚合的产率在缓冲液pH值为7.5达到最大值，与菠萝蛋白酶的最佳水解活性pH相近。由反应机理(图 1)可知，菠萝蛋白酶催化L-酪氨酸甲酯聚合的反应是L-酪氨酸甲酯分子间发生的氨解反应属于亲核取代反应。该机理与脂肪酶催化聚酯合成的机理[26]近似，可认为在蛋白酶催化合成O-L-Try时，酶活性中心的氨基酸残基提供羧基(如谷氨酸残基)结合并活化L-酪氨酸甲酯的氨基而进攻另一分子L-酪氨酸甲酯的酰基进行氨解反应，生成酰胺肽键。因此，酶催化环境中的pH值变化会影响菠萝蛋白酶的催化活性中心与L-酪氨酸甲酯的结合，导致产物产率发生变化。在酸性条件下，反应体系中大量的质子会与L-酪氨酸甲酯分子的端位—NH2的孤对电子结合，使—NH2的亲核性下降，造成氨解反应产率下降。因此，菠萝蛋白酶催化L-酪氨酸聚合反应在中性和弱碱下反应更有利。
与典型化学反应相比，酶催化反应的温度一般比较温和。由图 4可知，聚合反应的产率在在50 ℃时达到最大。当反应温度超过50 ℃时，产率降低，这可能与菠萝蛋白酶在高温条件下的活性下降有关。此外，产率在反应5 h后达到最大(图 5)，超过5 h后产率下降。其原因在于，一方面长时间反应会导致酶活性下降；另一方面，蛋白酶催化氨基酸聚合反应是可逆反应，随着产物浓度增加，聚合产物分解的逆反应趋势增加，也会造成聚合反应产率下降。
图 6所示结果为使用不同酶量在50 ℃条件下、体积分数为7.5%的DMSO磷酸缓冲液(pH=7.5, 0.2 mol/L)中催化0.7 g L-酪氨酸甲酯进行聚合反应5 h后的产率。当使用的菠萝蛋白酶的活性单位数量为2.4 U时产率可达到65%。进一步增加菠萝蛋白酶酶量进行催化，O-L-Try的产率明显下降。菠萝蛋白酶是水解酶，既能催化聚合的作用，又能使肽键水解。所以，随着反应体系中菠萝蛋白酶催化用量的增大，体系中能催化水解反应的酶活性单位提高，造成O-L-Try产率下降。
菠萝蛋白酶催化L-酪氨酸甲酯聚合得到的寡聚L-酪氨酸(O-L-Try)的外观显微照片如图 7所示。O-L-Try聚合物为呈现一定规则形状的晶体簇。这可能是由于酪氨酸结构中的酚羟基与酰基氧原子、胺基氮原子的孤对电子形成分子间氢健，导致聚集体的生成。采用MALDI-TOF-MS方法获得O-L-Try的相对分子质量和聚合度(DP)分布如图 8所示。菠萝蛋白酶催化L-酪氨酸甲酯聚合获到的O-L-Try的最大DP值为11，主要DP值为10。
O-L-Try的1H NMR分析结果如图 9所示。各组对应的各个峰的归属分别是：1(—NH2)，2(—CH—NHCO)，3(—OCH3)，4(Ar—H)，5(—OH)，6(ArCH2)，7(—NHCO)。谱图符合L-酪氨酸多肽的结构特征。以O-L-Try端基上的—NH2为基准，由酰胺键上氢的峰面积算出O-L-Try的平均DP为8。所获DP值与MALDI-TOF分析结果略有差异。O-L-Try的拉曼光谱分析结果如图 10所示。在648、831、1174和1205 cm-1出现的峰为L-酪氨酸聚合单元的Raman谱的特征峰。O-L-Try肽键的Raman光谱特征峰位于：1623 cm-1(酰胺Ⅰ带，CO伸缩振动)；1447 cm-1(酰胺Ⅱ带，C—N伸缩振动和N—H变形振动)；1270 cm-1(酰胺Ⅲ带，C—N伸缩振动和N—H变形振动)；648 cm-1(酰胺Ⅳ带，OCNH变形振动)。其它各组峰的归属如下：3055 cm-1为O-L-Try苯环上不饱和C—H的伸缩振动；2941 cm-1为O-L-Try甲基C—H的伸缩振动。
O-L-Try的红外光谱分析结果如图 11所示。各组峰归属如下：3200 cm-1为N—H伸缩振动；2926 cm-1为C—H伸缩振动；2596 cm-1为N—H伸缩振动；1606 cm-1为酰胺CO伸缩振动；1584 cm-1为N—H变形振动；845 cm-1为苯环上对位取代。由于酰胺的羰基(CO)直接与—NHR基团相连，共轭效应使CO双键性下降，(CO)向低频位移偏移。O-L-Try的XRD分析结果如图 12所示，主要特征峰为在2θ为15°、18°、20°、27°、32°出现的尖锐结晶峰，与文献[27]报道的聚L-酪氨酸XRD特征峰的位置分布基本一致。
本文研究了在非水相中从L-酪氨酸甲酯单体聚合得到O-L-Try的酶催化方法。在反应过程中，使用DMSO非水介质能促进L-酪氨酸甲酯在缓冲液中的溶解，有利于反应底物分子间接触。菠萝蛋白酶催化L-酪氨酸甲酯聚合反应的产率在添加体积分数为7.5%的共溶剂DMSO后达到65%。对反应温度、时间及缓冲液pH值的考察研究表明，在50 ℃，缓冲液pH=7.5下反应5 h是获得最高产率的最佳条件。MALDI-TOF分析发现O-L-Try的DP值主要为10，而1H NMR研究发现O-L-Try的平均DP为8。通过O-L-Try的拉曼光谱分析O-L-Try，获得了1623、1447、1270和648 cm-1等酰胺Ⅰ带、酰胺Ⅱ带、酰胺Ⅲ带、酰胺Ⅳ带的特征峰。由于聚肽具有生物相容性和易功能化的特点，将来相关研究的重点为筛选获得催化氨基酸聚合反应所需的高稳定性和高活性酶催化剂。
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图 1 菠萝蛋白酶催化L-酪氨酸甲酯聚合合成O-L-Try的反应机理
Figure 1 Mechanism of synthesis of O-L-Try by polymerization of L-tyrosine methyl ester via Bromelain
图 2 DMSO浓度对菠萝蛋白酶活性和O-L-Try产率影响
Figure 2 Effect of various DMSO volume fraction on the bromelain activity and the yield of O-L-Try
图 3 不同pH值条件下O-L-Try产率
Figure 3 Effect of various pH of DMSO-buffer on the yield of O-L-Try
图 4 反应温度变化对O-L-Try产率影响
Figure 4 Effect of varying reaction temperature on the yield of O-L-Try
图 5 反应时间对O-L-Try产率影响
Figure 5 Effect of different reaction time on the yield of O-L-Try
图 6 菠萝蛋白酶用量对O-L-Try产率影响
Figure 6 The influences of different amounts of bromelain (U) used on the yield of O-L-Try
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