基于免疫磁性纳米球快速高效准确检测淋巴结转移癌细胞

引用本文: 马旭妍, 秦银辉, 漆楚波, 吴玲玲, 张志凌, 夏和顺, 庞代文. 基于免疫磁性纳米球快速高效准确检测淋巴结转移癌细胞[J]. 分析化学, 2017, 45(12): 1874-1881. doi: 10.11895/j.issn.0253-3820.171298 shu

Citation: MA Xu-Yan, QIN Yin-Hui, QI Chu-Bo, WU Ling-Ling, ZHANG Zhi-Ling, XIA He-Shun, PANG Dai-Wen. Immunomagnetic Nanosphere-based Strategy for Rapid, Efficient and Accurate Detection of Lymphnode Metastatic Carcinoma Cells[J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2017, 45(12): 1874-1881. doi: 10.11895/j.issn.0253-3820.171298 shu

基于免疫磁性纳米球快速高效准确检测淋巴结转移癌细胞

马旭妍 ^1, ,
秦银辉 ^1, ,
漆楚波 ^1,2, ,
吴玲玲 ^1, ,
张志凌 ^1, ,
夏和顺 ^{2,
,} ,
庞代文 ^{1,
,}

1.
武汉大学生物医学分析化学教育部重点实验室, 化学与分子科学学院, 病毒学国家重点实验室, 高等研究院, 武汉生物技术研究院, 武汉 430072
2.
湖北省肿瘤医院, 武汉 430079

通讯作者: 夏和顺, E-mail xiaheshun@sina.com; 庞代文, E-mail dwpang@whu.edu.cn

基金项目:
本文系国家自然科学基金项目（No.21535005）资助

摘要: 发展了一种基于免疫磁性纳米球（IMNs）快速、高效、准确检测淋巴结转移癌细胞（LNMCCs）的策略。首先利用本课题组发展的方法制备了具有磁性和生物靶向双功能的IMNs，然后利用IMNs通过免疫磁分选对淋巴结转移癌病人淋巴结穿刺物中的LNMCCs进行分离和富集，最后采用瑞氏染色法和免疫细胞化学（ICC）对富集的LNMCCs进行鉴定，实现对LNMCCs的快速高效准确检测。免疫磁分选实现了LNMCCs的分离和富集，可以有效降低淋巴结穿刺物中的背景干扰；瑞氏染色法和ICC鉴定为准确诊断提供了更多可靠依据，因此，传统细胞学敏感性、特异性和诊断准确率不高的问题得到明显改善。其次，淋巴结穿刺物与IMNs的孵育只需5 min，简便快速，完整保留了LNMCCs的形态学特征，为淋巴结转移癌（LNMC）的分类和后续病理学分析提供了重要基础。此外，IMNs对淋巴结穿刺物中上皮来源癌细胞的特异性捕获可以确诊捕获的细胞为LNMCCs，实现了LNMC和恶性淋巴瘤的鉴别诊断。最后，采用本方法检测了110例病人淋巴结穿刺物中的LNMCCs，总诊断准确率高达98.2%，特异性为100.0%，敏感性为98.0%，相比于传统细胞学诊断都有明显的提高。因此，IMNs用于LNMC病人淋巴结穿刺物中LNMCCs的检测是一次新的尝试，为LNMC的诊断和研究提供了新思路。

关键词:

English

Immunomagnetic Nanosphere-based Strategy for Rapid, Efficient and Accurate Detection of Lymphnode Metastatic Carcinoma Cells

1.
Key Laboratory of Analytical Chemistry for Biology and Medicine(Ministry of Education), College of Chemistry and Molecular Sciences, State Key Laboratory of Virology, The Institute for Advanced Studies, Wuhan Institute of Biotechnology, Wuhan University, Wuhan 430072, China
2.
Hubei Cancer Hospital, Wuhan 430079, China

Corresponding author: XIA He-Shun, xiaheshun@sina.com; PANG Dai-Wen, dwpang@whu.edu.cn

Received Date: 07 October 2017
Accepted Date: 07 November 2017
Available Online: 20 December 2017
Fund Project:
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No.21535005)

Abstract: A strategy based on immunomagnetic nanospheres (IMNs) for rapid, efficient and accurate detection of lymphnode metastasis carcinoma cells (LNMCCs) was developed in this study. First, IMNs processing magnetism and biological targeting were fabricated by the approach developed by our group previously. Then, LNMCCs in lymph node fine needle aspiration (LNFNA) specimens were separated and enriched by the immunomagnetic isolation using IMNs. At last, the captured cells were identified with Wright's staining and immunocytochemistry (ICC). The separation and enrichment of LNMCCs with immunomagnetic isolation could reduce the background interference of LNFNA specimens effectively; the identification with Wright's staining and ICC offered more reliable information for accurate diagnosis, so the sensitivity, specificity and overall diagnostic accuracy had an obvious improvement compared with the conventional cytologic diagnosis. Besides, the simple and rapid incubation of LNFNA specimens with IMNs needed just 5 min, so the cytomorphology of captured LNMCCs could be intactly retained, which enabled to provide important basis for classifying lymphnode metastasis carcinoma (LNMC) and the subsequent pathological study. Moreover, the specific capture of epithelial carcinoma cells in LNFNA specimens with IMNs could make a definite diagnosis of the captured cells as LNMCCs, thus realizing the differentiated diagnosis of LNMC and malignant lymphoma. Additionally, this strategy exhibited successful LNMCCs detection in LNFNA specimens from 110 patients and had higher sensitivity (98.0%), specificity (100.0%), and overall diagnostic accuracy (98.2%) than the conventional cytologic diagnosis. Therefore, it was a new attempt to use IMNs for detection of LNMCCs in LNFNA specimens from LNMC patients, and offered new ideas for LNMC diagnosis and study.

Key words:

1. 引言

目前，癌症的发病率日趋升高，准确诊断是保证癌症病人有效治疗、提高存活率的重要前提^[1]。基于癌细胞易发生淋巴结转移的特性，可以通过淋巴结细针穿刺(Lymph node fine needle aspiration, LNFNA)检测淋巴结转移癌细胞(Lymphnode metastasis carcinoma cells，LNMCCs)来确定病人是否有癌细胞转移，所以LNMCCs的检测对癌症病人的诊断、治疗监测和预后评估意义重大^[2~4]。LNFNA是临床上检测LNMCCs通常采用的方法，具有便捷、经济、安全和创伤小等优点^[5~9]，但由于淋巴结穿刺物成分复杂，含有大量的干扰细胞和组织液, 如淋巴细胞、红细胞、间质纤维细胞、脂肪细胞等，形态变化较大且数量稀少的LNMCCs很难被发现；另外，根据细胞形态学的诊断需要病理医师有丰富的临床和形态学经验，所以LNFNA诊断准确率不高^{[2, 10, 11]}。因此亟需发展一种快速高效准确检测LNMCCs的方法。

近年来，一些生物功能化的纳米材料在生物检测、癌症诊断和治疗等研究领域中被广泛应用^[12~14]。本课题组在前期工作中，制备的磁性/荧光纳米球^[15~18]，已被用于蛋白、病毒、细菌、细胞等的分离和检测^[19~22]；此外，磁性纳米球(Magneticnanospheres，MNs)实现了对实际病人外周血中循环肿瘤细胞的快速高效捕获^[23~26]。在已有的研究基础上，本研究发展了一种基于IMNs快速高效准确检测LNMCCs的方法(图 1A)，利用制备的IMNs通过免疫磁分选对病人淋巴结穿刺物中的LNMCCs进行分离和富集，然后采用瑞氏染色法和免疫细胞化学(Immunocytochemistry，ICC)对富集的LNMCCs进行鉴定。本方法具有如下优势：(1)免疫磁分选有效降低了淋巴结穿刺物中的背景干扰；瑞氏染色法和ICC鉴定为确诊LNMC提供了更多可靠依据。因此，相比于传统细胞学诊断，基于IMNs策略的诊断敏感性、特异性和准确率都有明显提高。(2)淋巴结穿刺物中LNMCCs的捕获只需孵育5 min，完整保留了LNMCCs的形态学特征，有助于LNMC的分类，为后续的病理学分析提供了重要线索。(3)IMNs对淋巴结穿刺物中上皮来源癌细胞的特异性捕获可以确诊捕获的细胞为LNMCCs，实现了LNMC和恶性淋巴瘤的鉴别诊断。

图 1

图 1. (A) 基于免疫磁性纳米球检测淋巴结转移癌细胞的原理图；(B)MNs的透射电镜图；(C)商品化的磁力架在不同吸引时间下对MNs的捕获效率；(D)MNs和IMNs与Dylight488标记的羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG)孵育后的显微图像

Figure 1. (A) Schematic diagram for detection of lymphnode metastasis carcinoma cells (LNMCCs) with immunomagnetic nanospheres (IMNs); (B) Transmission electron microscopy (TEM) image of magnetic nanospheres (MNs); (C) Capture efficiencies of MNs at different attraction time with a commercial magnetic scaffold; (D) Microscopic images of MNs and IMNs after incubation with Dylight488-labeled goat anti-mouse IgG

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2. 实验部分

2.1 仪器与试剂

Tecnai G2 20 TWIN场发射透射电子显微镜(美国FEI公司)；倒置荧光显微镜(日本Nikon公司)。牛血清白蛋白(BSA)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、抗上皮细胞粘附分子(anti-EpCAM)抗体(Sigma-Aldrich公司)；异硫氰酸荧光素标记的抗角蛋白(FITC-CK19)抗体、藻红蛋白标记的抗白细胞共同抗原(PE-CD45)抗体(Abcam公司)；Hoechst 33342(Invitrogen公司)。MCF-7 and Jurkat T细胞(中国典型培养物保藏中心)；瑞氏染液(珠海贝奈生物技术公司)。病人的淋巴结穿刺物由湖北省肿瘤医院提供。

2.2 实验方法

2.2.1 IMNs的制备

利用本课题组建立的层层组装法^[20]制备MNs，通过EDC/NHS活化法将抗体修饰到MNs表面。具体步骤如下：1 mg MNs用25 mmol/L EDC和25 mmol/L NHS活化25 min，加入5 μg anti-EpCAM抗体，摇床上室温孵育4 h，洗涤除去多余抗体，制备的IMNs分散于0.01 mol/L PBS溶液(pH 7.2)，于4℃保存备用。

2.2.2 IMNs对模拟LNMCCs样品中稀少癌细胞的捕获

首先确定IMNs的最佳用量和IMNs与细胞孵育的最佳时间，并评估其特异性。取0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL的IMNs，分别与MCF-7细胞(1 ×10⁵ cell/mL)孵育，磁分选后用血球计数板对捕获和未捕获的细胞分别计数并计算捕获效率。向5组MCF-7细胞悬液中(1 ×10⁵ cell/mL)加入0.3 mg IMNs，在室温摇床上分别孵育5、10、15、20和25 min，按照前面步骤计算捕获效率。另外，设计两个对照实验研究IMNs的特异性：IMNs加入Jurkat T细胞悬液中；MNs加入MCF-7细胞悬液中，孵育5 min后按照上述步骤计算捕获效率。

然后用IMNs捕获模拟样品中低浓度的癌细胞。将适量用Hoechst 33342染核的MCF-7细胞依次加入到Jurkat T细胞(1×10⁶ cell/mL)悬液中，使MCF-7细胞浓度分别约为5、50、100、500和1000 cell/mL，组成模拟LNMCCs样品，向各组加入0.3 mg IMNs，摇床上室温避光孵育5 min后磁分选，对捕获及未捕获的MCF-7、Jurkat T细胞分别计数，并计算捕获效率。

2.2.3 LNMC病人淋巴结穿刺物中LNMCCs的检测

病人的淋巴结穿刺物分散于1 mL 1×PBS溶液中，按照2.2.2节进行免疫磁分选，然后进行涂片：将捕获的细胞滴加到载玻片划定区域, 用钨灯烘干。滴加瑞氏染液染色，置于显微镜下观察。

2.2.4 瑞氏染色法和ICC鉴定

病人的淋巴结穿刺物经免疫磁分选(操作同2.2.2节)后分成2份涂片，分别进行瑞氏染色法和ICC鉴定。ICC鉴定：向涂片滴加4%多聚甲醛固定10 min，再滴加0.1% Triton-X 100通透10 min，用0.2% BSA洗涤，滴加含有FITC-CK19抗体、PE-CD45抗体和Hoechst 33342染料的0.2% BSA溶液，避光孵育1 h后洗涤，置于显微镜下观察。

2.2.5 110例病人淋巴结穿刺物中LNMCCs的检测

收集102例LNMC、1例恶性淋巴瘤和7例良性病变病人的淋巴结穿刺物，按照2.2.4节对LNMCCs进行捕获和鉴定，并结合其活检免疫组织化学检测结果进行回顾性分析，考察方法的可靠性，并将其与传统细胞学检测进行比较分析。

3. 结果与讨论

3.1 IMNs的表征

透射电镜表征结果表明，制得的MNs单分散性好，粒径均一，约380 nm(图 1B)。如图 1C所示，1 min内约95%的MNs能够被商品化的磁力架捕获。以上结果表明，MNs的单分散性好，磁响应快，有助于实现对癌细胞的快速高效分离和富集。MNs偶联抗体后，可与Dylight488标记的羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG)特异性结合，表明成功制备了IMNs(图 1D)。

3.2 IMNs捕获癌细胞的高效性和特异性

选用EpCAM高表达的MCF-7细胞为目标细胞，Jurkat T细胞为阴性对照，验证IMNs捕获癌细胞的高效性和特异性。为保证IMNs可以高效捕获癌细胞，首先优化了IMNs的用量(图 2A)：IMNs用量为0.3 mg/mL时，捕获效率高达95.2%。另外，检测时间是评价检测方法的重要标准，因此探究了不同孵育时间下IMNs对MCF-7细胞的捕获效率。如图 2B所示，孵育5 min，IMNs对MCF-7的捕获效率达到90.1%，而随着时间延长，捕获效率并未明显增加，表明IMNs与癌细胞的结合速度非常快，并且对癌细胞的捕获能力很强。而在优化条件下，IMNs几乎不捕获Jurkat T细胞，MNs对MCF-7细胞的捕获效率也很低(图 2C)。以上结果表明，IMNs与癌细胞的结合是快速高效且特异性的。此外，染核的细胞与免疫磁性荧光纳米球(Immunomagnetic fluorescent nanospheres，IMFNs)经孵育、磁分选后，在荧光显微镜下观察，MCF-7细胞表面有明显的红色荧光信号，而Jurkat T细胞表面几乎没有红色荧光(图 2D)，进一步表明免疫纳米球有良好的特异性。

图 2

图 2. (A) 不同浓度的IMNs对MCF-7细胞的捕获效率；(B)不同孵育时间下，IMNs对MCF-7细胞的捕获效率；(C)IMNs对MCF-7细胞、IMNs对Jurkat T细胞以及MNs对MCF-7细胞的捕获效率；(D)Hoechst 33342预染的MCF-7和Jurkat T细胞分别与IMFNs孵育后的显微图像

Figure 2. (A) Capture efficiencies of different concentrations of IMNs to MCF-7 cells; (B) Capture efficiencies of IMNs to MCF-7 cells with different incubation time; (C) Capture efficiencies of IMNs to MCF-7 cells, IMNs to Jurkat T cells and MNs to MCF-7 cells; (D) Microscopic images of Hoechst 33342-prestained MCF-7 cells and Jurkat T cells after incubation with immunomagnetic fluorescent nanospheres (IMFNs)

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3.3 IMNs对模拟样品中稀少癌细胞的捕获能力

为了考察IMNs对少量癌细胞的捕获能力，将5~1000个染核的MCF-7细胞投入到Jurkat T细胞的1 × PBS悬液中，组成模拟LNMCCs样品。如图 3所示，IMNs对不同数量癌细胞的捕获效率都大于90%，而对Jurkat T细胞的非特异性吸附仅约5%。表明IMNs可以从模拟样品中捕获极低浓度的癌细胞，且捕获效率高、特异性好，有效地实现了癌细胞的分离和富集，明显降低了样品中非目标细胞的干扰，为LNMC病人淋巴结穿刺物中LNMCCs的准确检测鉴定了良好基础。

图 3

图 3. IMNs对模拟LNMCCs样品中不同浓度MCF-7细胞的捕获效率和Jurkat T细胞的非特异性吸附效率

Figure 3. Capture efficiencies of IMNs to MCF-7 cells and non-specific adsorption efficiencies of IMNs to Jurkat T cells with different concentrations of MCF-7 cell in synthetic LNMCCs specimens

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3.4 LNMC病人淋巴结穿刺物中LNMCCs的检测

由于淋巴结穿刺物成分复杂，含有大量的干扰细胞和组织液，如图 4A(a)所示，病人的淋巴结穿刺物直接涂片经瑞氏染色后在显微镜下观察：背景干扰较大，可见淋巴细胞(红色箭头)、红细胞(绿色箭头)、间叶纤维细胞(黑色箭头)等干扰细胞，仅根据细胞形态学特征难以准确判断LNMCCs。而淋巴结穿刺物经免疫磁分选后，再将捕获的细胞涂片、瑞氏染色，在显微镜下观察，发现视野清晰，细胞形态保留较为完整，且几乎全为LNMCCs(图 4A(b))。表明IMNs对上皮来源癌细胞的特异性捕获实现了LNMCCs的分离和富集，有效降低了背景干扰，有助于提高LNFNA的诊断准确率。另外，简便快速的免疫磁分选在确保高效捕获癌细胞的同时还完整保留了其形态学特征。如图 4B所示，a和b中细胞多形、胞浆丰富为典型的鳞癌特征；c和d中细胞大小较一致，胞浆内可见空泡为典型的腺癌特征。癌细胞形态学特征的完整保留有助于LNMC的分类，为后续的病理学分析提供了可能。此外，病人的淋巴结穿刺物直接涂片可见异型性明显的细胞，疑似为LNMCCs(图 4C, a红色箭头)，但仅从细胞形态判断不能排除是恶性淋巴瘤(起源于淋巴细胞)的可能，确诊还需做进一步鉴定；而由于IMNs对淋巴结穿刺物中上皮来源癌细胞的特异性捕获，基于免疫磁分选诊断(图 4C, b)可以快速确诊捕获的细胞为LNMCCs，实现了LNMC和恶性淋巴瘤的鉴别诊断。

图 4

图 4. LNMC病人的淋巴结穿刺物经涂片和瑞氏染色后的显微图像。(A)淋巴结穿刺物直接涂片(a)和免疫磁分选后涂片(b)；(B)转移性鳞癌(a, b)和转移性腺癌(c, d)病人的淋巴结穿刺物免疫磁分选后涂片；(C)转移性腺癌病人的淋巴结穿刺物直接涂片(a)和免疫磁分选后涂片(b)

Figure 4. Microscopic images of Lymph node fine needle aspiration (LNFNA) specimens from LNMC patients after being smeared and stained with Wright's stain. (A) LNFNA specimens without (a) and with (b) immunomagnetic isolation before being smeared; (B) LNFNA specimens of metastatic squamous cell carcinoma (a, b) and metastatic adenocarcinoma (c, d) patients with immunomagnetic isolation before being smeared; (C) LNFNA specimens of one metastatic adenocarcinoma patient without (a) and with (b) immunomagnetic isolation before being smeared

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以上结果表明，IMNs可以直接从淋巴结穿刺物中特异性地捕获LNMCCs，操作简便快速，对LNMCCs的细胞形态几乎没有影响，为LNMC的诊断和研究提供了新思路。

3.5 瑞氏染色法和ICC鉴定LNMC病人淋巴结穿刺物中的LNMCCs

临床上常用瑞氏染色法根据细胞形态学判断癌细胞；ICC鉴定则基于细胞抗原的表达情况判定，具有更高的准确性：核染阳性、CK19表达阳性、CD45表达阴性的细胞为LNMCCs；核染阳性、CK19表达阴性、CD45表达阳性的细胞为淋巴细胞。病人淋巴结穿刺物中被捕获的细胞瑞氏染色法和ICC鉴定结果保持一致(图 5)，表明两种方法鉴定具有更高的准确性，为LNMC的准确诊断提供更多可靠依据。

图 5

图 5. LNMC病人淋巴结穿刺物中被捕获且用瑞氏染色法和ICC鉴定的细胞显微图像。(A)转移性鳞癌，(B)转移性腺癌，(C)未分化癌

Figure 5. Microscopic images of cells captured in LNFNA specimens from LNMC patients and identified with Wright's staining and immunocytochemistry (ICC). (A) metastatic squamous cell carcinoma, (B) metastatic adenocarcinoma, (C) metastatic undifferentiated carcinoma

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3.6 方法的可靠性分析

为了考察方法的可靠性，采用基于IMNs的策略检测了102例LNMC、1例恶性淋巴瘤和7例良性病变病人淋巴结穿刺物中的LNMCCs，结合其活检免疫组织化学检测结果进行了回顾性分析，并将其与传统细胞学检测进行比较分析(表 1)：基于免疫磁分选的方法总诊断准确率高达98.2%，特异性为100.0%，敏感性为98.0%，相比于传统细胞学诊断有明显提高。主要是由于IMNs对LNMCCs的特异性捕获有效降低了非目标细胞的背景干扰，增加了检测的特异性；而免疫磁分选实现了LNMCCs的分离和富集，增加了检测的敏感性，因此总诊断准确率也有明显的提高。IMNs成功地应用于LNMC病人淋巴结穿刺物中LNMCCs的检测，表明本方法在LNMCCs研究中具有潜在的临床应用价值。

表 1

表 1 基于IMNs策略和传统细胞学诊断检测LNMCCs的对比

Table 1. Comparison of detection results of LNMCCs by IMNs-based strategy and conventional cytologic diagnosis

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检测方法 Detection method	阴阳性 Negative or positive	淋巴结转移癌病例 LNMC	非淋巴结转移癌病例 Non-LNMC	特异性 Specificity (%)	敏感性 Sensitivity (%)	总诊断准确率 Overall diagnostic accuracy (%)
传统细胞学 Conventional cytology	阳性 Positive 阴性 Negative	94 8	1 7	87.5	93.1	91.8
基于IMNs策略 IMNs-based strategy	阳性 Positive 阴性 Negative	100 2	0 8	100.0	98.0	98.2

4. 结论

利用IMNs成功实现了对LNMC病人淋巴结穿刺物中LNMCCs的快速高效准确检测。免疫磁分选有效降低了淋巴结穿刺物中非目标细胞的背景干扰；瑞氏染色法和ICC鉴定为准确诊断提供了更多可靠依据，因此明显改善了传统细胞学诊断特异性、敏感性和准确率不高的问题。其次，病人淋巴结穿刺物中LNMCCs的捕获只需孵育5 min，操作简单快速，在保证高效捕获癌细胞的同时还完整保留了其形态学特征，有助于LNMC的分类，为后续的病理学分析提供了可能。另外，IMNs对淋巴结穿刺物中上皮来源癌细胞的特异性捕获可以很快的确诊捕获的细胞为LNMCCs，实现了LNMC和恶性淋巴瘤的鉴别诊断。本方法检测了110例病人淋巴结穿刺物中的LNMCCs，总诊断准确率高达98.2%，相比于传统的细胞学检测有明显提高，为LNMCCs的检测和研究提供了一种强有力的手段，在LNMC诊断方面具有潜在的临床应用价值。

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  Chen L, Wu L L, Zhang Z L, Hu J, Tang M, Qi C B, Li N, Pang D W. Biosens. Bioelectron., 2016, 85:633-640 doi: 10.1016/j.bios.2016.05.071
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图 1 (A) 基于免疫磁性纳米球检测淋巴结转移癌细胞的原理图；(B)MNs的透射电镜图；(C)商品化的磁力架在不同吸引时间下对MNs的捕获效率；(D)MNs和IMNs与Dylight488标记的羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG)孵育后的显微图像

Figure 1 (A) Schematic diagram for detection of lymphnode metastasis carcinoma cells (LNMCCs) with immunomagnetic nanospheres (IMNs); (B) Transmission electron microscopy (TEM) image of magnetic nanospheres (MNs); (C) Capture efficiencies of MNs at different attraction time with a commercial magnetic scaffold; (D) Microscopic images of MNs and IMNs after incubation with Dylight488-labeled goat anti-mouse IgG

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图 2 (A) 不同浓度的IMNs对MCF-7细胞的捕获效率；(B)不同孵育时间下，IMNs对MCF-7细胞的捕获效率；(C)IMNs对MCF-7细胞、IMNs对Jurkat T细胞以及MNs对MCF-7细胞的捕获效率；(D)Hoechst 33342预染的MCF-7和Jurkat T细胞分别与IMFNs孵育后的显微图像

Figure 2 (A) Capture efficiencies of different concentrations of IMNs to MCF-7 cells; (B) Capture efficiencies of IMNs to MCF-7 cells with different incubation time; (C) Capture efficiencies of IMNs to MCF-7 cells, IMNs to Jurkat T cells and MNs to MCF-7 cells; (D) Microscopic images of Hoechst 33342-prestained MCF-7 cells and Jurkat T cells after incubation with immunomagnetic fluorescent nanospheres (IMFNs)

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图 3 IMNs对模拟LNMCCs样品中不同浓度MCF-7细胞的捕获效率和Jurkat T细胞的非特异性吸附效率

Figure 3 Capture efficiencies of IMNs to MCF-7 cells and non-specific adsorption efficiencies of IMNs to Jurkat T cells with different concentrations of MCF-7 cell in synthetic LNMCCs specimens

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图 4 LNMC病人的淋巴结穿刺物经涂片和瑞氏染色后的显微图像。(A)淋巴结穿刺物直接涂片(a)和免疫磁分选后涂片(b)；(B)转移性鳞癌(a, b)和转移性腺癌(c, d)病人的淋巴结穿刺物免疫磁分选后涂片；(C)转移性腺癌病人的淋巴结穿刺物直接涂片(a)和免疫磁分选后涂片(b)

Figure 4 Microscopic images of Lymph node fine needle aspiration (LNFNA) specimens from LNMC patients after being smeared and stained with Wright's stain. (A) LNFNA specimens without (a) and with (b) immunomagnetic isolation before being smeared; (B) LNFNA specimens of metastatic squamous cell carcinoma (a, b) and metastatic adenocarcinoma (c, d) patients with immunomagnetic isolation before being smeared; (C) LNFNA specimens of one metastatic adenocarcinoma patient without (a) and with (b) immunomagnetic isolation before being smeared

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图 5 LNMC病人淋巴结穿刺物中被捕获且用瑞氏染色法和ICC鉴定的细胞显微图像。(A)转移性鳞癌，(B)转移性腺癌，(C)未分化癌

Figure 5 Microscopic images of cells captured in LNFNA specimens from LNMC patients and identified with Wright's staining and immunocytochemistry (ICC). (A) metastatic squamous cell carcinoma, (B) metastatic adenocarcinoma, (C) metastatic undifferentiated carcinoma

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表 1 基于IMNs策略和传统细胞学诊断检测LNMCCs的对比

Table 1. Comparison of detection results of LNMCCs by IMNs-based strategy and conventional cytologic diagnosis

检测方法 Detection method	阴阳性 Negative or positive	淋巴结转移癌病例 LNMC	非淋巴结转移癌病例 Non-LNMC	特异性 Specificity (%)	敏感性 Sensitivity (%)	总诊断准确率 Overall diagnostic accuracy (%)
传统细胞学 Conventional cytology	阳性 Positive 阴性 Negative	94 8	1 7	87.5	93.1	91.8
基于IMNs策略 IMNs-based strategy	阳性 Positive 阴性 Negative	100 2	0 8	100.0	98.0	98.2

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通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com

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沈阳化工大学材料科学与工程学院沈阳 110142