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• 铜元素是一种非常重要的过渡金属元素，已被广泛应用于制造业领域。在动、植物体内，铜元素也起着非常重要的生理作用^[1-2]。例如在人体内，铜元素作为必需的痕量金属元素，其含量仅次于锌、铁元素，缺失或过量都会使生理功能紊乱，导致各种疾病，像骨质疏松症、帕金森病及阿尔茨海默病等^[3-8]。因此，定量地检测铜离子具有重要的意义。

  检测铜离子的传统方法主要有原子荧光光谱法^[9]、原子吸收光谱法^[10-11]和质谱法^[12-13]等，虽然这些方法都能较精确地检测铜离子，但通常都需要昂贵的设备、烦琐的样品制备程序及较长的测试时间，这些缺陷极大地限制了这些方法在实际中特别是在活体或活细胞内的应用。荧光探针分析法由于具有操作简单、灵敏度高、选择性好、短的响应时间及无需昂贵的设备等优点，近年来已引起了研究者的浓厚兴趣，并应用于多个领域，包括离子检测^[14-18]。

  目前，研究较多的荧光探针按照荧光团来划分主要有罗丹明类、稠环芳烃类、萘酰亚胺类、喹啉类及硼氟二吡咯(BODIPY)类^{[2, 19-24]}。其中BODIPY类荧光探针具有结构易修饰、荧光量子产率高和摩尔吸光系数大等优良的光物理性质，是应用最为广泛的一类^[25-26]。也有部分这类探针被应用到铜离子检测方面^[27-36]。例如，2014年，Kursunlu等^[29]合成了一个以2，6-二氨基-1，3，5-三嗪为识别基团的结构对称的BODIPY类荧光探针，该探针通过荧光猝灭和发射波长的蓝移可以选择性地识别Cu²⁺离子；2015年，He等^[30]在BODIPY核的3、5位引入了3-吡啶乙炔基作为检测基团，通过吸收峰的红移也能选择性地检测Cu²⁺离子；2019年，Ecik等^[31]将BODIPY核通过三氮唑连接到环四磷腈上组装成一个结构复杂的荧光探针，在溶液中该探针能够选择性地识别Cu²⁺和Co²⁺离子。已报道的这些可以识别Cu²⁺离子的BODIPY类荧光探针，大多数具有合成困难或生物兼容性较差的缺点，限制了在实际中的应用。我们设计、合成了一个新的BODIPY类荧光探针1，在BODIPY核的中位上引入了一个吡啶-2-甲酰基识别基团。该探针制备简单，并有好的溶解性和生物兼容性，在溶液中或活细胞内能够选择性地检测Cu²⁺离子，具有潜在的实际应用价值。探针1 的合成路线如Scheme 1所示。

  Scheme 1

  

  Scheme 1.  Synthesis route for probe 1

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  1.   实验部分

  1.1   仪器与试剂

  所用仪器：TU-1901紫外光谱仪、Cary Eclips型荧光光谱仪、Bruker AV400核磁共振仪、Thermo Scientific LTQ Orbitrap XL高分辨质谱仪、蔡司LSM880共聚焦激光扫描显微仪、ELX808酶标仪、D8 Venture X射线单晶衍射仪、Vario MICRO cube元素分析仪等。

  所用试剂均为分析纯。吡啶-2-甲酸、对羟基苯甲醛、2，4-二甲基吡咯、三氟化硼乙醚等均购自百灵威试剂有限公司。干燥CH₂Cl₂在CaH₂中回流并蒸馏得到，三乙胺在使用前需重蒸。配制Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Hg²⁺、Cd²⁺、Ni²⁺、Fe³⁺、Al³⁺的溶液所用金属盐均为氯化物或水合物，Zn²⁺、Mg²⁺、Cu²⁺溶液用硫酸盐水合物配制，Co²⁺溶液用醋酸盐配制。

  1.2   实验方法

  1.2.1   吡啶-2-甲酰氯(3)的合成

  化合物3 参照文献^[37]合成：在100 mL圆底烧瓶中加入吡啶-2-甲酸(5 g，41 mmol)和N，N-二甲基甲酰胺(0.5 mL)，在搅拌下，将氯化亚砜(15 mL)逐滴加入到上述混合物中，在室温下继续搅拌约2 h直到吡啶-2甲酸完全溶解。然后将剩余氯化亚砜旋转蒸发至干，得到的固体用冰乙醚洗涤数次，最后真空干燥得到化合物3，未经纯化直接用于下一步反应。

  1.2.2   吡啶-2-甲酸(4-甲酰基苯酚)酯(2)的合成^[38]

  在100 mL圆底烧瓶中加入对羟基苯甲醛(1.2 g，10 mmol)、3(1.6 g，11 mmol) 和30 mL无水二氯甲烷，在搅拌下，将2.8 mL三乙胺逐滴地加入到上述混合物中，然后继续在室温下反应过夜。反应结束后，加入30 mL H₂O猝灭，有机相用无水Na₂SO₄干燥。然后过滤，将滤液旋转蒸发至干，粗产物用硅胶柱色谱纯化(V 石油醚/V 二氯甲烷=4)，得白色固体1.6 g，产率70%。¹H NMR(CDCl₃，600 MHz)：δ 10.04(s，1H)，8.77(d，J=6 Hz，1H)，8.30(d，J=6 Hz，1H)，7.99(d，J=6 Hz，2H)，7.98~7.95(m，1H)，7.62~7.60(m，1H)，7.47(d，J=12 Hz，2H)。

  1.2.3   探针1 的合成

  在250 mL的圆底烧瓶中，依次加入2，4-二甲基吡咯(0.19 g，2.0 mmol)、2(0.23 g，1.0 mmol)和100 mL干燥二氯甲烷，并用N₂鼓泡置换1 min。然后在搅拌下快速滴加几滴三氟乙酸(TFA)，整个体系用N₂保护在室温下避光反应直至溶液变为紫红色。随后向反应体系中加入2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌(DDQ，0.23 g，1.0 mmol)继续反应1 h。最后再将3 mL三乙胺加入反应体系中，反应20 min后接着加入3 mL三氟化硼乙醚溶液，反应5 h后加水猝灭。用二氯甲烷萃取，干燥，旋转蒸发至干，粗产物用硅胶柱层析纯化(V 石油醚/V 二氯甲烷=2)，得红色固体67.67 mg，产率15.2%。¹H NMR(CDCl₃，400 MHz)：δ 8.87 (d，J=4 Hz，1H)，8.30(d，J=4 Hz，1H)，7.95(t，J=4 Hz，1H)，7.59(t，J=4 Hz，1H)，7.42(d，J=8 Hz，2H)，7.36(d，J=8 Hz，2H)，6.00(s，2H)，2.59(s，6H)，1.45(s，6H)。¹³C NMR(CDCl₃, 100.518 MHz)：δ 163.64，155.73，151.50，150.17，147.20，143.15，140.55，137.34，132.83，131.45, 129.29, 127.67，125.91，122.74，121.40，14.62，14.56。HRMS(ESI)：m/z [M+H]⁺按C₂₅H₂₃BF₂N₃O₂计算值：446.1846；实验值：446.1844。元素分析按C₂₅H₂₂BF₂N₃O₂计算值(%)：C 67.44，H 4.98，N 9.44；实验值(%)：C 67.18，H 5.38，N 9.03。

  1.2.4   单晶X射线衍射分析

  探针1 的单晶是在室温下通过溶剂(正己烷/二氯甲烷)挥发法得到。单晶X射线衍射数据是在Bruker D8 Venture衍射仪上进行收集的，其中辐射源是石墨单色器Mo Kα，波长为0.071 073 nm，温度为298 K。首先使用SMART软件确定晶胞参数。使用程序SAINT进行数据的还原，SADABS程序进行吸收校正^[39]。结构通过SHELXS-2014采用直接法进行解析^[40]，并对初始结构使用全矩阵最小二乘法进行精修。对所有非氢原子进行各向异性处理后，对氢原子进行理论加氢，其中d_C—_H=0.093~0.096 nm，U_iso(H)=1.2U_eq(C)。主要晶体学数据列在表 1中。

  表 1

  

  表 1  探针1分子的晶体数据和结构精修

  Table 1.  Crystal data and structure refinement for probe 1

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  Chemical formula	C25H22BF2N3O2		F(000)	928
  Formula weight	445.26		Crystal size/mm	0.20×0.15×0.15
  Crystal system	Monoclinic		θ range for data collection/(°)	2.7~26.5
  Space group	P21/c		Reflection collected	15 096
  a/nm	1.135 52(11)		Independent reflection	3 553
  b/nm	0.921 72(9)		Completeness to θ=25.50°	0.994
  c/nm	2.162 9(2)		Data, restraint, parameter	3 553, 0, 302
  β/(°)	100.393(3)		Goodness-of-fit on F2	1.08
  V/nm3	2.226 6(4)		Final R indices [I > 2σ(I)]	0.042 0
  Z	4		R indices (all data)	0.056 8
  Dc/(Mg·m-3)	1.328		Refinement method	Full-matrix least-squares on F2
  Absorption coefficient/mm-1	0.096

  CCDC：2062769。

  1.2.5   荧光量子产率的测试

  探针1 的荧光量子产率测试条件如下，选用罗丹明6G为标准，溶解到乙醇溶液中(Ф_F=0.88)，浓度为1 μmol·L^-1，激发狭缝和发射狭缝分别为5 nm，激发波长选用488 nm，荧光光谱的积分范围为493~ 700 nm。荧光量子产率的计算公式：Y_u=Y_s(F_u/F_s)(A_s/A_u)(G_u²/G_s²)。其中，Y_s为罗丹明6G的荧光量子产率，F_u为探针1 的荧光光谱积分面积，F_s为罗丹明6G的荧光光谱积分面积，A_u为探针1 在488 nm处的吸光度，A_s为罗丹明6G在488 nm处的吸光度，G_u为探针 1 在不同溶液中的折射率，G_s为罗丹明6G在乙醇溶液中的折射率。

  1.2.6   金属离子的识别

  将金属离子(Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Hg²⁺、Cd²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Fe³⁺、Al³⁺)溶解到蒸馏水中，浓度为0.1 mol·L^-1，而Cu²⁺溶解到蒸馏水中的浓度为0.005 mol· L^-1。探针1 溶解到DMSO和HAc-NaAc缓冲溶液(4∶ 1，V/V，pH=4.00)，浓度为10 μmol·L^-1。探针1 对常见金属离子选择性实验中，取用3 mL的探针1 到比色皿中，依次分别加入30 μL 0.005 mol·L^-1的Cu²⁺离子和30 μL 0.1 mol·L^-1的其它常见金属离子，测定515 nm处的荧光强度。Cu²⁺识别实验中，取3 mL的探针1 到比色皿中，用微量进样器不断加入Cu²⁺溶液，测定515 nm处的荧光强度。

  1.2.7   细胞成像实验

  RAW细胞由中国科学院上海生化细胞所提供。RAW细胞在37 ℃和体积分数5%的CO₂条件下，于DMEM培养基(12%胎牛血清和1%抗生素)中培养。RAW细胞贴在六孔板并孵育过夜，之后用PB(磷酸盐缓冲溶液)(pH=6.00)溶液洗3次。探针1 溶解到二甲亚砜(DMSO)溶液中并加入到RAW细胞中一起孵育30 h。探针1 在培养基中的浓度为10 μmol·L^-1，多余的探针1 用PB溶液(pH=6.00)清洗3遍，用于细胞成像实验。同时，取用1份相同条件下的RAW细胞，采用上述方法加入探针1，之后补加100 μmol· L^-1的CuSO₄于培养基中孵育1 h，PB(pH=6.00)溶液洗1次，用作细胞成像实验。

  2.   结果与讨论

  2.1   探针1 的晶体结构

  由单晶X射线衍射数据得到的晶体结构椭球图见图 1。该晶体属于单斜晶系，晶体的空间群为P2₁/c。晶体主要的键长和键角见表S1(Supporting information)。探针1 中的BODIPY基团的原子(N1、N2、B、C13、C14、C15、C17、C18、C20、C21、C23、C24) 几乎在一个平面，平均偏差为0.007 91 nm，F1和F2原子分别在该平面的上下两侧，与该平面的距离分别为0.099和0.127 nm。相连的苯基与该BODIPY平面形成的二面角为78.30°，同时苯基与吡啶环(C1、C2、C3、C4、C5、N3)形成的二面角为76.11°。

  图 1

  

  图 1.  探针1的晶体结构: (a) 30%概率水平椭球图和(b) 晶胞堆积图

  Figure 1.  Single crystal structure of probe 1: (a) displacement ellipsoids drawn at 30% ellipse probability level and (b) packing diagram

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  2.2   探针1的光谱学性质

  探针1 具有较好的溶解性，能够溶解到常见的有机溶剂中，但是不溶于水。探针1 在二氯甲烷溶液中的紫外可见吸收光谱图和荧光光谱图如图 2a所示。探针1 具有经典的BODIPY类分子的吸收光谱和荧光光谱。探针1 的最大吸收峰位于503 nm，肩峰位于475 nm，荧光峰位于511 nm。探针1 的斯托克斯位移较小，为10 nm左右。探针1 在不同溶剂中光谱性质如表 2所示，数据显示探针1 的最大吸收峰和荧光峰在不同极性的溶剂中变化很小。但是探针1 的荧光量子产率在不同溶剂中显示出明显的规律，即随着溶剂极性的增大而增大。探针1 在DMSO溶液中的荧光量子产率较大，为0.79。

  表 2

  

  表 2  探针1在不同溶剂中的光谱性质

  Table 2.  Spectroscopic properties of probe 1 in different solvents at 298 K

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  Solvent	λabs, max/nm	lg[εmax/(L·mol-1·cm-1)]	λem/nm	Stocks shift/nm	ΦF
  DMSO	502	4.81	512	10	0.79
  CH3OH	497	4.99	506	9	0.78
  CH3CN	498	4.96	508	10	0.71
  CH3COOC2H5	499	4.99	509	10	0.61
  CH2Cl2	503	4.92	511	8	0.59

  为研究溶液pH对探针1 荧光强度的影响，将探针1 溶解在DMSO与水的混合溶剂(V_DMSO∶V_H2O=4∶1) 中，测试了探针1 在不同pH值的溶液中515 nm处的荧光强度(图 2b)。实验结果表明，探针1 在弱酸性及酸性(pH=3~6)溶液中荧光强度变化不大，在强酸性(pH > 2)溶液中荧光强度下降；探针1 在中性及弱碱性溶液中荧光强度下降，在碱性溶液中荧光猝灭。故在研究探针1 对铜离子识别实验中采用了DMSO和HAc-NaAc缓冲液的混合液(4∶1，V/V，pH=4.00)。

  图 2

  

  图 2.  (a) 探针1在二氯甲烷中的吸收光谱(黑线)和荧光光谱(绿线); (b) 在DMSO/H₂O混合溶剂(4∶1, V/V) 中探针1 (10 μmol·L^-1)的荧光强度(515 nm)随溶液pH变化的曲线

  Figure 2.  (a) Absorption (black line) and fluorescence (green line) spectra of probe 1 in CH₂Cl₂; (b) Effect of pH on fluorescence intensity (515 nm) of probe 1 (10 μmol·L^-1) in DMSO/water mixed solvents (4∶1, V/V)

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  2.3   探针1对常见金属离子识别

  首先，我们测定了探针1 与常见金属离子的荧光响应。将探针1 溶解在DMSO/HAc-NaAc缓冲液(4∶1，V/V，pH=4.00)中，分别加入1 mmol·L^-1常见金属离子(Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Hg²⁺、Cd²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Fe³⁺、Al³⁺)和50 μmol·L^-1 Cu²⁺，静置2 min后测试溶液在515 nm处的荧光强度。荧光测试结果(图 3a)表明，Cu²⁺的加入使探针1 在515 nm处的荧光强度下降了74%；加入20倍的其它常见金属离子(Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Hg²⁺、Cd²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Fe³⁺、Al³⁺)，探针 1 在515 nm处的荧光强度均没有明显的变化。

  图 3

  

  图 3.  (a) 探针1在无金属离子(blank)和加入1 mmol·L^-1不同金属离子或50 μmol·L^-1 Cu²⁺后515 nm处的荧光强度; (b) 探针1加入Cu²⁺ (50 μmol·L^-1)后515 nm处荧光强度随反应时间变化的曲线

  Solvent: DMSO/HAc-NaAc buffer (4∶1, V/V, pH=4.00); λ_ex=475 nm; c1=10 μmol·L^-1

  Figure 3.  (a) Fluorescence intensity of probe 1 before (blank) and after addition of 1 mmol·L^-1 different metal ions or 50 μmol·L^-1 Cu²⁺; (b) Time-dependent fluorescence intensity of probe 1 at 515 nm upon treatment with Cu²⁺ (50 μmol·L^-1)

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  其次，测定了探针1 与Cu²⁺的反应时间，如图 3b所示。实验结果显示，将探针1 溶解到DMSO/HAc-NaAc缓冲液(4∶1，V/V，pH=4.00)中，其515 nm处的荧光强度不随时间的增加而改变；在相同的条件下，在探针1 溶液中加入50 μmol·L^-1的Cu²⁺溶液，其515 nm处的荧光强度随时间的增加发生明显的下降，反应2 min后，荧光强度保持不变。因此，探针1 在DMSO/HAc-NaAc缓冲液(4∶1，V/V，pH=4.00)中能够稳定存在，同时探针1 与Cu²⁺的反应时间为2 min。因此探针1 对Cu²⁺的检测具有选择性，可以作为荧光猝灭型的铜离子荧光探针。

  2.4   探针1对溶液中的铜离子的识别

  我们测试了不同的Cu²⁺加入量对探针1 的荧光光谱的影响，结果如图 4a所示。荧光光谱图表明，随着Cu²⁺加入量的增大，探针1 在515 nm处的荧光强度下降。当加入35倍的Cu²⁺时，515 nm处的荧光强度降为最低。测试了探针1 与Cu²⁺反应后的荧光强度与Cu²⁺浓度的关系。如图 4b所示，纵坐标采用如下公式归一化：R=1-I_i/I_max，其中I_i为探针1 与Cu²⁺反应后的荧光强度，I_max为探针1 未与Cu²⁺反应前的荧光强度。通过线性拟合得到溶液荧光强度和Cu²⁺浓度的关系为y=0.024 38x-0.107 1，线性相关系数为0.982 6，并且计算出探针1 检测Cu²⁺的最低检出限为0.15 μmol·L^-1。因此探针1 可以在溶液中检测Cu²⁺的存在，确实是荧光猝灭型的铜离子荧光探针。

  图 4

  

  图 4.  (a) 加入不同浓度的Cu²⁺后探针1的荧光光谱变化; (b) 探针1在515 nm处归一化的荧光强度随Cu²⁺浓度变化的曲线

  Figure 4.  (a) Fluorescence spectra of probe 1 upon addition of Cu²⁺ with different concentrations (Inset: Dependence of response signal on concentration of Cu²⁺ ions); (b) Curve of normalized fluorescence intensity at 515 nm of probe 1 with change of Cu²⁺ concentration

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  2.5   探针1对Cu²⁺的识别机理研究

  由相关文献^{[23, 38, 41-42]}推断，探针1 识别铜离子的机理如图 5所示。探针1 结构中的酯基在Cu²⁺的作用下发生水解形成化合物4，化合物4 能够发生分子内光诱导电子转移(PET)，具有弱荧光。为了进一步验证这一机理，我们分别对探针1 在加入Cu²⁺前后进行了HRMS质谱测定。如图S3和S4所示，探针1 (C₂₅H₂₃BF₂N₃O₂ [M+H]⁺ m/z 计算值：446.184 6，实验值：446.184 4)加入Cu²⁺后出现新峰(m/z=341.162 3)，该峰可归属于化合物4(C₁₉H₂₀BF₂N₂O [M+H]⁺ m/z= 341.163 1)。由此可以推断，探针1 与Cu²⁺反应产物是中位为4-羟基苯基的BODIPY分子4，能够发生PET，导致分子具有弱荧光。

  图 5

  

  图 5.  探针1对Cu²⁺可能的识别机理

  Figure 5.  Proposed mechanism of probe 1 to Cu²⁺

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  2.6   探针1检测细胞中Cu²⁺

  为了评价探针1 检测生物细胞中铜离子的性能，首先进行了探针1 的细胞毒性实验。具体实验内容为将浓度为0~100 μmol·L^-1的探针1 分别孵育到RAW细胞中5和10 h，检测RAW细胞的存活率，如图 6所示。实验结果表明，孵育5 h，100 μmol·L^-1的探针1 在RAW细胞中存活率高于90%；孵育10 h，80 μmol·L^-1的探针1 在RAW细胞中存活率高于80%。因此探针1 能够用于生物细胞成像实验。

  图 6

  

  图 6.  探针1的细胞毒性实验结果

  Figure 6.  Cytotoxicity test results of probe 1

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  之后，我们测试了探针1 对细胞中Cu²⁺的成像。具体实验内容为在37 ℃下，将10 μmol·L^-1探针1 在RAW细胞中孵育30 min；另取一份探针1 在相同的条件下补加100 μmol·L^-1的Cu²⁺，孵育1 h，分别用485 nm的光激发。结果表明探针1 在RAW细胞中显示绿色的荧光(图 7a、7c)，加入Cu²⁺后探针1 在RAW细胞中的荧光猝灭如图 7d、7f所示。另外我们还检测了探针1 在细胞中的着色位置。实验结果显示细胞质和细胞核染色强度比值较大(I₂/I₁ > 20，图S5)，表明探针1 主要着色到RAW细胞的细胞质。因此，探针1 具有较好的细胞活性，主要着色到细胞质，能够高效检测细胞中铜离子的存在。

  图 7

  

  图 7.  探针1在RAW细胞中共聚焦荧光成像图片、明场下图片及交叠图片: (a) 探针1在RAW细胞中孵育30 min的图片; (b) RAW细胞在(a) 明场下的图片; (c) RAW细胞在(a)、(b) 交叠下的图片; (d) RAW细胞中补加100 μmol·L^-1的Cu²⁺孵育1 h的图片; (e) RAW细胞在(d) 明场下的图片; (f) RAW细胞在(d)、(e) 交叠下的图片

  Figure 7.  Confocal fluorescence imaging image, brightfield image and overlap image of probe 1 in RAW cells: (a) cells incubated with probe 1 for 30 min; (b) bright field image of cells showed in (a); (c) one overlay image of (a), (b); (d) cells incubated with probe 1 for 30 min and then supplemented with 100 μmol·L^-1 of Cu²⁺; (e) bright field image of cells showed in (d); (f) one overlay image of (d), (e)

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  3.   结论

  在BODIPY母核的中位引入功能基团吡啶-2-羧酸苯酚酯基，得到了荧光探针1。采用核磁、质谱、单晶X射线衍射表征了探针1 的分子结构及空间结构。探针1 具有较大的摩尔吸光系数和高荧光量子产率(0.79)。PET原理可以解释铜离子与探针1 作用导致荧光猝灭，故探针1 能够作为一种荧光猝灭型的Cu²⁺荧光探针。探针1 具有较好的生物活性，易着色到细胞质，可用于外源性铜离子的成像检测。

  Supporting information is available at http://www.wjhxxb.cn

  
  
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  Scheme 1  Synthesis route for probe 1

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  图 1  探针1的晶体结构: (a) 30%概率水平椭球图和(b) 晶胞堆积图

  Figure 1  Single crystal structure of probe 1: (a) displacement ellipsoids drawn at 30% ellipse probability level and (b) packing diagram

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  图 2  (a) 探针1在二氯甲烷中的吸收光谱(黑线)和荧光光谱(绿线); (b) 在DMSO/H₂O混合溶剂(4∶1, V/V) 中探针1 (10 μmol·L^-1)的荧光强度(515 nm)随溶液pH变化的曲线

  Figure 2  (a) Absorption (black line) and fluorescence (green line) spectra of probe 1 in CH₂Cl₂; (b) Effect of pH on fluorescence intensity (515 nm) of probe 1 (10 μmol·L^-1) in DMSO/water mixed solvents (4∶1, V/V)

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  图 3  (a) 探针1在无金属离子(blank)和加入1 mmol·L^-1不同金属离子或50 μmol·L^-1 Cu²⁺后515 nm处的荧光强度; (b) 探针1加入Cu²⁺ (50 μmol·L^-1)后515 nm处荧光强度随反应时间变化的曲线

  Figure 3  (a) Fluorescence intensity of probe 1 before (blank) and after addition of 1 mmol·L^-1 different metal ions or 50 μmol·L^-1 Cu²⁺; (b) Time-dependent fluorescence intensity of probe 1 at 515 nm upon treatment with Cu²⁺ (50 μmol·L^-1)

  Solvent: DMSO/HAc-NaAc buffer (4∶1, V/V, pH=4.00); λ_ex=475 nm; c1=10 μmol·L^-1

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  图 4  (a) 加入不同浓度的Cu²⁺后探针1的荧光光谱变化; (b) 探针1在515 nm处归一化的荧光强度随Cu²⁺浓度变化的曲线

  Figure 4  (a) Fluorescence spectra of probe 1 upon addition of Cu²⁺ with different concentrations (Inset: Dependence of response signal on concentration of Cu²⁺ ions); (b) Curve of normalized fluorescence intensity at 515 nm of probe 1 with change of Cu²⁺ concentration

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  图 5  探针1对Cu²⁺可能的识别机理

  Figure 5  Proposed mechanism of probe 1 to Cu²⁺

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  图 6  探针1的细胞毒性实验结果

  Figure 6  Cytotoxicity test results of probe 1

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  图 7  探针1在RAW细胞中共聚焦荧光成像图片、明场下图片及交叠图片: (a) 探针1在RAW细胞中孵育30 min的图片; (b) RAW细胞在(a) 明场下的图片; (c) RAW细胞在(a)、(b) 交叠下的图片; (d) RAW细胞中补加100 μmol·L^-1的Cu²⁺孵育1 h的图片; (e) RAW细胞在(d) 明场下的图片; (f) RAW细胞在(d)、(e) 交叠下的图片

  Figure 7  Confocal fluorescence imaging image, brightfield image and overlap image of probe 1 in RAW cells: (a) cells incubated with probe 1 for 30 min; (b) bright field image of cells showed in (a); (c) one overlay image of (a), (b); (d) cells incubated with probe 1 for 30 min and then supplemented with 100 μmol·L^-1 of Cu²⁺; (e) bright field image of cells showed in (d); (f) one overlay image of (d), (e)

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  表 1  探针1分子的晶体数据和结构精修

  Table 1.  Crystal data and structure refinement for probe 1

  Chemical formula	C25H22BF2N3O2		F(000)	928
  Formula weight	445.26		Crystal size/mm	0.20×0.15×0.15
  Crystal system	Monoclinic		θ range for data collection/(°)	2.7~26.5
  Space group	P21/c		Reflection collected	15 096
  a/nm	1.135 52(11)		Independent reflection	3 553
  b/nm	0.921 72(9)		Completeness to θ=25.50°	0.994
  c/nm	2.162 9(2)		Data, restraint, parameter	3 553, 0, 302
  β/(°)	100.393(3)		Goodness-of-fit on F2	1.08
  V/nm3	2.226 6(4)		Final R indices [I > 2σ(I)]	0.042 0
  Z	4		R indices (all data)	0.056 8
  Dc/(Mg·m-3)	1.328		Refinement method	Full-matrix least-squares on F2
  Absorption coefficient/mm-1	0.096

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  表 2  探针1在不同溶剂中的光谱性质

  Table 2.  Spectroscopic properties of probe 1 in different solvents at 298 K

  Solvent	λabs, max/nm	lg[εmax/(L·mol-1·cm-1)]	λem/nm	Stocks shift/nm	ΦF
  DMSO	502	4.81	512	10	0.79
  CH3OH	497	4.99	506	9	0.78
  CH3CN	498	4.96	508	10	0.71
  CH3COOC2H5	499	4.99	509	10	0.61
  CH2Cl2	503	4.92	511	8	0.59

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