English

• 1.   引言

  核酸适配体也被称为化学抗体，具有分子量小、靶标识别范围广泛、易于体外筛选且成本低、批次间差异小、免疫原性低等特点^[1]。核酸适配体序列一般是通过指数富集配基系统进化技术(SELEX)^{[2, 3]}筛选获得，即利用随机核酸库，经过多轮筛选，将与靶标亲和力较强的核酸链富集，最终筛选得到能与靶标特异性结合的寡核酸链。与抗体相比，目前已有的适配体探针的数目依然很少，核酸适配体筛选技术耗时长、步骤多、成功率低、难以实现自动化等^[4], 限制了适配体筛选以及应用的发展。因此，提高适配体筛选效率依然是目前适配体研究的热点和难点。

  提高适配体筛选效率的关键步骤是分离。在蛋白质等生物大分子靶标的适配体筛选方面，传统的筛选方法基于磁珠分离技术，该技术已被广泛应用于靶分子的筛选分离^[5~7]。但是，基于磁珠分离的适配体筛选通常需要较多的筛选轮数。近年来，研究者采用与微流控芯片集成的方法提高适配体筛选的分离效率，包括毛细管电泳(CE)微流控筛选^{[8, 9]}、溶胶-凝胶微流控筛选^{[10, 11]}、基于磁珠平台的微流控筛选^{[12, 14]}等。本课题组开发了微流控阵列蛋白芯片适配体筛选方法(PMM-SELEX)，具有高筛选效率和良好的重复性^[15]。这些筛选方法的发展有利于提升适配体的筛选效率，减少筛选时间，提高自动化和集成化。

  小分子靶标(包括毒素，药物，重金属离子等)与核酸适配体之间结合位点少、且结合力弱，其尺寸与适配体本身大小相近，靶标分子难于固定^[16]，因此，具有高亲性和高特异性结合的小分子靶标的核酸适配体依然很少。小分子具有广泛的生物功能及临床研究前景，针对小分子靶标展开高效筛选方法的研究具有重要的理论和实际研究意义。然而，传统小分子筛选方法是将分子固定于界面载体上，通过核酸文库的不断结合与洗脱进行筛选，而这种方法可能会改变靶标分子的原始构象，不利于后期识别应用，另外结合位点可能会受到界面的位阻作用而被封闭，造成筛选困难甚至失败。新的筛选方法的出现为小分子靶标筛选提供了更好的选择。例如，毛细管电泳筛选^[17]以及利用纳米材料进行筛选。其中，纳米材料辅助的非靶标固定筛选方法可保证靶分子的完整构象，可明显减少筛选轮数^[18~20]，提高筛选效率。该方法通过氢键、π-π结合、电荷转移等非共价方式与单链DNA进行结合，但不能与其它构象的DNA结合，能够起到分离特异性与非特异性核酸序列的作用，从而缩短筛选周期，提高筛选成功率。

  聚多巴胺具有良好的生物相容性、高淬灭效率、高亲和力、合成过程简单以及无毒等特点^[21]。目前，应用聚多巴胺进行适配体筛选尚未见报道。本研究首先合成了磁性优良的的聚多巴胺纳米磁性微球，考察了对随机ssDNA的吸附效果，建立了以洛美沙星(LMX)为筛选靶分子的聚多巴胺磁性纳米微球适配体筛选方法(MNPs@PDAs-SELEX)。筛选过程中采用回收率进行筛选监控，当达到一定富集效果后，选择培氟沙星(PEFX)、氧氟沙星(OFLX)、诺氟沙星(NFLX)为靶标进行负筛选, 提高次级文库的特异性。待筛选达到一定富集后将筛选产物进行克隆、测序，通过序列重复性分析、二级结构模拟以及等温滴定的方式对得到的候选适配体序列进行研究，以获取对洛美沙星具有高亲和力的核酸适配体序列。

  2.   实验部分

  2.1   仪器与试剂

  Simpli Amp PCR仪(美国Thermo Fisher Scientific公司); CT15RT冷冻离心机(上海天美科学仪器有限公司); DYY-8C电泳仪(北京六一仪器厂); MiniT金属浴(杭州奥盛仪器有限公司); Varioskan Flash酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司); MicroCal iTC-200等温滴定量热仪(英国Malvern公司)。

  洛美沙星(Lomefloxacin, LMX)、培氟沙星(Pefloxacin, PEFX)、氧氟沙星(Ofloxacin, OFLX)、诺氟沙星(Norfloxacin, NFLX)(阿拉丁生化科技股份有限公司(上海)); pBR322 DNA MspⅠ/2X Taq PCR MasterMix (天根生化科技(北京)有限公司); SYBR Premix Ex TaqⅡ(日本Takara Bio公司); ; EB(生工生物工程(上海)股份有限公司); Streptavidin magnesphere^® paramagnetic particles(SA-MPs，美国Promega公司); 10 mmol/L Tris-HCl(pH=8.5);结合缓冲液(pH=7.4，20 mmol/L Tris，140 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，1 mmol/L MgCl₂，1 mmol/L CaCl₂)。所用试剂均为分析纯，实验用水均为18.25 MΩ·cm超纯水。本实验所用核酸文库¹⁵(N40 Lib)及前向引物(FP)、后向引物(RP)均由上海生工生物科技股份有限公司合成，本实验所用ssDNA序列见表 1。

  表 1

  

  表 1  本实验所用ssDNA序列

  Table 1.  Oligonucleotides sequences in this assay

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  名称ssDNA ID	序列Sequence
  N40 Lib	5′-TAMRA-GACAGGCAGGACACCGTAAC-N40-CTGCTACCTCCCTCCTCTTC-3′
  TAMRA-forward prime (r FP)	5′-TAMRA-GACAGGCAGGACACCGTAAC-3′
  Biotin-reverse primer (RP)	5′-GAAGAGGAGGGAGGTAGCAG-biotin-3′
  FP	5′-GACAGGCAGGACACCGTAAC-3′
  RP	5′-GAAGAGGAGGGAGGTAGCAG-3′

  2.2   实验方法

  2.2.1   MNPs@PDAs制备

  纳米磁珠的制备^[22]：取2.6 g FeCl₃和1.0 g柠檬酸三钠，溶于80 mL乙二酸，边搅拌边加入4.0 g乙酸钠，使充分溶解后转移至反应釜中，200℃加热10 h。将产物用超纯水与无水乙醇各清洗3次，真空干燥，于4℃密封保存。

  MNPs@PDAs的制备：取0.045 g多巴胺和0.04 g磁珠于20 mL 10 mmol/L Tris-HCl(pH=8.4)，避光摇振孵育36 h。磁分离，用超纯水清洗5次，最后加入20 mL超纯水重悬，4℃避光保存。

  2.2.2   MNPs@PDAs用量优化

  取2 mg/mL MNPs@PDAs 250 μL，用1×PBSM缓冲液在磁力分离器上清洗3次，最后用250 μL 100 nmol/L随机序列N40 Lib重悬，避光下于37℃分别孵育0、20、40和60 min后，在酶标仪上测定上清液的荧光强度(激发波长530 nm，发射波长560~700 nm)，计算猝灭效率，每个实验重复3次。

  取0.25、0.50、0.75、1.00、1.25和1.5 mg/mL的MNPs@PDAs 250 uL，用1×PBSM缓冲液在磁力分离器上清洗3次，最后用250 μL 100 nmol/L随机序列N40 Lib重悬，于37℃摇床上避光孵育50 min，用酶标仪测定上清液的荧光强度，计算猝灭效率，每个实验重复3次。

  2.3   基于MNPs@PDAs的适配体筛选

  2.3.1   孵育与分离

  (1) 文库复变性处理  取1 nmol N40 Lib于金属浴中95℃加热10 min，随后迅速置于冰上5 min，然后在室温避光平衡25 min后立即使用; (2)基于MNPs@PDAs吸附的ssDNA分离  取10 μL LMX，加入250 μL N40 Lib，置于25℃摇床上避光孵育1 h。加入终浓度为1.5 mg/mL的MNPs@PDAs，25℃孵育50 min，收集上清液; (3)乙醇沉淀与回收率计算  将上清液加入1 μL 5 mg/mL糖原、25 μL 3 mol/L NaOAc、687 μL无水乙醇，于-80℃避光静置20 min，于4℃以15000 r/min离心10 min。弃上清液，加入500 μL 70%冰乙醇，于4℃以15000 r/min离心5 min，弃上清液。最后加92 μL ddH₂O振荡重悬，在酶标仪上测定荧光强度(激发波长530 nm，发射波长560~700 nm)，计算回收率。

  2.3.2   PCR扩增优化

  (1) 预扩增  将上述筛选所得的文库进行10轮的PCR预扩增，以防止PCR轮数优化及操作不当引起ssDNA丢失。预扩增PCR反应体系如下：2× Taq Master Mix 100 μL，20 μmol/L TAMRA-FP 4 μL，20 μmol/L Biotin-RP 4 μL，Template 92 μL。PCR反应条件为：95℃，5 min; 10个循环的94℃，30 s，60℃，30 s，72℃，30 s，72℃，5 min; (2)循环轮数优化  将预扩增产物混合于840 μL ddH₂O进行稀释10倍作为再扩增模板。PCR轮数优化溶液配制方法如下：2× Taq Master Mix 100 μL，20 μmol/L TAMRA-FP 4 μL，20 μmol/L Biotin-RP 4 μL，10-Fold dilutedPre-PCR product 92 μL。进行3、5、7、9、11轮扩增。将扩增产物分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，筛选最佳PCR扩增轮数; (3) PCR再扩增溶液配制方法如下  2× Taq Master Mix 900 μL，20 μmol/L TAMRA-FP 36 μL，20 μmol/L Biotin-RP 36 μL，10-Fold dilutedPre-PCR product 828 μL。在最佳条件下扩增模板。

  2.3.3   DNA双链分离与单链再生

  取1.2 mL SA-MPs (1 mg/mL)，用1 mL 1×PBS (0.1 mg/mL BSA)清洗3次，加入1.6 mL 1× PBS(0.1 mg/mL BSA，0.2 mol/L NaCl)重悬磁珠。加入PCR扩增后的产物，于25℃摇床上避光孵育1 h。磁分离后去上清液，用1 mL 1× PBS(pH 7.4)清洗3次，弃上清液，加入50 μL 0.05 mol/L NaOH溶液，小心涡旋振荡3 min，使正义链与反义链在碱性条件下分离，然后加入50 μL DEPC和125 μL 2× Tris-HCl，涡旋振荡1 min。磁分离后收集上清液，加入25 μL 0.1 mol/L HCl溶液中和，酶标仪测定其浓度(激发波长530 nm，发射560~700 nm)，计算次级库浓度。得到的ssDNA经复变性处理后，作为下一轮的筛选文库。

  2.4   克隆与测序

  经多轮筛选，文库富集进化一定程度后，对筛选文库使用非标记前、后向引物进行PCR预扩增、PCR轮数优化及再扩增(方法见2.2.2节)，克隆和测序由上海生工生物科技股份有限公司完成。测序所得序列首先按重复性进行排序，选取重复次数大于10的序列，使用模拟软件OligoAnalyzer 3.1对所得序列进行二级结构分析。

  2.5   候选序列的ITC亲和力表征

  用筛选缓冲液配制浓度为3.3 μmol/L挑选的候选序列及50 μmol/L氟喹诺酮。为了保证适配序列的正确折叠，在ITC测量前，所有适配体序列进行复变性处理，再真空脱气20 min、25℃恒温处理，保证实验重复性。ITC测定使用MicroCal iTC-200系统(GE Healthcare，Piscataway，NJ)设定，在25℃下测定，用Origin 7.0软件(OriginLab Corp.，Northampton，MA)进行数据分析。

  3.   结果与讨论

  3.1   MNPs@PDAs-SELEX原理

  从复杂文库中高效分离与靶标具有高亲和的ssDNA，去除未结合或者弱结合ssDNA是适配体筛选效率提高的关键步骤。已报道的基于非靶标固定的适配体筛选方法多采用离心法进行分离，耗时且干扰因素多，非特异性ssDNA不能被有效去除，因此，提高分离效率是提高筛选成功率的关键步骤。

  基于MNPs@PDAs-SELEX方法原理如图 1所示，聚多巴胺通过氢键、π-π结合、电荷转移等非共价方式与ssDNA进行结合，但不能与其它构象的DNA结合，能够起到分离特异性与非特异性核酸序列的作用; 此外，磁性的聚多巴胺微球可实现磁性快速分离，从而缩短筛选周期，提高筛选成功率，实验重复性良好。本研究以LMX为筛选靶标，第5轮、第6轮时分别引入PEFX、OFLX、NFLX作为靶标进行反向筛选，提高适配体特异性。本筛选文库为两端各20个碱基的PCR引物区、中间40个碱基的随机序列文库。文库经复变性处理后与LMX孵育，再加入足量MNPs@PDAs进行孵育，充分除去未与靶标结合的序列或者弱结合序列，降低筛选进化过程中的非特异性单链随PCR扩增放大掩盖特异性序列或者导致高亲和序列丢失的可能性，从而保证每轮筛选过程高效完成。

  图 1

  

  图 1.  基于MNPs@PDAs的洛美沙星核酸适配体筛选示意图

  Figure 1.  Lomefloxacin (LMX) aptamers selection based on MNPs@PDAs-SELEX

  MNPs, magnetic nanoparticles; PDAs, polydopamine nanospheres; SELEX, systematic evolution of ligands by exponential enrichment

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  3.2   MNPs@PDAs-SELEX筛选条件优化

  为使未结合ssDNA与靶标结合的特异ssDNA完全分离，减少非特异性吸附，对MNPs@PDA形貌、ssDNA和MNPs@PDAs的用量进行了优化。MNPs@PDAs的SEM照片如图 2A所示，粒径分布见图 2B，合成的MNPs@PDAs粒径均匀，主要集中在420 nm附近，磁珠表面已完全被聚多巴胺包裹，形貌趋于凹凸褶皱，这保证了MNPs@PDAs在使用过程实验的稳定性，可以降低因适配筛选过程长、筛选轮数多所造成的文库丢失和筛选失败的几率。将4份100 nmol/L TAMRA荧光标记的随机序列N40-Lib加入终浓度为2 mg/mL MNPs@PDAs，每隔20 min测定上清液的荧光强度，确定吸附所需的最佳反应时间。如图 2C所示，0~20 min内荧光猝灭迅速(猝灭效率为98.5%)，20 min后荧光猝灭率变化缓慢，在40和60 min时猝灭效率分别为99.5%和99.3%。因次，最佳反应时间选择50 min。MNPs@PDAs浓度与ssDNA荧光淬灭的关系见图 2D，当MNPs@PDAs浓度大于1 mg/mL，猝灭效率均大于99 %，为保证ssDNA充分分离，采用1.5 mg/mL作为筛选实验的最佳条件。

  图 2

  

  图 2.  (A) MNPs@PDAs扫描电镜图; (B) MNPs@PDAs粒径分布; (C)孵育时间与被猝灭后N40-Lib荧光强度关系; (D) MNPs@PDAs浓度与ssDNA猝灭效率关系

  Figure 2.  (A) SEM image of MNPs@PDAs; (B) Particle size distribution; (C) Relationship between incubation time and fluorescence intensity of N40 Lib; (D) Relationship between concentration of MNPs@PDAs and quenching efficiency of ssDNA

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  3.3   MNPs@PDAs-SELEX过程

  筛选过程中，采用荧光定量测定回收率的方法，对每一轮筛选后LMX与文库的结合情况进行监控(图 3)。筛选第1轮、第2轮后，回收率没有明显改变; 筛选第3轮后，随着轮数提高，回收率逐渐增加，至第5轮，筛选富集效率较第1轮提高了71倍。在第6轮开始之前，增加了以PEFX、OFLX、NFLX为靶标的反筛步骤，第6轮的正筛信号发生了明显降低，这表明第5轮的次级文库中含有丰度较高的非特异性结合序列，反筛后文库的总量明显减少。第7轮开始之前同样进行以PEFX、OFLX、NFLX为靶标的反筛。从图 3可见，第7轮的正筛信号发生了明显升高，这可能与第6轮开始之前的负筛有效性有关，进行第7轮负筛时文库总量变化不大，并且经过多轮的富集，可能已得到具有高亲和高特异性的核酸序列。因此，经7轮筛选后不再进一步筛选，将第5、第6、第7轮的筛选文库用无标记的前向引物和后向引物进行10轮的PCR预扩增，然后将PCR预扩增产物稀释10倍进行3轮、5轮、7轮、9轮、11轮的PCR扩增的轮数优化，最后经无标记引物PCR扩增后进行克隆测序。PCR轮数优化的凝胶电泳图如图 4所示，第5、第6、第7轮的筛选文库经10轮预扩增后的最佳的PCR扩增条件分别为9轮、7轮和5轮。在此条件下DNA的凝胶电泳条带明亮，且基本无高聚物等副产物。

  图 3

  

  图 3.  核酸适配体各轮筛选回收率

  Figure 3.  SELEX monitoring by recovery ratio

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  图 4

  

  图 4.  (A) 第5轮、(B)第6轮、(C)第7轮筛选产物PCR轮数优化凝胶电泳图

  Figure 4.  Gel electrophoretogram of re-amplified PCR products : (A) round 5, (B) round 6, (C) round 7. M marker

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  3.4   序列分析

  对适配体筛选的第5轮、第6轮和第7轮产物进行克隆测序，分别对得到的100条序列进行了整理排序，以重复序列大于10为阈值，得到了5条高重复序列(AF-1~AF-5)，其中序列AF-1、AF-3均出现在5、6和7轮产物中，AF-2、AF-4、AF-5出现于6和7轮产物中，具体序列见表 2。

  表 2

  

  表 2  候选适配体序列表

  Table 2.  Candidate aptamers list

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  候选适配体名称 Aptamer ID	候选适配体序列 Sequence of N40 from 5 to 3'	候选适配体结构 自由能ΔG (kcal/mol)	重复次数 Repeated times
  AF-1	GACAGGCAGGACACCGTAACTGCACTGCTCCTTGAGATGGAG CGTAGCTTGTTTCCTCTGCTGCTACCTCCCTCCTCTTC	-11.529	47
  AF-2	GACAGGCAGGACACCGTAACGCGGAGGCGGTAGCAACTGGT ACCGCCGTATGTCACTTGGCTGCTACCTCCCTCCTCTTC	-14.434	21
  AF-3	GACAGGCAGGACACCGTAACGGGTAGCCTCGCGACTCTTGAA GTTAATAGCCGGTGGTCCCTGCTACCTCCCTCCTCTTC	-9.494	18
  AF-4	GACAGGCAGGACACCGTAACACTATAGACGCGGAGCCATCTA CGTCTTGGGCGGTCCATCCTGCTACCTCCCTCCTCTTC	-12.436	12
  AF-5	GACAGGCAGGACACCGTAACAAGAAGTATACTGCATGTCTAT CTTGTGTGGCCAGGCTGTCTGCTACCTCCCTCCTCTTC	-9.356	12

  利用在线的结构绘制软件OligoAnalyzer 3.1(http://sg.idtdna.com/calc/analyzer)对序列进行了二级结构分析。将模拟参数设定为实验条件相同，如Na⁺浓度为140 mmol/L，Mg²⁺浓度为1 mmmol/L，然后进行软件模拟得到二级结构，对得到的5条候选序列(AF-1~AF-5)进行汇总，发现均具有较好的结构稳定性(ΔG＜-9)。图 5为5条候选序列(AF-1~AF-5)的二级结构图，这5条序列多为茎环结构。但需要注意的是，列表中给出的数据是此序列在设定条件下可能性最高的二级结构，具有吉布斯自由能相似的序列均可能存在，且序列结构类型容易受外界条件的影响而改变，因此，适配体在使用过程中应严格控制其与靶标所处条件。

  图 5

  

  图 5.  候选适配体(A)AF-1, (B)AF-2, (C)AF-3, (D)AF-4, (E)AF-5二级结构图

  Figure 5.  The secondary structure of candidate aptamers (A) AF-1, (B) AF-2, (C) AF-3, (D) AF-4 and (E) AF-5

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  3.5   核酸适配体的ITC表征

  经过序列分析和二级结构模拟，利用ITC测定了5种候选适配体与靶标的亲和力。ITC的注射器加入40 μL氟喹诺酮药物分子(50 μmol/L)，300 μL反应室的适配体溶液最初浓度为3.3 μmol/L，滴定时先进行0.5 μL的初始注射，随后进行16次均为2.0 μL的注射。浆式针头注射器旋转速率设定在1000 r/min, 保证反应物的快速混合接触。注射速率为0.5 μL/s，两次注射之间的间隔为120 s，对于平衡时间过短不利于基线恢复至平衡位置的实验组，调整两次注射间隔至300 s。

  采用ITC测试了5条候选序列(AF-1~AF-5)对LMX的亲和性。如图 6B所示, 初始加入LMX时，样品池温度高于参比池，导致信号出现下行波峰，AF-3适配体与洛美沙星具有明显的下行波峰，表明AF-3与洛美沙星分子的反应是放热反应，随着两个池的温度恢复到同一水平，信号也回到起点。通过软件模拟得到AF-3的K_D=(17.57±0.50) nmol/L。而且，实验发现候选序列AF-2对洛美沙星分子也有一定的亲和作用，计算得K_D=(3.60±0.16)μmol/L(如图 6A所示)。实验发现候选适配体序列AF-1、AF-4、AF-5对LMX无亲和作用或作用力较弱，未能拟合得到一定的K_D值(数据未给出)。5条候选序列分别与负筛靶标(OFLX、NFLX、PEFX)的ITC测试结果表明，5条候选序列与OFLX、NFLX、PEFX分子之间具有明显的放热反应，即没有亲和作用。虽然LMX、OFLX、NFLX、PEFX结构较为相似，AF-3只对LMX分子具有较好的亲和性。这表明通过7轮筛选得到了具有高亲和性的LMX的适配体探针。

  图 6

  

  图 6.  ITC测定候选适配体序列(A)AF-2, (B)AF-3与LMX的亲和性实验结果

  Figure 6.  Isothermal calorimetry (ITC) studies for binding kinetics of candidate aptamers (A) AF-2, (B) AF-3 with LMX. 1, ITC result; 2, simulated curve

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  综上可知，具有高度重复性的序列不一定具有高亲和性。为尽量除去类似的高丰度非特异性ssDNA，实验中应提高筛选压力(如盐浓度、文库与靶标比例、洗脱强度等)，去除弱结合的干扰ssDNA，提高筛选效率。

  4.   结论

  建立了一种基于聚多巴胺磁性纳米微球的适配体筛选方法(MNPs@PDAs-SELEX)，成功筛选得到了对洛美沙星具有高亲和性、高特异性的核酸适配体。聚多巴胺对磁性纳米颗粒包裹均匀，MNPs@PDAs单分散性良好，比表面积大，因此能够对ssDNA具有良好的分离效果，MNPs@PDAs的优良吸附性使其能够用于对小分子的核酸适配体的筛选。另外，文库的多样性决定了ssDNA二级结构千差万别，具有自身高度折叠、异源ssDNA之间互补所形成的稳定结构均会影响基于纳米材料吸分离方法的效果。本研究虽然筛选得到了对洛美沙星具有亲和性的核酸序列，但是并未得到大量具有同源性序列的组序列。其次，该序列与靶分子的结合位点和结合方式并不明确，这需要从文库优化策略上对其进行优化和改进。最后，核酸适配体多轮筛选的目的在于对具有高亲和、高特异性序列的序列的富集和文库的收敛，这就需要发展灵敏的文库多样性监控手段和高通量测序手段(HTS)，通过灵敏的多样性监控及HTS对筛选产物中序列高度的覆盖性，可在筛选初期即可获得具有价值的序列信息。

  
  
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      Yang J, Bowser M T. Anal. Chem., 2013, 85(3):1525-1530 doi: 10.1021/ac302721j

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      Gu H J, Duan N, Wu S J, Hao L L, Xia Y, Ma X Y, Wang Z P. Sci. Rep., 2016, 6, 21665/1-9

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      Park J W, Tatavarty R, Kim D W, Jung H T, Gu M B. Chem. Commun., 2012, 48(15):2071-2073 doi: 10.1039/C2CC16473F

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      Tan Y Y, Guo Q P, Xie Q, Wang K M, Yuan B Y, Zhou Y, Liu J B, Huang J, He X X, Yang X H, He C M, Zhao X Y. Anal. Chem., 2014, 86(19):9466-9472 doi: 10.1021/ac502166b

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      Qiang W B, Li W, Li X Q, Chen X, Xu D K. Chem. Sci., 2014, 5(8):3018-3024 doi: 10.1039/C4SC00085D

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      Xie Y J, Yan B, Xu H L, Chen J, Liu Q X, Deng Y H, Zeng H B. ACS Appl. Mater. Interfaces, 2014, 6(11):8845-8852 doi: 10.1021/am501632f

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  图 1  基于MNPs@PDAs的洛美沙星核酸适配体筛选示意图

  Figure 1  Lomefloxacin (LMX) aptamers selection based on MNPs@PDAs-SELEX

  MNPs, magnetic nanoparticles; PDAs, polydopamine nanospheres; SELEX, systematic evolution of ligands by exponential enrichment

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  图 2  (A) MNPs@PDAs扫描电镜图; (B) MNPs@PDAs粒径分布; (C)孵育时间与被猝灭后N40-Lib荧光强度关系; (D) MNPs@PDAs浓度与ssDNA猝灭效率关系

  Figure 2  (A) SEM image of MNPs@PDAs; (B) Particle size distribution; (C) Relationship between incubation time and fluorescence intensity of N40 Lib; (D) Relationship between concentration of MNPs@PDAs and quenching efficiency of ssDNA

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  图 3  核酸适配体各轮筛选回收率

  Figure 3  SELEX monitoring by recovery ratio

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  图 4  (A) 第5轮、(B)第6轮、(C)第7轮筛选产物PCR轮数优化凝胶电泳图

  Figure 4  Gel electrophoretogram of re-amplified PCR products : (A) round 5, (B) round 6, (C) round 7. M marker

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  图 5  候选适配体(A)AF-1, (B)AF-2, (C)AF-3, (D)AF-4, (E)AF-5二级结构图

  Figure 5  The secondary structure of candidate aptamers (A) AF-1, (B) AF-2, (C) AF-3, (D) AF-4 and (E) AF-5

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  图 6  ITC测定候选适配体序列(A)AF-2, (B)AF-3与LMX的亲和性实验结果

  Figure 6  Isothermal calorimetry (ITC) studies for binding kinetics of candidate aptamers (A) AF-2, (B) AF-3 with LMX. 1, ITC result; 2, simulated curve

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  表 1  本实验所用ssDNA序列

  Table 1.  Oligonucleotides sequences in this assay

  名称ssDNA ID	序列Sequence
  N40 Lib	5′-TAMRA-GACAGGCAGGACACCGTAAC-N40-CTGCTACCTCCCTCCTCTTC-3′
  TAMRA-forward prime (r FP)	5′-TAMRA-GACAGGCAGGACACCGTAAC-3′
  Biotin-reverse primer (RP)	5′-GAAGAGGAGGGAGGTAGCAG-biotin-3′
  FP	5′-GACAGGCAGGACACCGTAAC-3′
  RP	5′-GAAGAGGAGGGAGGTAGCAG-3′

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  表 2  候选适配体序列表

  Table 2.  Candidate aptamers list

  候选适配体名称 Aptamer ID	候选适配体序列 Sequence of N40 from 5 to 3'	候选适配体结构 自由能ΔG (kcal/mol)	重复次数 Repeated times
  AF-1	GACAGGCAGGACACCGTAACTGCACTGCTCCTTGAGATGGAG CGTAGCTTGTTTCCTCTGCTGCTACCTCCCTCCTCTTC	-11.529	47
  AF-2	GACAGGCAGGACACCGTAACGCGGAGGCGGTAGCAACTGGT ACCGCCGTATGTCACTTGGCTGCTACCTCCCTCCTCTTC	-14.434	21
  AF-3	GACAGGCAGGACACCGTAACGGGTAGCCTCGCGACTCTTGAA GTTAATAGCCGGTGGTCCCTGCTACCTCCCTCCTCTTC	-9.494	18
  AF-4	GACAGGCAGGACACCGTAACACTATAGACGCGGAGCCATCTA CGTCTTGGGCGGTCCATCCTGCTACCTCCCTCCTCTTC	-12.436	12
  AF-5	GACAGGCAGGACACCGTAACAAGAAGTATACTGCATGTCTAT CTTGTGTGGCCAGGCTGTCTGCTACCTCCCTCCTCTTC	-9.356	12

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