English

• 1.   引言

  石墨烯具有二维蜂巢状的单分子层结构^{[1, 2]},是碳质材料的基本组成单元。氧化石墨烯(GO)是一种石墨烯改性功能化材料,具有优异的电子、机械、热性能和光学性能^[3]。由于其高比表面积(理论值2630 m²/g)和非定域化的π电子体系^{[4, 5]},氧化石墨烯在固相萃取(SPE)^[6]、固相微萃取(SPME)^[7]、磁固相萃取(MSPE)^[8]以及色谱固定相^[9]等方面均有应用。

  氧化石墨烯的骨架和边缘上分布着大量羧基、羟基、环氧基和羰基等活性氧基团^[10],因此较易将其修饰到其它材料的表面^[11]。据报道,氧化石墨烯可以通过其羧基与氨基的反应化学键合到3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰的硅基质表面^[12]。Qu等^[13]使用3-氨丙基三甲氧基硅烷作为交联剂,将氧化石墨烯纳米片固定到毛细管柱内壁,用于芳香族化合物的分离。由于GO结构中具有大π键、大量羟基及羧基等作用位点,对多种样品的吸附能力过强,限制了其作为色谱分离介质的应用。

  毛细管开管柱具有制备方法简单、柱压低等优点,采用超长毛细管开管柱可有效提高绝对柱效,改善分离效果,但毛细管开管柱同时又存在相比低、样品容量小的缺点。多孔涂层开管(PLOT)^{[14, 15]}毛细管液相色谱柱,尤其是聚合物基质的PLOT^{[16, 17]}能够在一定程度上改善开管柱的色谱分离性能。Karger课题组^{[18, 19]}发表了一系列将超长细内径PLOT柱用于蛋白质组学研究的文章,获得了超低检测限和超高峰容量。

  本研究采用Luo 等^[18]的方法制备PLOT柱,在毛细管内壁形成球形分散结构的聚氯甲基苯乙烯二乙烯基苯涂层,进一步在聚合物涂层上修饰GO^{[20, 21]},利用GO对样品的强吸附作用弥补开管柱样品容量不足的缺陷,并对制备的色谱柱加以表征和评价。

  2.   实验部分

  2.1.   仪器与试剂

  P1201S高压恒流泵(大连依利特分析仪器有限公司);紫外检测器(苏州汇通色谱分离纯化有限公司);超声波清洗仪(Autoscience,天津奥特赛恩斯仪器有限公司);Nova Nano SEM 450扫描电子显微镜 (SEM,荷兰FEI公司);JEM-2100透射电子显微镜(TEM,日本JEOL公司);Iuvia refl激光显微拉曼光谱仪(英国Renishaw公司);实验用水经 Sartorius Arium 611纯水仪(德国Sartorius公司) 纯化。

  熔融石英毛细管(25 μm i.d.×365 μm o.d.,邯郸市鑫诺光纤色谱有限公司);4-氯甲基苯乙烯(VBC)、苊、蒽、邻苯二酚、对苯二酚、苯胺、对氯苯胺、1-萘胺、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤(上海阿拉丁试剂有限公司);异丙基苯、萘、间苯二酚(国药集团化学试剂有限公司);二乙烯基苯(DVB)、偶氮二异丁氰(AIBN)、3-(三甲氧基甲硅基)甲基丙烯酸丙酯(γ-maps)(美国Sigma-Aldrich公司);乙二胺、硫脲、苯、甲苯、乙基苯(凌峰试剂有限公司);2,4,6-三氟苯胺(瑞士阿达玛斯试剂公司);氧化石墨烯(先丰纳米有限公司);乙腈(ACN,色谱纯),甲醇(Methanol,色谱纯)购自山东禹王实业有限公司。

  烷基苯类、多环芳烃类、苯酚类和苯胺类储备液用乙腈进行配制,混合样品溶液用50% (V/V)ACN进行稀释;核酸碱基类样品用1 mol/L NaOH进行配制。所用样品溶液使用前用0.45 μm滤膜过滤,并超声5 min得到无气泡均相溶液。

  2.2.   GO修饰PLOT柱的制备

  石英毛细管(3 m × 25 μm i.d. × 365 μm o.d.)依次用0.1 mol/L NaOH、H₂O、0.1 mol/L HCl 和H₂O冲洗1 h,N₂吹干。用注射器推入γ-maps-甲醇溶液(1∶1,V/V),两端封口后,60℃水浴加热12 h。甲醇冲洗后N₂吹干。取 AIBN(2 mg),VBC(200 μL)和DVB(200 μL)溶于甲醇(600 μL),超声混匀后充入毛细管柱中,70℃水浴反应16 h后以甲醇冲洗,N₂吹干。处理后的毛细管通入乙二胺,70℃反应24 h,进行原位改性,以甲醇冲洗,N₂吹干。将0.2 mg/mL GO分散液通入上述处理的PLOT柱,70℃水浴加热反应4 h,以H₂O冲洗后保存备用。GO修饰PLOT柱的制备机理如图 1所示。

  图 1

  

  图 1  GO-PLOT柱的制备流程图

  Figure 1.  Schematic representation of the fabrication processes of graphene oxide-porous layer open tubular (GO-PLOT) columns

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  3.   结果与讨论

  3.1.   GO修饰PLOT柱固定相结构的表征

  图 2为GO-PLOT柱的横截面扫描电镜图,可以看到毛细管柱内壁均匀分布一层球状物,说明聚氯甲基苯乙烯二乙烯基苯涂层在毛细管柱内呈现球形分散结构,极大地增加了毛细管柱内壁的比表面积。图 3是GO修饰前后聚合物颗粒的透射电镜图。图 3a中颗粒表面光滑,而图 3b中颗粒的表层上明显覆盖一层充满褶皱的片状物,证明氧化石墨烯已成功键合到聚合物涂层上。

  图 2

  

  图 2  GO-PLOT柱的扫描电镜图

  Figure 2.  Scanning electron microscope images of GO- PLOT column

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  图 3

  

  图 3  柱内聚合物(a)以及GO修饰聚合物(b)的透射电镜图

  Figure 3.  roscope images of (a) porous layer and (b) GO modified porous layer

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  对氧化石墨烯修饰前后的聚合物层进行拉曼光谱分析(图 4)。氧化石墨烯涂覆后的聚合物层拉曼光谱(图 4b)与聚合物层拉曼光谱(图 4a)相比,在1350和1600 cm^-1左右有两个明显的吸收峰,分别为D峰和G峰,这两个吸收峰是氧化石墨烯的特征峰。

  图 4

  

  图 4  氧化石墨烯修饰前(a)后(b)的聚合物层的拉曼光谱图

  Figure 4.  Raman spectra of porous layer (a) and GO modified porous layer (b)

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  通过以上扫描电镜、透射电镜和拉曼光谱等对固定相的表征,证明聚氯甲基苯乙烯二乙烯基苯涂层以球形分散结构均匀分布于毛细管柱内壁,片状的氧化石墨烯通过化学键合覆盖在球形聚合物层的表面。

  3.2.   GO-PLOT柱色谱性能评价

  3.3.   重复性及稳定性考察

  重复性及稳定性是考察色谱柱性能的一项很重要的指标。实验选取邻苯二胺、苯胺和2,4,6-三氟苯胺3种组分对GO-PLOT柱的重复性及稳定性进行考察,结果见表 2。次间、日间以及柱间的相对标准偏差都在0.3%~2.0%范围内,证明在液相色谱模式下,所制备的GO-PLOT色谱柱的稳定性及重复性良好。实验中GO-PLOT柱可正常运行200次以上(图 11),如此长的柱寿命也再一次证明氧化石墨烯纳米片通过共价键合修饰在毛细管柱内壁。

  表 2

  

  表 2  GO-PLOT柱的重复性和稳定性考察(n=6)

  Table 2.  Reproducibility and stability of GO-PLOT column (n=6)

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  	邻苯二胺o-Phenylenediamine			苯胺Aniline			2,4,6-三氟苯胺2,4,6-Trifluoroaniline
  	保留时间Rete(nmtioinn)time	相对标准偏差Reladtievveiasttiaonndard(%)		保留时间Rete(nmtioinn)time	相对标准偏差Reladtievveiasttiaonndard(%)		保留时间Rete(nmtioinn)time	相对标准偏差Reladtievveiasttiaonndard(%)
  次间Runtorun	8.04	0.3		9.05	0.4		10.28	0.9
  日间Daytoday	8.02	0.5		9.04	1.0		10.28	1.5
  柱间Columntocolumn	8.24	2.0		9.20	1.5		10.41	1.6
  实验条件同图 9(Experiment conditions are the same as in Fig. 9)。

  图 11

  

  图 11  GO-PLOT柱的稳定性考察

  Figure 11.  Stability of GO-PLOT column

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  3.2.2.   多环芳烃的分离

  图 7为4种多环芳烃(PAHs)的分离效果图。4种多环芳烃的峰宽随洗脱时间增加逐步增大,并且出现了拖尾,以75%乙腈洗脱,不对称因子达到3.04。氧化石墨烯具有大的离域π电子体系,多环芳烃也具有π电子结构,二者之间既存在疏水相互作用,又有π-π堆叠作用^[22],因此多环芳烃类化合物与氧化石墨烯之间相互作用力较强,且共轭体系越大π-π堆叠作用也较强,最终导致苊和蒽拖尾。

  图 7

  

  图 7  多环芳烃的分离色谱图

  Figure 7.  Chromatogram for the separation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs)

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  3.2.3.   酸性化合物的分离

  3种弱酸性苯二酚异构体在GO-PLOT柱上的分离情况见图 8。氧化石墨烯和酚类化合物之间包含多种相互作用,除疏水相互作用和π-π堆叠作用外,还包含氢键相互作用。氧化石墨烯的骨架和边缘处含有多种含氧官能团,如羧基、羟基和环氧基等,这些含氧基团与酚类化合物之间可以形成氢键相互作用。此外,毛细管内壁上未完全覆盖的硅羟基及聚合物层上残留的氨基,也可能与分析物之间形成氢键作用。GO-PLOT色谱柱与酚类物质之间作用位点多,相互作用力多样化, 有望用于复杂酚类物质的分离。

  图 8

  

  图 8  酸性化合物的分离色谱图

  Figure 8.  Chromatogram for the separation of acidic compounds

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  3.2.5.   核酸碱基的分离

  核酸碱基由于极性较强,在反相色谱中几乎没有保留,通常很难实现分离。本研究选取一组核酸碱基在GO-PLOT色谱柱上进行分离,分离情况如图 10所示,4种核酸碱基在GO-PLOT柱上的分离效果良好。氧化石墨烯的强吸附能力增大了核酸碱基的保留,这是疏水相互作用、π-π堆叠作用和氢键相互作用共同作用的结果。

  图 10

  

  图 10  核酸碱基的分离色谱图

  Figure 10.  Chromatogram for the separation of nucleobases

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  3.2.1.   烷基苯的分离

  图 5为苯,甲苯,乙基苯,异丙基苯的分离色谱图。从图 5可见,4种烷基苯可以在GO-PLOT色谱柱上实现良好分离,洗脱顺序与它们的疏水性一致。说明烷基苯与GO-PLOT色谱柱之间以疏水相互作用为主,其分子量越大,疏水性越强,与氧化石墨烯的相互作用力越强,保留时间越长。流动相中乙腈含量与烷基苯保留因子对数的线性关系见图 6。4种烷基苯保留因子的对数与ACN含量线性相关(R²>0.97),可见GO-PLOT色谱柱对4种烷基苯的分离符合反相色谱保留机理。

  图 5

  

  图 5  烷基苯的分离色谱图

  Figure 5.  Chromatogram for the separation of alkylbenzenes

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  图 6

  

  图 6  乙腈含量与烷基苯保留因子对数的关系图

  Figure 6.  Relationship between acetonitrile (ACN) percentage and retention factors of alkylbenzenes

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  3.2.4.   碱性化合物的分离

  如图 9所示,5种芳香胺类弱碱性化合物在GO-PLOT柱上实现了基线分离。表 1列出了硫脲和5种胺类化合物的分离度、半峰宽和理论塔板数。分离度达到2.29以上,最大理论塔板数达到5万以上,5种化合物在20 min内完成出峰,证明GO-PLOT色谱柱具有高柱效、快速分析等优点。

  图 9

  

  图 9  碱性化合物的分离色谱图

  Figure 9.  Chromatogram for the separation of basic compounds

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  表 1

  

  表 1  碱性化合物的分离度、半峰宽以及柱效

  Table 1.  Comparison of resolution,peak width at half height and column efficiency of basic compounds

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  	硫脲Thiourea	邻苯二胺o-Phenylenediamine	苯胺Aniline	2,4,6-三氟苯胺2,4,6-Trifluoroaniline	对氯苯胺p-Chloroaniline	1-萘胺1-Naphthylamine
  分离度 Resolution		2.29	3.38	2.81	2.97	3.22
  半峰宽 Half-peak width	0.08	0.15	0.17	0.29	0.47	1.23
  柱效 Column efficiency	55429	17144	15815	7054	3656	1029

  除了疏水相互作用,GO-PLOT柱与芳香胺类化合物之间还存在π-π堆叠作用,从5种物质的色谱图可对分离机理进行推测。1-萘胺在5种检测物中疏水性最强,另一方面,因其存在萘环,与氧化石墨烯之间π-π堆叠作用更强,因此保留时间最长,峰宽最大;2,4,6-三氟苯胺上的氟取代基具有很强的吸电子作用,减弱了其苯环上的π电子云密度,与柱内壁氧化石墨烯之间的π-π堆叠作用减弱,比极性强于它的对氯苯胺更先出峰,说明其与固定相之间的π-π堆叠作用占主导地位。其它3种物质则极性强的先出峰,极性弱的物质后出峰,以疏水相互作用为主导。

  实验表明,中性、酸性和碱性化合物均可以在GO-PLOT柱上实现良好分离。π-π堆叠作用、疏水相互作用和氢键作用形成的混合保留模式,使GO-PLOT色谱柱与传统的反相色谱柱相比拥有独特的色谱分离性能。

  4.   结 论

  通过共价键合的方式制备GO修饰的毛细管开管色谱柱,并采用SEM、TEM、Raman等手段对固定相结构加以表征。结果表明,形成的球状聚合物均匀分散在柱内壁,而在其表面修饰的GO具有很高的比表面积,可极大地提高固定相的比表面积,改善所制备色谱柱的分离性能。与传统的反相色谱柱相比,GO-PLOT色谱柱具有独特的色谱性能,这归功于其多作用位点的混合保留模式,包括π-π堆叠作用、疏水相互作用和氢键相互作用等。烷基苯、中性多环芳烃、苯酚类化合物、苯胺类化合物以及核酸碱基等均可以得到良好分离。多次运行后,次间、日间及柱间保留时间的相对标准偏差均小于2.0%,证明GO-PLOT色谱柱具有良好的重复性和稳定性。所发展的柱制备方法及得到的结果为氧化石墨烯用 于色谱固定相提供了一种可能的途径。

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  Figure 1  Schematic representation of the fabrication processes of graphene oxide-porous layer open tubular (GO-PLOT) columns

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  Figure 2  Scanning electron microscope images of GO- PLOT column

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  Figure 3  roscope images of (a) porous layer and (b) GO modified porous layer

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  Figure 4  Raman spectra of porous layer (a) and GO modified porous layer (b)

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  Figure 5  Chromatogram for the separation of alkylbenzenes

  流动相(Mobile phase): 乙腈(Acetonitrile)-水(Water)(44∶56,V/V); 流速(Flow rate): 0.28 μL/min; 紫外检测波长(λ):254 nm。 1. 硫脲(Thiourea); 2. 苯(Benzene); 3. 甲苯(Toluene); 4. 乙苯(Ethylbenzene); 5. 异丙基苯(Cumene)。

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  Figure 6  Relationship between acetonitrile (ACN) percentage and retention factors of alkylbenzenes

  流动相(Mobile phase): 水含量由60%降低到40%(The water content decreases from 60% to 40%),其它条件同图 5(Other conditions are the same as in Fig. 5)。

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  Figure 7  Chromatogram for the separation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs)

  流动相(Mobile phase):乙腈(Acetonitrile)-水(Water) (75∶25,V/V);流速(Flow rate): 0.18 μL/min;紫外检测波长(λ): 254 nm。1. 苯(Benzene); 2. 萘(Naphthalene); 3. 苊(Acenaphthene); 4. 蒽(Anthracene)。

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  Figure 8  Chromatogram for the separation of acidic compounds

  流动相(Mobile phase):乙腈(Acetonitrile)-水(Water) (60∶40,V/V);其它条件同图 7(Other conditions are the same as in Fig. 7)。 1. 对苯二酚(Hydroquinone); 2. 间苯二酚(Resorcinol); 3. 邻苯二酚(Catechol)。

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  Figure 9  Chromatogram for the separation of basic compounds

  流动相(Mobile phase):乙腈(Acetonitrile)-水(Water) (40∶60,V/V);其它条件同图 7(Other conditions are the same as in Fig. 7)。1. 硫脲(Thiourea); 2. 邻苯二胺(o-Phenylenediamine); 3. 苯胺(Aniline); 4. 2,4,6-三氟苯胺(2,4,6-Trifluoroaniline); 5. 对氯苯胺(p-Chloroaniline); 6. 1-萘胺(1-Naphthylamine)。

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  Figure 10  Chromatogram for the separation of nucleobases

  流动相(Mobile phase):乙腈(Acetonitrile)-0.02 mol/L醋酸铵(Ammonium acetate) (3∶97,V/V);其他条件同图 7(Other conditions are the same as in Fig. 7)。1. 胞嘧啶(Cytosine); 2. 尿嘧啶(Uracil); 3. 胸腺嘧啶(Thymine); 4. 腺嘌呤(Adenine)。

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  Figure 11  Stability of GO-PLOT column

  (a)第一次分离的色谱图(Chromatogram of first run);(b)运行50次之后的色谱图(Chromatogram after over 50 runs);(c)运行100次之后的色谱图(Chromatogram after over 100 runs);(d)运行200次之后的色谱图(Chromatogram after over 200 runs)。其它实验条件同图 9(Other conditions are the same as in Fig. 9)。

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  Table 1.  Comparison of resolution,peak width at half height and column efficiency of basic compounds

  	硫脲Thiourea	邻苯二胺o-Phenylenediamine	苯胺Aniline	2,4,6-三氟苯胺2,4,6-Trifluoroaniline	对氯苯胺p-Chloroaniline	1-萘胺1-Naphthylamine
  分离度 Resolution		2.29	3.38	2.81	2.97	3.22
  半峰宽 Half-peak width	0.08	0.15	0.17	0.29	0.47	1.23
  柱效 Column efficiency	55429	17144	15815	7054	3656	1029

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  Table 2.  Reproducibility and stability of GO-PLOT column (n=6)

  	邻苯二胺o-Phenylenediamine			苯胺Aniline			2,4,6-三氟苯胺2,4,6-Trifluoroaniline
  	保留时间Rete(nmtioinn)time	相对标准偏差Reladtievveiasttiaonndard(%)		保留时间Rete(nmtioinn)time	相对标准偏差Reladtievveiasttiaonndard(%)		保留时间Rete(nmtioinn)time	相对标准偏差Reladtievveiasttiaonndard(%)
  次间Runtorun	8.04	0.3		9.05	0.4		10.28	0.9
  日间Daytoday	8.02	0.5		9.04	1.0		10.28	1.5
  柱间Columntocolumn	8.24	2.0		9.20	1.5		10.41	1.6
  实验条件同图 9(Experiment conditions are the same as in Fig. 9)。

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