目前，光学成像具有无创性、实时、高分辨率的特点，在疾病的早期诊断和具有重要意义，其中近红外(near-infrared，NIR)成像其发射波长位于700~ 1 000 nm，在该范围内生物组织自发荧光较少，吸收低，近年来成为生物成像研究的热点。NIR染料应用于生物成像可最大限度的降低背景干扰，增加组织穿透深度[1-2]。如小分子染料吲哚菁绿(indocyanine green，ICG)作为造影剂已被美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准应用于临床手术导航和淋巴结的指示。但大部分NIR染料发光效率底、水溶性差、在生物体内造影时间短[3]。因此将纳米材料对NIR染料进行包裹，有利于克服上述局限性，拓展其在生物医药领域的应用[4-5]。
近年来，纳米材料功能化后被用作诊断和治疗的工具，在疾病的诊疗领域被广泛关注[6-8]。比如基于纳米结构的造影剂被大量开发，用于对病理结构进行高信噪比的成像[9-10]。其中二氧化硅(SiO2)纳米颗粒作为一种生物相容性好的非金属无机材料，尤其是介孔SiO2纳米材料具有较大的孔容和比表面积，在酶固定、药物递送、生物成像等方面显示出广阔的应用前景[11-13]。目前，荧光SiO2纳米材料的常用合成方法是先制备介孔SiO2粒子，再将荧光染料吸附到SiO2的介孔孔道中[14-15]。该方法存在荧光染料容易从孔道中脱附的弊端，而且所制备的荧光SiO2纳米材料因表面无特殊功能化，容易被网状内皮系统(reticulo-endothelial system，RES)识别，并在肝脏、脾脏、肺等器官中长期蓄积，造成机体的长期毒性[16]。
本文利用三嵌段共聚物(Pluronic F108)和氧化硅前驱体合成单体，后通过自组装，获得内部中空的氧化硅聚合物杂化纳米体系[17-18]。由于嵌段共聚物为两亲性的PEO132-PPO50-PEO132，聚环氧乙烷(poly(ethylene oxide)，PEO)链可伸展于纳米颗粒表面，形成配体，与后修饰的PEG配体相比，合成方法更简单，不受修饰位点限制，密度更高，能有效阻止RES系统的识别和截获，有助于氧化硅纳米材料获得更长的循环时间。聚环氧丙烷(poly(propylene oxide)，PPO)与氧化硅前驱体共价连接，组装时形成疏水空腔，疏水染料或药物与PPO通过疏水-疏水相互作用，形成较为稳定的结构，不易从空腔中逃逸，功能化的杂化氧化硅纳米体系得以构建[19]。在此我们使用易挥发的溶剂环己烷作为扩孔剂，温和条件下可被完全除去，以获得更大的中空结构，负载更多疏水染料或药物。我们进一步合成了一种发光效率高的NIR疏水染料M507，通过疏水-疏水作用简单、快捷地将M507负载在氧化硅-共聚物杂化纳米颗粒内部空腔中，构建了小尺寸的近红外纳米探针(图 1)，并在活体层次开展尾静脉注射后的动物整体成像实验和足垫注射后的前哨淋巴结成像实验。
N-聚丙二醇与环氧乙烷嵌段共聚物(Pluronic F108)、四乙氧基硅烷(tetraethoxysilane，TEOS)、二乙氧基二甲基硅烷(dimethyldimethoxysilane，DEDMS)，盐酸(HCl)，胺丙基三乙氧基硅烷(aminopropyl trie-thoxysilane，APES)，均购买自Sigma-Aldrich化学试剂公司。丙二醛双苯亚胺单盐酸盐(malo-naldehyde bis(phenylimine) monohydrochlride)购买自百灵威科技有限公司。以上药品均为分析纯，使用过程中不需要进一步提纯。实验用水均为去离子水。碘化1-乙基-2，3，3-三甲基苯并吲哚盐和1-乙基-4-甲基喹啉碘化物照文献[20]的方法合成。
人宫颈癌细胞HeLa细胞购买自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。4周大的雌性Balb/c裸鼠购买自上海斯莱克实验动物有限公司。动物实验流程均符合动物管理与使用委员会的规则标准。
利用透射电子显微镜JEOLJEM-2010F(TEM，200 kV)表征纳米材料的尺寸和形貌，将纳米材料分散在水中，取一滴于铜网上，自然晾干后进行表征。
紫外吸收光谱于PTI公司的QM40稳态/瞬态荧光光谱仪上测试。荧光发射光谱于Edinburgh公司的LFS920荧光光谱仪上测试。粒径分布于Malvern公司的纳米粒度-Zeta电位分析仪上进行测试。绝对量子效率于Hamamatsu instrument公司的C13532-12 Quantaurus-QY plus测量系统进行测试。
染料M507按照图 2所示的路线合成。在50 mL三口烧瓶中，分别加入1.3 g 1-乙基-2，3，3-三甲基苯并吲哚碘化物1.0 g丙二醛双苯亚胺单盐酸盐(物质的量之比为1:1.1)，然后加入20 mL醋酸酐(Ac2O)，1 mL醋酸(AcOH)，0.5 g醋酸钾(AcOK)，在氮气氛围下，于90 ℃持续搅拌反应2 h，然后再加入0.9 g 1-乙基-4-甲基喹啉碘化物继续反应2 h。将反应液冷却至室温后加入到200 mL水中，搅拌并缓慢加入碳酸氢钠至无气泡产生。使用二氯甲烷萃取后加入无水硫酸钠干燥，旋干除去溶剂后，得到的粉末以二氯甲烷和甲醇为洗脱液(二氯甲烷与甲醇体积之比为10:1)，在硅胶柱上分离提纯，得到目标染料M507。染料的结构通过质谱与核磁进行确认，并计算产率为52%。
嵌段共聚物F108与二氯甲烷(质量之比为2:1)分散于30 mL的2.0 mol·L-1盐酸溶液中，充分搅拌30 min后，得到透明溶液；再加入1.0 mL四乙氧基硅烷(TEOS)，15 min后再加入二乙氧基二甲基硅烷(DEDMS)，同时加入一定量的环己烷作为扩孔剂，持续搅拌3 h。充分透析去除杂质，然后在50 ℃下旋蒸去除二氯甲烷，将所得的二氧化硅-聚合物杂化纳米复合材料(SNP)分散在水中保存。
将1.5 mg的M507染料溶于50 μL二氯甲烷中，将此溶液注入SNP水溶液(浓度为10 mg·mL-1)中，超声使其分散均匀；然后在50 ℃下，旋蒸去除二氯甲烷；产物在水中分散，透析洗去游离的M507染料，得到纳米复合材料M507@SNP。
根据文献[21]，在体积百分数为5% CO2和95%空气氛中，37 ℃下孵育12 h。待HeLa细胞贴壁后，用DMEM (Dulbecco′s Modified Eagle Medium)培养液稀释不同浓度的M507@SNP，培养箱中孵育24 h。分别在每个孔里加入20 μL浓度为5 mg· mL-1的3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bro-mide，MTT)溶液，将96孔板继续孵育4 h，在每个孔里加入二甲亚砜(DMSO) 100 μL，在培养箱中放置20 min后，用酶标仪测试96孔板中每个孔在490 nm处的吸收光强度(即OD490值)的吸收光强度。用以下公式计算细胞存活率：
|
$ {\rm{Cell}}\;{\rm{viability}} = \frac{{{\rm{O}}{{\rm{D}}_{{\rm{Sample}}}} - {\rm{O}}{{\rm{D}}_{{\rm{Blank}}}}}}{{{\rm{O}}{{\rm{D}}_{{\rm{Control}}}} - {\rm{O}}{{\rm{D}}_{{\rm{Blank}}}}}} \times 100\% $ |
其中Cell viability为细胞存活率，ODSample、ODBlank和ODControl分别为样品的OD490平均值、空白的OD490平均值和对照的OD490平均值。
向健康4周龄雌性Balb/c裸鼠尾静脉注射0.2 mL的M507@SNP(1.0 mg·mL-1)溶液。注射24 h后对小鼠进行麻醉，在小动物活体成像系统中进行成像[22]，激发波长为730 nm，功率密度为40 mW·cm-2, 收集波长为(800±12) nm。通过断颈处死小鼠后，剖开其腹部，暴露主要器官，再次进行荧光成像。
向健康4周龄雌性Balb/c裸鼠的右侧足垫注射0.02 mL的M507@SNP(1.0 mg·mL-1)溶液。注射24 h后对小鼠进行麻醉，在小动物活体成像系统中成像，激发波长为730 nm, 功率密度为40 mW·cm-2, 收集波长为(800±12) nm。通过断颈处死小鼠后，剖开其腿部皮肤，暴露前哨淋巴结，再次进行荧光成像。
合成的二氧化硅-聚合物杂化纳米复合材料SNP通过透射电镜对其形貌和粒径进行表征。图 3a为由三嵌段共聚物F108和氧化硅前驱体自组装形成的纳米结构，环己烷的加入可作为扩孔剂得到空心结构。SNP为粒径均一的单分散空心纳米球状颗粒，其直径约为31 nm。动态光散射(DLS)测试表明该粒子约为41 nm，如图 3b所示。所制备的纳米材料SNP具有空心结构，内部空腔直径约为10 nm，为后续负载有机染料M507提供了可能性。
基于先前的工作[23]，我们以Cy5.5为基础，将苯并吲哚替换为喹啉来设计近红外染料分子，合成了喹啉-苯并吲哚结构的M507。我们使用质谱和核磁对M507的结构进行了确认，如图 4所示，M507对应的最强峰位置在445.190 8，图 5的1H NMR谱图都能很好地对应解释，证明了产物的纯度。1H NMR(400 MHz，CDCl3)：δ 9.45(d，J=6.6 Hz，1H)，8.40(d，J=8.3 Hz，1H)，8.13(d，J=8.4 Hz，2H)，7.95~7.84(m，5H)，7.72(t，J=7.4 Hz，1H)，7.58(t，J=7.0 Hz，1H)，7.57(dd，J=14.2，7.1 Hz，1H)，7.44~7.33(m，1H)，7.19(d，J=8.7 Hz，1H)，7.00(d，J=13.9 Hz，1H)，6.50(t，J=12.3 Hz，1H), 5.77(d，J=12.9 Hz，1H)，4.93~4.81(m，2H)，3.99(s，2H)，1.71(t，J=7.1 Hz，3H)，1.60(s，6H)，1.42(s，3H)。
我们考察了M507染料的吸收性质和荧光性质。图 6给出了M507在二氯甲烷中的紫外可见吸收与荧光发射光谱。其最大吸收峰位于738 nm，其发射峰位于820 nm。相比于对称的染料Cy5，用喹啉盐替代一个苯并吲哚盐后，其最大吸收比Cy5(λabs=678 nm)红移了60 nm，相应地，发射峰红移120 nm。M507的光谱发生明显的红移，比FDA批准容许临床使用的染料ICG的发射波长更长，为后续纳米探针的构建和生物成像实验的开展提供了新的思路。而且，通过绝对量子效率测量系统测出M507在DMSO中的绝对量子效率高达10.1%。经过比尔-朗伯定律计算得到M507吸收的摩尔消光系数为8×104 L·mol-1·cm-1。
成像探针的发光稳定性对其能否在活体层次进行长时间的成像起着决定性作用。我们通过紫外吸收光谱对构建的近红外纳米材料M507@SNP的光稳定进行监测。图 7给出了M507@SNP在比较苛刻的条件(较高的光功率密度：730 nm激光，300 mW·cm-2；无氮气保护)下的连续光照(30 min)时的光稳定性数据。在30 min的连续光照下，染料的吸光度仅下降约20%，表明即使在苛刻的实验条件下，M507@SNP仍显示了良好的光稳定性。由于每次生物成像时激光照射时间较短(< 0.5 min)，因此，激光照射造成的光漂白影响(< 0.4%)几乎可忽略不计。
作为荧光成像探针，必须评估M507@SNP自身的细胞安全性。我们利用MTT毒性分析法，测试了不同浓度的M507@SNP对HeLa细胞的生理毒性。如图 8所示，当M507@SNP浓度高达1.0 mg·mL-1时，细胞存活率仍能保持在80%以上，表明纳米探针M507@SNP具有良好的生物相容性，可用于进一步活体实验。
在活体层次上，我们开展了纳米探针M507@SNP的小鼠尾静脉注射成像实验，并利用M507的近红外荧光信号((800±12) nm)对动物体内的纳米探针进行成像跟踪。图 9给出了纳米探针M507@SNP注射24 h后进行的成像实验结果，从图 9可知，组织的自发荧光对荧光成像没有任何影响；即使在未解剖的条件下，肝脏和脾脏区域均显现出强烈的荧光信号。解剖后肝脏和脾脏处的荧光信号更明显，且轮廓清晰，这是由于2个器官含有大量巨噬细胞，为网状内皮系统的主要器官，因此纳米探针会在肝脏和脾脏处富集。
为了进一步验证M507@SNP在活体层次对前哨淋巴结造影的效果，我们在小鼠右侧足垫注射了纳米探针M507@SNP，并在注射后24 h进行活体成像。如图 10所示，引流的前哨淋巴结显示强烈的荧光信号，淋巴结轮廓清晰完整，信噪比高。上述的活体成像结果表明，负载了近红外染料的氧化硅-聚合物杂化纳米材料M507@SNP能够在活体层次实现高信噪比的器官和淋巴结成像。
本文通过引入4-喹啉盐作为受体，合成了发光效率较高、波长更长、稳定性较好的近红外有机染料M507，通过将三嵌段共聚物F108和氧化硅的前驱体连接形成单体，采用自组装的方法，形成中空结构的氧化硅纳米球，加入疏水染料M507，成功构建了近红外荧光纳米探针。由于嵌段共聚物两亲性的性质，亲水段向外保证纳米探针在水相中的分散性，疏水段向内形成空心结构，并与负载的疏水染料经过疏水-疏水相互作用，形成较为稳定的结构，避免M507的逃逸，并实现了活体层次的器官呈现和前哨淋巴结成像。所制备的纳米探针中染料M507最大发射峰位于近红外波段820 nm，比传统染料Cy5的发射波长红移了120 nm，在DMSO中的绝对量子效率高达10.1%，为构建长波长的近红外荧光染料提供了新的思路。而且，该荧光纳米探针在苛刻条件下表现出较强的光稳定性，可用于小动物的整体荧光成像和前哨淋巴结成像，有望在疾病诊断领域有良好的应用前景。
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图 1 荧光复合纳米材料M507@SNP的构建过程和活体成像示意图
Figure 1 Schematic illustration of the synthetic strategy of the fluorescent nanocomposite M507@SNP and its application in animal imaging
图 3 纳米材料SNP的TEM照片(a)和DLS粒径分布图(b)
Figure 3 TEM image (a) and size distribution (b) of the SNP nanoparticle
图 6 染料M507在二氯甲烷中的紫外-可见吸收与荧光发射光谱
Figure 6 Absorption spectrum and emission spectrum of the dye M507 in dichloromethane
图 7 M507@SNP的紫外-可见吸收光谱随730 nm激光光照时间的变化图
Figure 7 Change in absorption spectra of the M507@SNP solution under illumination of 730 nm laser with different times
图 8 通过MTT测试确定M507@SNP(200~1 000 μg· mL-1)的细胞增殖影响, 孵育温度为37 ℃, 孵育时间为24 h
Figure 8 Cell viability (%) estimated by MTT proliferation tests versus different incubation concentrations of M507@SNP (200~1 000 μg· mL-1) at 37 ℃ for 24 h
图 9 经尾静脉注射M507@SNP后24 h的动物整体荧光成像
Figure 9 Whole-body bioimaging of the mouse injected intravenously with M507@SNP solution
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