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电化学发光分析法测定糖尿病相关二肽

方晨 ,  郑丽娟 ,  翟苏燕 ,  屠一锋

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引用本文: 方晨, 郑丽娟, 翟苏燕, 屠一锋. 电化学发光分析法测定糖尿病相关二肽[J]. 分析化学, 2017, 45(12): 1951-1955. doi: 10.11895/j.issn.0253-3820.171284 shu
Citation:  FANG Chen, ZHENG Li-Juan, ZHAI Su-Yan, TU Yi-Feng. An Electrochemiluminescent Method to Detect A Dipeptide Related to Diabetes[J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2017, 45(12): 1951-1955. doi: 10.11895/j.issn.0253-3820.171284 shu

电化学发光分析法测定糖尿病相关二肽

  • 1.

    苏州大学材料与化学化工学部, 苏州 215123

  • 2.

    苏州大学第二附属医院, 苏州 215004

    • 通讯作者: 屠一锋, E-mail: tuyf@suda.edu.cn
  • 基金项目:

    本文系国家自然科学基金项目（No.21375091）资助

摘要: 将纳米金粒子负载于氧化铟锡导电玻璃（ITO）表面作为电化学发光（ECL）工作电极，建立了简单、快速测定二肽的方法。采用透射电镜、扫描电镜、电化学和光谱等技术方法表征材料和所制备电极的性能。在最优条件下，组氨酸-丙氨酸二肽分子（His-Ala）对鲁米诺在此电极上的ECL有显著的猝灭作用，从而可以对二肽进行检测。在2.44×10-11~1.22×10-7 mol/L浓度范围内，ECL响应和二肽浓度有良好的线性关系，检出限为2.42×10-12 mol/L（S/N=3）。人体内胰高血糖素样肽-1（GLP-1）在二肽基肽酶Ⅳ（PDD-Ⅳ）作用下失去活性并释放出同量的His-Ala二肽，因此，本方法可通过测定血液中二肽浓度间接测定GLP-1，以及评估PDD-Ⅳ和其抑制剂的活性。上述DPP-Ⅳ抑制剂可调节2型糖尿病人血液GLP-1在正常水平，是糖尿病研究和治疗中具有潜在价值的药物设计靶点。

English

  • 1.   引言

    胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide 1, GLP-1)[1~4]是一种肽类激素，是肠促胰岛素激素之一，是在肠道L细胞中由前激素转换酶(PC1)从胰高血糖素原剪切下的其羧基端的肽链序列，与另一种肠促胰岛素激素——葡萄糖依赖性促胰岛素激素(GIP)类似，其氨基酸序列均与胰高血糖素具有高度同源性。其有两种生物活性形式，即酰胺形式GLP-1(7-36)酰胺和其甘氨酸变异体形式GLP-1(7-37)，前者占其总活性的80%。GLP-1在2型糖尿病的发生和发展过程中起着重要的作用[5~8]，正常人在餐后分泌GLP-1而促进胰岛素的分泌，从而起到平抑餐后血糖波动的作用，而2型糖尿病人的餐后GLP-1分泌增幅则较小。然而，活性的GLP-1在二肽基肽酶(Dipeptidyl peptidase Ⅳ，DPP-Ⅳ，又称T细胞激活抗原，CD26)的作用下从N端快速(半衰期约1~1.5 min)水解下一个组氨酸-丙氨酸二肽分子(His-Ala)[9~11]，降解为无活性的GLP-1(9-36)酰胺或GLP-1(9-37)，后者是活性肽的拮抗剂，因此，DPP-Ⅳ抑制剂对调节2型糖尿病人血液GLP-1水平有显著作用，是糖尿病药物研究中的一个重要靶点。

    定量分析对研究GLP-1、DPP-Ⅳ和DPP-Ⅳ抑制剂之间的反应机制和最终对糖尿病的诊断、治疗都有重要意义。由于GLP-1半衰期极短，采用ELISA方法对GLP-1的检测很难应用于生理机制的研究。DPP-Ⅳ的ELISA检测方法也存在一些缺点，如检测流程长、价格较高。ELISA方法的这些局限性使其在上述指标的即时检验(POCT)[12]应用方面尚不能完全满足实际要求。电化学发光分析[13, 14]具有其独特的优势。鲁米诺是常用的发光试剂，可在较低的电压下激发其高量子效率的发光。鲁米诺在中性/弱碱性介质中利用纳米材料的敏化作用增强其ECL发光，从而应用于生理条件下的检测研究[15~17]。Au纳米材料在电化学、生物传感、成像分析等领域已有广泛的应用[18~20]。氧化铟锡导电玻璃(ITO)作为电化学电极，结合Au纳米材料的电催化效能可得到更好的性能，并应用于电化学测定和传感器的制备[21, 22]。本研究采用3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)的水解产物将AuNPs淀积在ITO玻璃表面，并将制备的纳米功能化电极用于测定二肽(His-Ala)，以及对GLP-1、DPP-Ⅳ及DPP-Ⅳ抑制剂的活性及反应机制的研究。

    2.   实验部分

    2.1   仪器与试剂

    RST600电化学发光工作站(苏州瑞斯特仪器有限公司)，提供ECL激励电压并记录/转换光强信号为数字信号；R212光电倍增管(日本滨松公司)为光传感器(-800 V工作电压)；RST 5200电化学工作站(苏州瑞斯特仪器有限公司)；TecnaiG220透射电镜(美国FEI公司)；S-4700扫描电镜(日本日立公司)。葡聚糖凝胶G-10固相微萃取小柱(Sigma-Aldrich公司)。

    ITO玻璃(板硝子株式会社苏州板硝子电子有限公司)；鲁米诺(AR，美国Fluka公司)；L-Hisidine(L-His) (BR), L-Alanine (L-Ala)(BR)和His-Ala(生工生物工程(上海)股份有限公司)；3-氨丙基三甲基氧硅烷(APTMS)、HAuCl4·4H2O、柠檬酸三钠、NaH2PO4·2H2O和Na2HPO4·12H2O(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。

    2.2   金溶胶制备与预处理

    参考文献[21, 22]方法，将4.5 mL 1%柠檬酸钠溶液加入100 mL煮沸的0.01%HAuCl4溶液中，制备得到金溶胶。取4 mL新制备的溶胶，3000 r/min离心10 min，上清液在10000 r/min离心30 min，弃上清液，沉淀用250 μL纯水超声分散，得到粒径约20 nm的金溶胶(含金量0.76 mg/mL)，于4℃保存备用。

    2.3   AuNPs/ITO电极的制备

    ITO玻璃片裁切为1.0 cm×5.0 cm的条状，用绝缘胶带贴覆，胶带上预先镂空0.5 cm直径的圆孔作为有效电极区域，以水、乙醇-1 mol/L NaOH (1:1, V/V)混合液和丙酮分别超声清洗，然后浸入30% (V/V)氨水中12 h，使其表面获得足够多的羟基。氮气吹干后，滴涂含0.05%(V/V) APTMS的无水乙醇溶液，待乙醇完全挥发后，置于55℃的恒温恒湿箱中使APTMS完全水解。此后，在表面滴涂50 μL金溶胶，静置足够时间后以纯水冲洗。

    2.4   电化学发光测定二肽

    在10 mL发光池中，以Pt电极为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极与工作电极构成三电极系统，以含5×10-8 mol/L鲁米诺的0.2 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 8.0)为支持电解质。向工作电极施加脉冲激励电压时，同步记录ECL信号。随His-Ala二肽的加入，记录响应值并进行回归分析。

    3.   结果与讨论

    3.1   材料和电极的表征

    制备的AuNPs/ITO电极表面的显微形貌如图 1所示，ITO表面基本均匀平整覆盖着玻璃表面的ITO粒子(图 1A)，ITO表面沉积AuNPs粒径均一，粒径约20 nm且粒径分布窄(图 1B)，基本上是以单层方式分布，颗粒间无团聚现象。

    图 1

    图 1.  (A) ITO玻璃和(B)表面沉积AuNPs的ITO的扫描电镜图，插图为AuNPs的透射电镜图；(C)AuNPs/ITO电极的吸收光谱(插图为AuNPs溶胶的吸收光谱)；(D)(a) ITO玻璃，(b) APTMS/ITO，(c) AuNPs/ITO的电化学交流阻抗谱图(支持电解质为含5 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-的0.1 mol/L NaCl溶液，插图为对应电极上鲁米诺的ECL信号)
    Figure 1.  Scanning electron microscope (SEM) images of (A) indium tin oxide (ITO) glass and (B) AuNPs modified ITO. Inset in B is transmission electron microscope (TEM) image of AuNPs; (C) UV absorption spectrum of AuNPs/ITO (Inset is UV absorption spectrum of AuNPs); and (D) Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) of (a) bare ITO, (b) 3-aminopropyl)trimethoxysilane (APTMS)/ITO, (c) AuNPs/ITO in 0.1 mol/L NaCl solution containing 5 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-. Insets in D are ECL curves of luminol on corresponding electrode respectively
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    图 1C为AuNPs/ITO电极的吸收光谱，在520 nm处有明显的吸收峰，与插图所示金溶胶的吸收光谱一致，表明沉积至ITO表面后，AuNPs的紫外-可见吸收光谱特性未发生明显变化。如图 1D所示，电极的电子转移阻抗(Ret)随着表面修饰过程变化，沉积ATPMS水解膜后阻抗增加(≈ 166 Ω)，沉积AuNPs后阻抗显著降低(≈ 10 Ω)，低于ITO(≈30 Ω)，表明所沉积的AuNPs有效改善了电极表面导电性。插图为对应电极上的ECL信号，与电极表面阻抗的变化负相关，阻抗越小，发光强度越大。因此，采用AuNPs对ITO玻璃进行功能化，可制备性能优异的ECL电极，电极功能化方法简单、快速。

    3.2   测定二肽条件优化

    鲁米诺的ECL行为受电极上施加电位及脉冲周期等因素影响，脉冲周期为3 s时发光强度最大(图 2A); 图 2B和2C表明，对于背景发光以及二肽的猝灭程度，最佳的上限电位为1.2 V、下限电位为-0.2 V。

    图 2

    图 2.  (A) 脉冲周期对ECL发光强度的影响；(B)脉冲上限电位和(C)脉冲下限电位对ECL测定二肽的影响(a：背景光强，b：猝灭后光强，c：猝灭量)
    Figure 2.  Effect of (A) pulse period on ECL intensity; influences of (B) upper limiting potential and (C) lower limiting potential on dipeptide detection (a: background, b: after the quenching, c: quenching degree)
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    3.3   AuNPs/ITO电极ECL法测定氨基酸和二肽性能

    图 3A所示为修饰电极对L-Ala的响应ECL信号，线性范围为4.49 × 10-9~4.49 × 10-5mol/L。相比较而言，在裸ITO上，L-Ala的线性响应范围仅为2.24 × 10-5~2.24 × 10-3mol/L，表明AuNPs功能化极大提高了电极的响应性能。图 3B为AuNPs/ITO电极测定不同浓度L-His的ECL响应信号，线性范围为1.62 × 10-8~3.24 × 10-5mol/L。

    图 3

    图 3.  ECL测定L-Ala(A)和L-His(B)的校正曲线，插图分别为裸ITO上的校正曲线
    Figure 3.  Linear calibration curves for electrochemiluminescence (ECL) detection of (A) L-Ala and (B) L-His. Insets are calibration curves of those amino acids on bare ITO respectively
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    如图 4A所示，本方法测定His-Ala二肽的线性范围为2.44×10-11~1.22×10-7mol/L，线性方程为ΔI = 0.18lgC (pmol/L)+0.03，r)=0.99，检出限为2.42×10-12mol/L(S/N=3)。石明娟等[23]的研究表明，能量转移作用可抑制鲁米诺的ECL，其作用机制属动态猝灭[24]。本研究结果表明His-Ala较单个氨基酸分子有更高的猝灭效率。

    图 4

    图 4.  A，ECL定量测定His-Ala二肽校正曲线；B，常见共存物质对测定产生的影响
    Figure 4.  (A) Linear calibration curve of dipeptide. (B) Interference of coexisting substances on determination of dipeptide (2.44×10-10 mol/L). BSA, bovine serum albumin; BH, bovine hemoglobin; UA, uric acid
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    对可能的干扰物质进行了检验，在2.44×10-10 mol/L His-Ala二肽溶液中分别加入牛血红蛋白(BH，3×10-6 mol/L)、牛血清白蛋白(BSA，3×10-6 mol/L)、葡萄糖(2×10-6 mol/L)、尿酸(UA，2.5×10-6 mol/L)，结果如图 4B所示，干扰物质存在时，对修饰电极ECL响应信号所产生的影响小于10%。为消除其它可能的干扰，将血清样品经固相萃取小柱过滤，除去蛋白质及其它大分子成分后，测定方法回收率，结果见表 1，回收率为89.8%~96.8%，表明血清基质对本方法无明显干扰，本方法可用于实际血清样品中二肽的检测。

    表 1

    表 1  固相微萃取预处理血清样品中His-Ala测定回收率
    Table 1.  Recovery for detection of His-Ala in serum after solid-phase extraction
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    样品编号
    Samples    		加入二肽浓度
    Added His-Ala
    (mol/L)    		测得浓度
    Found
    (mol/L)    		回收率
    Recovery
    (%)    		相对标准偏差
    RSD
    (%, n=3)
    14.00×10-103.59×10-1089.85.3
    28.00×10-97.74×10-996.83.3
    33.88×10-83.59×10-892.55.8

    4.   结论

    建立了一种可快速测定His-Ala二肽的电化学发光分析方法，利用ITO玻璃作为基础电极，在其表面沉积AuNPs，获得了较高的鲁米诺电化学发光本底信号，此发光信号会被二肽强烈地猝灭，因此可应用于二肽的定量测定，检出限为2.42×10-12 mol/L。此二肽是GLP-1在DPP-Ⅳ作用产生，因此本方法有望用于GLP-1、DPP-Ⅳ及其抑制剂的间接测定，可用于DPP-Ⅳ抑制剂相关药物靶点的研究，对糖尿病的研究具有重要意义。


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  • 图 1  (A) ITO玻璃和(B)表面沉积AuNPs的ITO的扫描电镜图，插图为AuNPs的透射电镜图；(C)AuNPs/ITO电极的吸收光谱(插图为AuNPs溶胶的吸收光谱)；(D)(a) ITO玻璃，(b) APTMS/ITO，(c) AuNPs/ITO的电化学交流阻抗谱图(支持电解质为含5 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-的0.1 mol/L NaCl溶液，插图为对应电极上鲁米诺的ECL信号)

    Figure 1  Scanning electron microscope (SEM) images of (A) indium tin oxide (ITO) glass and (B) AuNPs modified ITO. Inset in B is transmission electron microscope (TEM) image of AuNPs; (C) UV absorption spectrum of AuNPs/ITO (Inset is UV absorption spectrum of AuNPs); and (D) Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) of (a) bare ITO, (b) 3-aminopropyl)trimethoxysilane (APTMS)/ITO, (c) AuNPs/ITO in 0.1 mol/L NaCl solution containing 5 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-. Insets in D are ECL curves of luminol on corresponding electrode respectively

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    图 2  (A) 脉冲周期对ECL发光强度的影响；(B)脉冲上限电位和(C)脉冲下限电位对ECL测定二肽的影响(a：背景光强，b：猝灭后光强，c：猝灭量)

    Figure 2  Effect of (A) pulse period on ECL intensity; influences of (B) upper limiting potential and (C) lower limiting potential on dipeptide detection (a: background, b: after the quenching, c: quenching degree)

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    图 3  ECL测定L-Ala(A)和L-His(B)的校正曲线，插图分别为裸ITO上的校正曲线

    Figure 3  Linear calibration curves for electrochemiluminescence (ECL) detection of (A) L-Ala and (B) L-His. Insets are calibration curves of those amino acids on bare ITO respectively

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    图 4  A，ECL定量测定His-Ala二肽校正曲线；B，常见共存物质对测定产生的影响

    Figure 4  (A) Linear calibration curve of dipeptide. (B) Interference of coexisting substances on determination of dipeptide (2.44×10-10 mol/L). BSA, bovine serum albumin; BH, bovine hemoglobin; UA, uric acid

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    表 1  固相微萃取预处理血清样品中His-Ala测定回收率

    Table 1.  Recovery for detection of His-Ala in serum after solid-phase extraction


    样品编号
    Samples    		加入二肽浓度
    Added His-Ala
    (mol/L)    		测得浓度
    Found
    (mol/L)    		回收率
    Recovery
    (%)    		相对标准偏差
    RSD
    (%, n=3)
    14.00×10-103.59×10-1089.85.3
    28.00×10-97.74×10-996.83.3
    33.88×10-83.59×10-892.55.8
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  • 发布日期:  2017-12-20
  • 收稿日期:  2017-10-01
  • 接受日期:  2017-11-04
通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
  • 1. 

    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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