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• 1.   引 言

  头孢替安酯是由7-氨基头孢霉烷酸与氨基噻唑乙酸合成的第2代头孢菌素,是头孢替安的酯类前体药物,其抗菌作用机理是阻碍细菌细胞壁的合成,主要治疗革兰阴性菌和革兰阳性菌引起的感染。头孢替安酯是在注射剂头孢替安结构上引入1-(环己氧羰基氧)乙酯的衍生物。通过这种结构改造使其可口服吸收^[1~3]。头孢替安酯作为前体药物,自身无抗菌作用,但口服后,在肠道迅速水解为头孢替安,从而发挥其抗菌作用。

  液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)集液相色谱的高分离能力与质谱的高灵敏度、高选择性于一体,能够获得可靠的定量信息,可用于分析不挥发性化合物、极性化合物及热不稳定化合物,在复杂生物基质中小分子物质定量检测领域得到了广泛应用^{[4, 5]}。目前,检测血生物样品中头孢替安的方法主要为高效液相色谱法(HPLC)^[6~11],然而这些方法存在诸多局限性。一方面,HPLC方法连接的紫外检测器在定量测定头孢替安时灵敏度较低,在低浓度的生物样本中应用范围有限,每个生物样本的分析时间在4.8-12.0 min之间,无法满足临床高通量检测的要求。另一方面,上述方法的定量下限在0.01-0.30 μg/mL之间^[6~11],对于临床药代动力学研究时较低浓度点的检测能力有限。本研究在上述方法不足的基础上,通过优化液相色谱条件和质谱条件,建立灵敏度高、特异性强、快速、高通量的液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)定量测定人血浆中头孢替安的方法,并将本方法用于健康受试者口服盐酸头孢替安酯片的临床药代动力学研究。

  2.   实验部分

  2.1.   仪器与试剂

  LC-20A液相色谱仪(日本岛津公司)、API 3200三重四极杆质谱(美国AB SCIEX公司)、BP211D十万分之一分析天平(德国Sartorius公司)、超纯水(18.2 MΩ·cm,25℃)系统(美国Millipore公司)。头孢替安对照品(批号: 130565-200902,规格:0.2 g,中国食品药品检定研究院);内标地西泮(批号:171225-200302,规格:5 mg,中国食品药品检定研究院);健康人空白血浆(健康受试者提供);甲醇、乙腈和乙酸胺(色谱纯,美国Fisher Scientific公司)。

  2.2.   液相色谱和质谱条件

  采用Waters Symmtry C₁₈色谱柱(50 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为A甲醇,流动相B为1 mmol/L乙酸铵水溶液。采用梯度洗脱的方式(0-0.3 min,90% B;0.3-0.4 min,5% B;0.4-2.0 min,0% B;2.0-2.1 min,90% B;2.1-3.8 min,90% B),流速1.0 mL/min,进样体积为15 μL,分析时间为3.8 min,为防止质谱仪的无关污染,采用转换阀,非保留时间流向废液。头孢替安和内标在血浆样品中的保留时间分别为1.56和1.92 min。设置电喷雾离子化源(ESI),MRM多离子反应检测,正离子模式,喷雾电压5500 V,温度540℃,雾化气(GS1)为45 psi,解簇电压(GS2)为55 psi,气帘气(CUR)为20 psi,头孢替安的解簇电压(DP)和碰撞电压(CE)值分别为26和20 V;内标的DP、CE值分别为50和40 V。在ESI离子化方式下,头孢替安和内标地西泮主要生成[M+H]⁺准分子离子峰,离子对分别为m/z 526.1/174.0和m/z 285.1/193.1。

  2.3.   标准曲线及质控样品的配制

  准确称取10.00 mg含量折算后的头孢替安对照品,采用甲醇-水(1:1,V/V)配制成浓度为1.00 mg/mL的储备液。采用乙腈逐级稀释成浓度分别为5.00,10.00,20.00,100.0,200.0,1000,2000和5000 ng/mL的头孢替安对照品溶液,于-40℃储存备用。

  准确称取地西泮对照品5.00 mg,采用乙腈配制浓度为100.0 μg/mL的内标储备液,用时稀释成浓度为10.00 ng/mL的内标工作液。

  准确吸取50 μL系列浓度的头孢替安工作液,加入空白人血浆50 μL和内标工作液100 μL,涡旋30 s混匀,配制标准曲线样品和浓度为10.00,200.0和4000 ng/mL的质控(QC)样品。

  2.4.   血浆样品预处理

  采用蛋白沉淀法对血浆样品预处理。

  血浆标准曲线和质控样品:取1.5 mL离心管,加入空白血浆样品50 μL,标准曲线工作液 50 μL,涡旋1 min,加入10 ng/mL内标溶液100 μL,混合均匀,涡旋振荡1 min,13000 r/min离心5 min后,吸取全部上清液,进样15 μL,进行LC-MS/MS分析。

  临床血浆样品:取1.5 mL离心管,加入血浆样品50 μL,乙腈50 μL,涡旋1 min,加入10 ng/mL内标溶液100 μL,混合均匀,涡旋振荡1 min,13000 r/min离心5 min后,吸取全部上清液,进样15 μL,进行LC-MS/MS分析。

  2.5.   试验对象、样本采集及处理

  采用单中心、开放、随机试验设计,选择符合入选标准的健康成年受试者12人,男女各半,年龄20-30岁,试验前获得了首都医科大学附属北京朝阳医院伦理委员会的批准,受试者均自愿参加试验并签署知情同意书,试验前经询问病史、体格检查和实验室检查,均未发现异常,试验期间统一饮食。受试者于试验前一日进食标准营养晚餐后禁食,次日早晨空腹,用200 mL温开水送服盐酸头孢替安酯片,口服剂量为100 mg,并在服药后30 min内保持上半身直立,给药4和10 h后统一用餐。采集给药前(0 h)和给药后(20,40,60,80和100 min及2,2.5,3,3.5,4,6,8和12 h)上肢静脉血3 mL至肝素化抗凝管中,3500 r/min离心5 min后,吸取血浆至冻存管中,于-40℃保存。

  2.6.   方法学验证

  对首次建立的生物样品分析方法应进行全面的方法学验证,包括特异性和选择性、标准曲线和线性、定量下限(LLOQ)、精密度与准确度、稳定性、提取回收率等,所有验证内容均参考FDA的生物样品定量分析方法学验证的指导原则要求^[12]。

  特异性与选择性:分别取6名健康人的空白血浆50 μL,除不添加内标溶液并另外补加50 μL乙腈溶液外,其余按2.4节操作,获得空白样品的色谱图;将定量下限浓度(5.00 ng/mL)的标准溶液和内标溶液加入空白血浆(50 μL),依同法操作,获得相应的色谱图。记录LLOQ时头孢替安标准品、双空白人血浆、空白人血浆加入内标工作液(空白或零浓度)经提取后的色谱图。

  标准曲线和线性范围:取空白血浆50 μL,加入标准曲线工作液50 μL,内标地西泮100 μL (10.00 ng/mL),每浓度平行3个样本,按2.4节操作,制备标准曲线。以血浆中待测物浓度为横坐标,待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标,用加权(W=1/x²)最小二乘法进行回归运算,求得的直线回归方程,即为标准曲线。本实验中标准曲线包括8个非零浓度点,分别为5.00,10.00,20.00,100.0,200.0,1000,2000和5000 ng/mL,考察标准曲线的线性关系。

  精密度、准确度及定量下限:采用空白人血浆制备头孢替安低、中、高3个浓度的血浆质控(QC)样品,每个浓度平行6个样本,连续测定3批次。根据当日的标准曲线,计算 QC 样品的浓度,根据 QC 样品测定结果计算方法的批内和批间准确度与精密度。要求精密度的相对标准偏差(RSD)＜15％,低浓度质控样品RSD＜20%。方法的准确度用相对偏差表示,高、中、低3个浓度质控样品的相对误差(RE)＜±15％,低浓度QC样品的RE＜±20%。准确配制5.00 ng/mL的血浆LLOQ样品,平行6个样本,连续测定3批次,考察LLOQ的精密度和准确度,要求LLOQ样本的RE和RSD≤±20%。

  稳定性和提取回收率:按照考察稳定性的条件,将样品放置一定时间后,按2.4节处理后,吸取15 μL进行LC-MS/MS分析,以当日新鲜配制的标准曲线计算实测浓度。若各浓度质控样品的实测值与理论值的RE和RSD均小于15%,说明待测物的稳定性好,不影响一定时间内的准确测定。本实验中分别考察了血浆样品放置于自动进样器24 h(22℃±2℃)、实验台24 h(25℃±2℃)、3次反复冻融(-40℃至室温)、储备液4℃短期和长期放置和长期稳定性(-40℃放置)。采用蛋白沉淀法,配制低、中、高水平的头孢替安血浆质控样品,每浓度平行6个样本,计算提取回收率。

  3.   结果与讨论

  3.1.   液相色谱和质谱条件的优化

  质谱条件优化最终选择响应度好的正离子模式扫描,头孢替安和内标的定量离子对为m/z 526.1/174.0和m/z 285.1/193.1(图 1),采用乙腈作为有机相,水相中加入1 mmol/L乙酸铵,利用流动相的电解质效应^[13]增加信号响应、改善色谱峰型。

  图 1

  

  图 1  头孢替安(a)和内标(b)的二级质谱图

  Figure 1.  Electrospray ionization mass spectra (ESI-MS) of cefotiam (a) and internal standard (diazepam) (b)

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  3.2.   分析方法的验证

  方法的特异性与选择性的实验结果见图 2,头孢替安和内标的保留时间分别为1.57和1.93 min,在保留时间位置无其它杂质峰,说明本方法的特异性和选择性良好,满足临床检测头孢替安浓度的要求。

  图 2

  

  图 2  方法的特异性和选择性

  Figure 2.  Representative chromatograms of selected extracted samples (left for cefotiam; right for internal standard) at double-blank,blank sample,lower limit of quantitation (LLOQ) (5.0 ng/mL) and response for volunteer's sample (11.19 ng/mL; 8 h after oral administration)

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  表 1

  

  表 1  精密度和准确度实验结果

  Table 1.  Intra- and inter-day accuracy,precision of cefotiam (mean+SD,n=6)

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  理论浓度 Nominal (ng/mL)	批内 Intra-day			批间 Inter-day
  	实测浓度 Found (ng/mL)	精密度 RSD (%)		实测浓度 Found (ng/mL)	精密度 RSD (%)
  5	5.01±0.47	9.3		5.08±0.50	10.0
  10	9.64±0.97	10.1		9.50±0.77	8.1
  200	203.9±6.2	3.0		194.0±11.0	5.9
  4000	3998±139	3.5		4199±192	4.7

  血浆中头孢替安检测方法的标准曲线线性范围为5.0-5000 ng/mL,定量下限为5.0 ng/mL,包括8个非零浓度点,连续测定3批次的线性关系良好(r>0.99),准确度均小于±4.5%,精密度均＜8.4%。

  精密度、准确度的实验结果如表 1所示,低中高3个浓度水平检测方法的批内和批间准确度(RE)介于-5.0%-5.0%,批内和批间精密度介于3.0%-10.1%,符合生物样品定量检测的要求^[12]。

  稳定性的结果如表 2所示,低中高浓度水平的质控样品经不同条件放置一定时间后均稳定,以上结果提示,实验中若遇到仪器突然故障或其它与检测相关情况时,再次测定头孢替安,不影响测得结果的准确性。

  表 2

  

  表 2  分析方法的稳定性

  Table 2.  Stability of cefotiam under different conditions (n=6)

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  放置条件 Placing condition	RSD (%)
  	10 ng/mL	200 ng/mL	4000 ng/mL
  实验台24 h Stand on the laboratory table for 24 h(25℃±2℃)	8.0	3.5	5.3
  自动进样器24 h In the autosampler for 24 h(22℃±2℃)	8.4	2.5	8.8
  3次反复冻融 Repeated freezing and thawing for 3 times	8.8	4.6	5.1
  储备液4℃ In stock solution at 4℃	12.1	8.0	7.8
  -40℃长期放置 Long time at -40℃	12.7	5.4	3.7

  生物样本前处理的主要方法包括蛋白沉淀法、液液萃取法和固相萃取法等。本研究中采用了最简单、最便捷的蛋白沉淀法对血浆样本进行前处理。相比于其它前处理方法,蛋白沉淀法在高通量、快速的临床检测中凸显优势。低中高浓度血浆质控样品中头孢替安和内标的提取回收率分别为96.5%±12.4%,90.3%±5.6%,79.8%±9.2%和109.7%±8.1%,以上结果表明,在低中高浓度水平下,提取回收率基本一致,方法的重现性好,能够满足LC-MS/MS方法检测血浆中待测物浓度的要求。

  3.3.   健康人体药代动力学结果

  采用LC-MS/MS法测定了12名健康受试者口服盐酸头孢替安酯片后血浆中头孢替安浓度,平均t_1/2为(0.97±0.1)h,T_max为0.67-1.33 h,C_max为(1838±359) ng/mL,AUC_0-t分别为(2768±488)h·ng/mL。从图 3可见,当口服盐酸头孢替安酯片后,头孢替安在人体内呈现双指数消除。平均药时曲线的结果表明,给药12 h后的血药浓度低于定量下限浓度(5.0 ng/mL),此结果与文献^[14]报道基本一致。另外,与已报道的LC-MS/MS方法相比^[6~11],本方法具有较低的灵敏度,定量下限仅为5.0 ng/mL,能够准确定量分析浓度较低的生物样本。

  图 3

  

  图 3  健康受试者口服100 mg盐酸头孢替安酯片后血浆中平均头孢替安浓度-时间曲线

  Figure 3.  Mean plasma concentration-time profile of cefotiam in healthy Chinese volunteers after administration of 100 mg of cefotiam hexetil hydrochloride tablets (n=12)

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  4.   结 论

  本研究采用蛋白沉淀结合LC-MS/MS技术建立了健康人血浆中头孢替安定量测定的分析方法。本方法灵敏度高、特异性强、重现性好、快速,适用于复杂生物基质中头孢替安的分析检测,并将其应用于健康受试者口服100 mg盐酸头孢替安酯片的人体药代动力学研究,同时也为同类药物在人体生物基质中的定量检测提供参考。

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  Figure 1  Electrospray ionization mass spectra (ESI-MS) of cefotiam (a) and internal standard (diazepam) (b)

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  Figure 2  Representative chromatograms of selected extracted samples (left for cefotiam; right for internal standard) at double-blank,blank sample,lower limit of quantitation (LLOQ) (5.0 ng/mL) and response for volunteer's sample (11.19 ng/mL; 8 h after oral administration)

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  Figure 3  Mean plasma concentration-time profile of cefotiam in healthy Chinese volunteers after administration of 100 mg of cefotiam hexetil hydrochloride tablets (n=12)

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  Table 1.  Intra- and inter-day accuracy,precision of cefotiam (mean+SD,n=6)

  理论浓度 Nominal (ng/mL)	批内 Intra-day			批间 Inter-day
  	实测浓度 Found (ng/mL)	精密度 RSD (%)		实测浓度 Found (ng/mL)	精密度 RSD (%)
  5	5.01±0.47	9.3		5.08±0.50	10.0
  10	9.64±0.97	10.1		9.50±0.77	8.1
  200	203.9±6.2	3.0		194.0±11.0	5.9
  4000	3998±139	3.5		4199±192	4.7

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  Table 2.  Stability of cefotiam under different conditions (n=6)

  放置条件 Placing condition	RSD (%)
  	10 ng/mL	200 ng/mL	4000 ng/mL
  实验台24 h Stand on the laboratory table for 24 h(25℃±2℃)	8.0	3.5	5.3
  自动进样器24 h In the autosampler for 24 h(22℃±2℃)	8.4	2.5	8.8
  3次反复冻融 Repeated freezing and thawing for 3 times	8.8	4.6	5.1
  储备液4℃ In stock solution at 4℃	12.1	8.0	7.8
  -40℃长期放置 Long time at -40℃	12.7	5.4	3.7

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