English

• 1.   引言

  硼亲和作用，即取代硼酸与顺式二羟基化合物间存在受pH值调控的可逆的共价相互作用，为糖蛋白、糖、核苷和核苷酸等重要的生物分子的识别和分离提供了独特的亲和作用力^[1~5]。硼亲和材料在近年取得了显著进展^{[6, 7]}，在亲和分离^{[8, 9]}、分子识别^[10~13]、组学研究^[14~16]、癌细胞靶向^[17~20]和单细胞分析^[21]等领域中得到了成功应用。通常，在较高的pH值条件下，取代硼酸与溶液中的氢氧根形成四面体结构，然后与顺式二羟基化合物通过酯化反应形成稳定的五元环或六元环复合物; 而在酸性pH条件下，该复合物水解释放出顺式二羟基化合物。该作用力使得以取代硼酸为配基的亲和材料展现出对糖蛋白、糖和核苷等顺式二羟基化合物良好的选择性^{[12, 22]}，也使得基于硼亲和作用的分子印迹材料展现出对印迹模板分子良好的专一性^[23~27]。然而，与硼亲和作用伴生的分子间相互作用比较复杂，涉及到疏水相互作用、离子相互作用、氢键和Lewis碱等^{[2, 5~7]}，因此，要获得良好的选择性，需要深入明晰地了解硼亲和作用存在干扰或竞争的其它分子间相互作用的机理。

  取代硼酸的硼原子具有一个空轨道，处于缺电子的状态，易在碱性条件下与OH^-配位转变为正四面体的硼离子，再与顺式二羟基化合物发生酯化作用^[28]。羟乙基胺化合物的分子结构中具有一个羟基和一个间位取代氨基，β-兴奋剂和β-阻断剂是这一类化合物的典型代表。此类化合物的分子结构中的羟基和间位取代氨基都含孤对电子，与顺式二羟基化合物比较相似，故而从结构上推测其与取代硼酸可能存在类似的相互作用。

  利用取代硼酸与羟乙基胺化合物间的相互作用的应用已有相关报道。Polettin等^[29]在碱性介质下提取了人发中的克伦特罗，将其与甲基硼酸发生反应，利用气相色谱-质谱联用法进行检测，发展出一种体育运动兴奋剂检测新方法。Harkins等^[30]用相似的方法对马尿中的克伦特罗进行衍生，衍生后的克伦特罗在质谱中的m/z 243位置处有特征离子峰，适于质谱定量分析。Adel等^[31]采用共沸除水的方法制备了一系列含羟基乙胺的取代硼酸衍生物。Martin等^[32]采用固载苯硼酸的硅胶用于样品前处理，在水相体系中成功提取了血液中的β-阻断剂。Takafumi等^[33]也采用一种苯硼酸预柱选择性的提取了尿样和血液中的β-阻断剂。以上相关报道都集中于应用领域，而取代硼酸与羟乙基胺化合物的相互作用机理以及影响条件尚未见报道。为了探索硼亲和相互作用可能存在的干扰，拓展硼酸功能化材料的功能，本研究选取了苯硼酸作为取代硼酸的代表，选择2种β-阻断剂和3种β-兴奋剂作为羟乙基胺化合物的代表，采用核磁共振(NMR)和高效液相色谱(HPLC)两种方法考察它们与苯硼酸的相互作用，对取代硼酸与羟乙基胺化合物的作用机理进行了探讨。

  2.   实验部分

  2.1   仪器和试剂

  TriSep-2100 pCEC高效微柱液相色谱仪(美国Unimicro Technologies公司); Bruker Advance DMX 500 MHz核磁共振仪(德国Bruker公司); 熔融石英毛细管(外径375 μm，内径150 μm，河北锐沣色谱器件公司)。实验用水为Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)制备的超纯水。

  对乙烯基苯硼酸(VPBA)、N-乙基甲胺(EMA)、对苯二酚、邻苯二酚(Alfa Aesar公司); β-受体阻断剂：艾司洛尔(Esmolol)和心得安(Propranolol)购自Sigma公司; β-受体激动剂：克伦特罗(Clenbuterol)、马布他林(Mabuterol)和莱克多巴胺(Ractopamine)购自Sigma公司; N-甲基-2-羟基乙胺(MAE)和丁醇(上海晶纯试剂有限公司)。氘代甲醇、氘代水、氘代乙腈(北京崇熙科技孵化器有限公司)。本研究所涉及的主要化合物结构式如图 1所示。

  图 1

  

  图 1.  实验所用的羟乙基胺及对照化合物的化学结构式

  Figure 1.  Chemical structure of hydroxyethylamines and reference compounds used in this study

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  2.2   NMR检测条件

  ¹H-NMR和¹¹B-NMR使用频率分别为500和160 MHz。以氘代水为溶剂配制0.05 mol/L pH为7.0，8.8，10.0的3种磷酸盐缓冲溶液。进行¹H-NMR表征时，先将各待测物用氘代甲醇配制成0.2 mol/L的储备液; 检测时，以pH 8.8的缓冲溶液为溶剂稀释各待测样品，最终浓度为0.01 mol/L。进行¹¹B-NMR表征时，用已配制的不同pH值缓冲溶液稀释各待测样品，最终浓度为0.04 mol/L。

  2.3   整体柱的制备

  对乙烯基苯硼酸聚合物整体柱的制备按文献[34]方法。移取2 mL二甲亚砜(DMSO)、1 mL N, N-二甲基甲酰胺(DMF)和200 μL超纯水混匀，再加入过量Na₃PO₄，涡旋，超声2 min，在30℃水浴下反应3 min，静置后取其上清液150 μL，加入1 mg偶氮二异丁氰(AIBN)、30 mg对乙烯基苯硼酸和30 mg亚甲基双丙烯酰胺(MBAA), 超声溶解后再加入0.0625 g十二醇，涡旋后超声15 min。将配制好的混合物注入衍生过双键的毛细管中，在75℃水浴中反应12 h, 所得整体柱分别用超纯水和甲醇冲洗后备用。

  硼-氮配位型硼酸功能化整体柱参考文献[35]方法制备并加以改进，过程如下：分别称取甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)47 mg、亚甲基双丙烯酰胺43 mg、二甲亚砜140 mg、十二醇125 mg和偶氮二异丁腈1 mg，混合超声溶解后呈澄清透明状，将其注入衍生了双键的毛细管内，在75℃水浴中聚合12 h，反应后依次用甲醇和乙腈冲洗，即得Poly(GMA-co-MBAA)聚合物整体柱。再采用硼-氮配位(存在分子间B-N配位)型苯硼酸单体对上述环氧基团毛细管整体柱进行修饰，将0.2 g 3-(二甲胺甲基)苯胺-4-频哪醇硼酸酯、0.18 g三乙胺和5 mL乙腈混合溶解后，连续通过已制备好的Poly(GMA -co-MBAA)整体柱，同时在60℃下加热反应17 h，最后用乙腈冲洗，即得硼-氮配位型苯硼酸聚合物整体柱。使用前，依次用100 mmol/L HAc(pH 2.7)和上样缓冲溶液冲洗活化30 min。

  2.4   色谱条件

  毛细管整体柱总长45 cm，有效长度40 cm; 六通阀进样，定量环600 nL，分流比15:1;流速0.090 mL/min; 紫外检测器，检测波长214 nm; 流动相根据需要现用现配。

  3.   结果与讨论

  3.1   核磁共振波谱分析

  3.1.1   ¹H-NMR分析

  核磁共振氢谱是表征分子间相互作用的常用方法之一^[36]。首先采用¹H-NMR，以具有顺式二羟基结构的邻苯二酚作为对照，考察了N-甲基-2-羟基乙胺、心得安和莱克多巴胺与对乙烯基苯硼酸在pH 8.8条件下的相互作用。结果表明，以上化合物与对乙烯基苯硼酸混合后，在NMR谱图中均出现了新谱峰(图略)，表明这些化合物与对乙烯基苯硼酸发生了一定的相互作用，但由于氢谱的化学位移也受到溶剂、浓度和温度等因素的影响，所得信息难以反映相互作用所发生的基团。

  3.1.2   ¹¹B-NMR分析

  采用¹¹B-NMR技术，以丁醇作为参照，在不同pH值条件下，考察了邻苯二酚、N-甲基-2-羟基乙胺、N-乙基甲胺、心得安和莱克多巴胺5种化合物与对乙烯基苯硼酸的相互作用，如图 2所示。在中性条件下，邻苯二酚与对乙烯基苯硼酸的混合物在高场出现一个小峰，峰高随pH值增加而增强; N-甲基-2-羟基乙胺与对乙烯基苯硼酸在pH 7.0时的峰就相对较强，且随pH值的增加并未发生明显变化; 丁醇与对乙烯基苯硼酸混合物的峰高并未随pH值而发生变化，且与对乙烯基苯硼酸的峰高一致; 而N-乙基甲胺与对乙烯基苯硼酸的混合物在pH 8.8时才产生明显位移; 心得安和莱克多巴胺分别与对乙烯基苯硼酸混合后，其化学位移随pH值的改变仅发生微小变化，而核磁信号响应与对乙烯基苯硼酸并不相同。以上结果说明，邻苯二酚与对乙烯基苯硼酸在碱性条件下即发生亲和作用，亲和作用随pH值的增加而增强，而含有羟乙基胺结构的化合物N-甲基-2-羟基乙胺、心得安和莱克多巴胺也与对乙烯基苯硼酸发生类似的相互作用，且相互作用随pH值的增加呈增强趋势，但相互作用强度也各不相同。由此可根据取代硼酸与顺式二羟基化合物相互作用的机理做如下推断：苯硼酸在碱性条件下与羟乙基胺化合物发生相互作用，其亲和能力与羟乙基胺化合物分子结构中的氨基和羟基有关，氨基具有比羟基更强的供电子能力，通过共轭作用向硼原子传递电子; 在强碱性条件下，苯硼酸中的硼原子与介质中的氢氧根发生配位，由共平面三角形转变成四面体结构的硼离子，与羟乙基胺化合物发生共价结合。N-乙基甲胺结构中没有羟基在强碱性条件下也能与对乙烯基苯硼酸发生相互作用，推测可能是硼原子在强碱性条件下已与氢氧根发生配位，与强供电子基团氨基可直接发生共价结合。心得安和莱克多巴胺等两种羟乙基胺类化合物需要在更强碱性条件下才与对乙烯基苯硼酸发生相互作用，可能是受空间位阻的影响。

  图 2

  

  图 2.  对乙基苯硼酸与邻苯二酚、N-甲基-2-羟基乙胺、丁醇、N-乙基甲胺、心得安、莱克多巴胺在不同pH值条件下的硼核磁共振图(A, pH 7.0; B, pH 8.8; C, pH 10.0)

  Figure 2.  ¹¹B-NMR spectra of VPBA with different compounds: catechol, 2-methylaminoethanol (MAE), butanol, N-ethylmethylamine (EMA), propranolol, ractopamine, under different pH conditions (A, pH 7.0; B, pH 8.8; C, pH 10.0)

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  为进一步确认取代硼酸与羟乙基胺化合物发生相互作用的基团，选择硼-氮配位(B-N)的4-氨基-2-((二甲基胺)甲基)苯硼酸钠盐(ADMPBA)考察了其与羟乙基胺类化合物N-甲基-2-羟基乙胺、心得安和莱克多巴胺间的相互作用。如图 3所示，当硼氮配位的硼酸盐分别与N-甲基-2-羟基乙胺、心得安和莱克多巴胺后混合后，各物质的核磁共振谱图未发生任何变化，可得出硼原子是取代硼酸与羟乙基胺化合物发生相互作用的位点。后面将通过液相色谱法进一步进行验证。

  图 3

  

  图 3.  4-羧基-2-((二甲基胺)甲基)苯硼酸与邻苯二酚，N-甲基-2-羟基乙胺，心得安，莱克多巴胺溶于氘代甲醇的硼核磁共振图

  Figure 3.  ¹¹B-NMR spectra of ADMPBA with different compounds: catechol, 2-methylaminoethanol, propranolol, ractopamine dissolved in MeOD

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  在取代硼酸与顺式二羟基化合物的相互作用中，除亲和作用外，还存在着配位及氢键等作用，其中质子化溶剂与氢键作用的产生密切相关。因此，选择乙腈作为非质子化溶剂考其对苯硼酸与羟乙基胺类化合物相互作用的影响，结果如图 4所示。对乙烯基苯硼酸在乙腈中的化学位移向高场移动，N-甲基-2-羟基乙胺在以氘代甲醇做溶剂时和对乙烯基苯硼酸发生强相互作用(如图 2所示)，而在ACN为溶剂时相互作用明显被削弱。类似地，心得安和莱克多巴胺与对乙烯基苯硼酸间微弱的变化也完全消失(与图 2B比较)，由此可判断非质子化溶剂会破坏取代硼酸与羟乙基胺化合物的相互作用。

  图 4

  

  图 4.  对乙基苯硼酸及其与N-甲基-2-羟基乙胺、心得安、莱克多巴胺在不同溶剂中的硼核磁谱图(pH 8.8)

  Figure 4.  ¹¹B-NMR spectra of VPBA and VPBA with different reagents dissolved in different solvents: 2-methylaminoethanol, propranolol, ractopamine under the pH 8.8

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  综上可知，对乙烯基苯硼酸与羟乙基胺化合物的相互作用不同于硼酸与顺式二羟基化合物的作用机理，两者之间的相互作用主要受环境pH值的影响，而非质子化溶剂可能会破坏对乙烯基苯硼酸与羟乙基胺化合物间的相互作用，推测以上两化合物间发生了如下的相互作用：

  3.2   亲和色谱分析

  采用亲和色谱法进一步验证以上作用机理，分别从盐浓度、流动相pH值和非质子化溶剂等3个方面考察了苯硼酸型整体柱与羟乙基胺化合物的相互作用。

  3.2.1   盐浓度的影响

  在液相色谱中添加盐通常是为了增加流动相的离子强度，增强洗脱能力，而在亲和色谱法中离子的相互作用能够影响硼亲和的选择性，尤其是分析物带电荷的情况下，需要通过添加盐来进行抑制。因此，考察了盐浓度对乙烯基苯硼酸与羟乙基胺化合物产生的可能影响。如图 5所示，当上样液缓冲盐的浓度逐渐降低时，除马布他林外，其余样品均未发生任何变化，马布他林在高盐浓度下有部分样品流失，但降低盐浓度以后样品流失情况就得到改善，表明对乙烯基苯硼酸与羟乙基胺化合物相互作用受盐浓度的影响有限。

  图 5

  

  图 5.  羟乙基胺化合物在不同浓度缓冲溶液条件下色谱图流动相为pH 8.5不同浓度的磷酸盐缓冲溶液(A，100 mol/L; B，50 mol/L; C，10 mmol/L)，60 min时切换为100 mmol/L HAc

  Figure 5.  Chromatograms of hydroxyethylamines on the boronate affinity monolithic column with different concentrations of phosphate buffer (pH 8.5) (A, 100 mol/L; B, 50 mol/L; C, 10 mmol/L), but switched to 100 mmol/L HAc at 60 min

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  3.2.2   pH值的影响

  通过NMR的分析发现，pH值是取代硼酸与羟乙基胺化合物相互作用的主要影响因素，为此，在亲和色谱法中考察了流动相pH值对羟乙基胺类物质捕获的影响。如图 6所示，当流动相的pH=8.8时，羟乙基胺化合物都可以被硼亲和色谱柱捕获，随着流动相pH值的逐渐降低，艾司洛尔、科伦特洛和马布他林3种分析物捕获不完全，表明pH值是影响两类物质相互作用的主要因素，这与NMR分析结论一致。

  图 6

  

  图 6.  羟乙基胺化合物在不同pH值条件下的色谱图流动相为10mmol/L磷酸缓冲溶液(pH：A，8.8; B，7.5; C，6.5)，60 min时切换为100 mmol/L HAc

  Figure 6.  Chromatograms of hydroxyethylamines on the boronate affinity monolithic column. The mobile phase was with 10 mmol/L phosphate buffer of different pH (A, 8.8; B, 7.5; C, 6.5), but switched to 100 mmol/L HAc at 60 min.

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  采用亲和色谱法进一步考察羟乙基胺化合与取代硼酸间相互作用的基团，选取硼-氮配位的4-氨基-2-((二甲基胺)甲基)苯硼酸(ADMPBA)为功能单体制备功能化的整体柱，用于吸附羟基乙胺类化合物。结果表明，在碱性条件下，以ADMPBA为功能单体制备的整体柱对羟乙基胺化合物均无保留，说明已存在硼氮配位的ADMPBA无法再与含羟乙基胺化合物发生亲和作用，进一步证明了取代硼酸与羟乙基胺化合物发生相互作用的基团，这一结论与核磁测试结果相吻合。

  3.2.3   非质子化溶剂的影响

  NMR的分析结果得出非质子化溶剂的存在不利于苯硼酸与羟乙基胺化合物间的相互作用。乙腈作为一种常用的液相色谱流动相，对于苯硼酸和羟基乙胺类化合物亲和作用的影响需要进一步考察。在10 mmol/L pH 8.5的磷酸盐缓冲溶液中，分别以5%，15%，30%和45%的乙腈作为流动相，考察不同浓度的非质子化溶剂对亲和作用的影响。如图 7所示，随着流动相中乙腈浓度的增加，羟乙基胺化合物保留逐渐降低，当乙腈浓度达到45%时，各物质在碱性条件下几乎都被洗脱。作为对比，选取硼功能化整体柱与顺式二羟基化合物在高乙腈比例条件下进行分离(图 8)。与羟乙基胺化合物不同，在乙腈浓度达到30%直至45%的流动相体系中，邻苯二酚也完全被硼亲和功能化整体柱保留。这再次证明了非质子化溶剂会破坏苯硼酸与羟乙基胺之间的相互作用。

  图 7

  

  图 7.  羟乙基胺化合物在不同乙腈浓度条件下的色谱图流动相为含不同乙腈浓度的10 mmol/L磷酸缓冲溶液(pH 8.5)，60 min时切换为100 mmol/L HAc.乙腈的浓度：A, 5%; B，15%; C，30%; D，45%

  Figure 7.  Chromatograms of hydroxyethylamines on the boronate affinity monolithic column. The mobile phase was 10 mmol/L phosphate buffer (pH 8.5) containing different concentrations of ACN(A, 5%; B, 15%; C, 30%; D, 45%), switched to 100 mmol/L HAc at 60 min.

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  图 8

  

  图 8.  不同乙腈浓度条件下邻苯二酚在硼酸型整体柱上的色谱图

  Figure 8.  Chromatograms of catechol on the boronate affinity monolithic column. Mobile phase was 10 mmol/L phosphate buffer (pH 8.5) containing different concentrations of acetonitrile, but switched to 100 mmol/L HAc at 60 min.

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  4.   结论

  采用NMR和HPLC研究了取代硼酸与羟乙基胺化合物间的相互作用机理。研究结果表明，羟乙基胺化合物与苯硼酸间存在着类似于硼亲和作用的受pH值调控的相互作用，但与硼亲和相互作用不同的是，该相互作用高度依赖可质子化溶剂环境，非质子溶剂的存在会破坏其相互作用。以上研究结果为深入认识硼亲和作用和获得良好的硼亲和选择性提供了新的依据，同时也为利用取代硼酸和羟乙基胺化合物之间的相互作用奠定了基础。

  
  
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      Takafumi O, Satoko N, Hiroshi N. J. Chromatogr. B, 1996, 675(1):168-173 doi: 10.1016/0378-4347(95)00313-4

  34. [34]

      Ren L B, Liu Y C, Dong M M, Liu Z. J. Chromatogr. A, 2009, 1216(47):8421-8425 doi: 10.1016/j.chroma.2009.10.014

  35. [35]

      Li H Y, Wang H Y, Liu Y C, Liu Z. Chem. Commun., 2012, 48(34):4115-4117 doi: 10.1039/c2cc30230f

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      Su J, Chen F, Cryns L V, Messersmith P B. J. Am. Chem. Soc., 2011, 133(31):11850-11853 doi: 10.1021/ja203077x

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  图 1  实验所用的羟乙基胺及对照化合物的化学结构式

  Figure 1  Chemical structure of hydroxyethylamines and reference compounds used in this study

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  图 2  对乙基苯硼酸与邻苯二酚、N-甲基-2-羟基乙胺、丁醇、N-乙基甲胺、心得安、莱克多巴胺在不同pH值条件下的硼核磁共振图(A, pH 7.0; B, pH 8.8; C, pH 10.0)

  Figure 2  ¹¹B-NMR spectra of VPBA with different compounds: catechol, 2-methylaminoethanol (MAE), butanol, N-ethylmethylamine (EMA), propranolol, ractopamine, under different pH conditions (A, pH 7.0; B, pH 8.8; C, pH 10.0)

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  图 3  4-羧基-2-((二甲基胺)甲基)苯硼酸与邻苯二酚，N-甲基-2-羟基乙胺，心得安，莱克多巴胺溶于氘代甲醇的硼核磁共振图

  Figure 3  ¹¹B-NMR spectra of ADMPBA with different compounds: catechol, 2-methylaminoethanol, propranolol, ractopamine dissolved in MeOD

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  图 4  对乙基苯硼酸及其与N-甲基-2-羟基乙胺、心得安、莱克多巴胺在不同溶剂中的硼核磁谱图(pH 8.8)

  Figure 4  ¹¹B-NMR spectra of VPBA and VPBA with different reagents dissolved in different solvents: 2-methylaminoethanol, propranolol, ractopamine under the pH 8.8

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  图 5  羟乙基胺化合物在不同浓度缓冲溶液条件下色谱图流动相为pH 8.5不同浓度的磷酸盐缓冲溶液(A，100 mol/L; B，50 mol/L; C，10 mmol/L)，60 min时切换为100 mmol/L HAc

  Figure 5  Chromatograms of hydroxyethylamines on the boronate affinity monolithic column with different concentrations of phosphate buffer (pH 8.5) (A, 100 mol/L; B, 50 mol/L; C, 10 mmol/L), but switched to 100 mmol/L HAc at 60 min

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  图 6  羟乙基胺化合物在不同pH值条件下的色谱图流动相为10mmol/L磷酸缓冲溶液(pH：A，8.8; B，7.5; C，6.5)，60 min时切换为100 mmol/L HAc

  Figure 6  Chromatograms of hydroxyethylamines on the boronate affinity monolithic column. The mobile phase was with 10 mmol/L phosphate buffer of different pH (A, 8.8; B, 7.5; C, 6.5), but switched to 100 mmol/L HAc at 60 min.

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  图 7  羟乙基胺化合物在不同乙腈浓度条件下的色谱图流动相为含不同乙腈浓度的10 mmol/L磷酸缓冲溶液(pH 8.5)，60 min时切换为100 mmol/L HAc.乙腈的浓度：A, 5%; B，15%; C，30%; D，45%

  Figure 7  Chromatograms of hydroxyethylamines on the boronate affinity monolithic column. The mobile phase was 10 mmol/L phosphate buffer (pH 8.5) containing different concentrations of ACN(A, 5%; B, 15%; C, 30%; D, 45%), switched to 100 mmol/L HAc at 60 min.

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  图 8  不同乙腈浓度条件下邻苯二酚在硼酸型整体柱上的色谱图

  Figure 8  Chromatograms of catechol on the boronate affinity monolithic column. Mobile phase was 10 mmol/L phosphate buffer (pH 8.5) containing different concentrations of acetonitrile, but switched to 100 mmol/L HAc at 60 min.

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