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  1    引言

  本文以生物相容性好的荧光纳米材料碳点作为荧光成像信号源和药物载体, 针对抗癌药物的自身缺陷, 基于癌变组织和细胞存在较高的叶酸受体表达以及较低pH值微环境等生理特征, 通过引入pH刺激响应基团腙键和靶向配体叶酸, 设计与合成了pH响应多功能靶向药物输送及成像纳米系统, 实现抗癌药物分子阿霉素的共价键引入装载、靶向输送和刺激响应可控释放及细胞成像, 期望能为纳米药物输送系统的设计、合成以及减小药物毒副作用和指导临床应用提供有力支持.

  碳点作为一种新型的零维碳纳米材料, 具有稳定的骨架结构、易于修饰的表面、优良的水溶性、优异的光学性质以及生物相容性等优良性质^[10]. 由于其优越的性质, 碳点在生物成像、疾病诊断、印刷墨水、光学催化等方面已成为近年研究的热点^[11～16], 而在药物输送方面的研究甚少^[17～20].

  然而, 肿瘤组织内的pH值为6.5～7.2, 表现出弱酸性^{[4, 5]}, 而肿瘤细胞中的溶酶体具有更强的酸性, 这为药物可控释放提供了一种理想的触发剂. 基于此, 众多研究者开发出多种pH响应可控释放的纳米载药系统来实现药物的可控释放^[6～9].

  近年来, 癌症已经成了当今社会危害人类身体健康的严重疾病^[1]. 传统的化疗药物在半衰期、非特异性毒性、水溶性差以及多药耐药性等方面有着诸多的局限性, 因此设计和构建能有效输送抗癌药物至癌变部位, 并可控制药物释放速率、维持血药浓度、减小药物毒副作用等的药物载体是临床医学非常重要的研究内容. 而纳米药物载体凭着其独特的性能, 在解决这一问题方面有着极具诱人的前景^{[2, 3]}. 其中荧光纳米粒子由于兼具药物释放和成像功能而备受关注. 一般来说, 基于荧光纳米粒子的载药系统具有两方面的特征: 光致发光和药物纳米载体. 然而, 由于细胞内微环境的复杂性和药物控释的多样性, 设计和合成药物释放和成像双重功能的药物输送系统具有很大挑战.

  2    结果与讨论

  2.1    碳点载药系统DOX-CDots-FA的合成与表征

  我们采用微波法制备了表面带氨基的碳点, 并通过EDC缩合酰胺化反应将靶向基团叶酸接枝到碳点表面, 随后利用预先合成的四臂连接化合物2将阿霉素接枝碳点表面, 得到碳点载药系统DOX-CDots-FA, 合成的具体过程如图 1所示.

  

  图1 载药系统DOX-CDots-FA的合成路线

  Figure 1. Synthesis route for the DOX-CDots-FA (the Cdots-based targeted prodrug). The numbers for the functional groups on the Cdot do not reflect their actual numbers

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  2.2    碳点载药体系DOX-CDots-FA体外释药分析

  为了检测DOX-CDots-FA体系的pH响应性, 本文研究了不同pH值下DOX-CDots-FA载药体系的阿霉素释放规律, 其结果如图 7所示. 从图可知, 在pH＝7.4的PBS缓冲液中, 阿霉素24 h内释放速率较为缓慢, 只有6%的累计药物释放量, 其释放量几乎可以忽略不计, 因PBS缓冲液为模拟生理条件, 由此证明碳点载药系统DOX-CDots-FA在血液循环期间稳定存在, 几乎不释放出阿霉素药物, 毒副作用低. 随着缓冲溶液pH值降低, 阿霉素的释放速率越快, 阿霉素的释放量也会增大, 且在24 h内, DOX-CDots-FA载药体系在pH＝6.0及5.2的缓冲液中的累计药物释放量分别约为32%和55%. 这是由于阿霉素抗癌药物通过羧酸腙键与碳点纳米颗粒连接, 而羧酸腙键在酸性条件下极易发生水解而断裂, 且酸性越强, 断裂速度越快, 从而阿霉素在酸性缓冲液中的释放速率会加快.

  有研究发现, 人体正常组织与血液的pH值为7.4, 而肿瘤组织与细胞的pH相对较低, 肿瘤细胞周围的pH值约为6.0, 肿瘤细胞内的溶酶体与内涵体的pH值约为5.2. 结合DOX-CDots-FA载药体系释放阿霉素的pH响应性, DOX-CDots-FA载药体系到达肿瘤组织后将实现靶向定位释药功能, 其原理示意图如图 8所示. 当DOX-CDots-FA载药体系在经过血液循环, 到达肿瘤组织后, DOX-CDots-FA会在叶酸受体介导作用下, 通过内吞作用靶向进入肿瘤细胞, 随着pH下降, 酸性逐渐增强, DOX-CDots-FA体系的羧酸腙键会发生水解而断裂, 从而快速地释放出抗癌药物阿霉素, 随着溶酶体逃逸, 阿霉素可相继进入肿瘤细胞的细胞质与细胞核, 有效的杀死癌细胞, 从而起到化疗的治疗效果.

  

  图7 不同pH下碳点靶向载药体系DOX-CDots-FA的DOX释放曲线

  Figure 7. DOX release profile from the DOX-CDots-FA prodrug at 37 ℃

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  2.3    细胞毒性分析

  以游离阿霉素为对比, 采用MTT法分别检测了碳点靶向载药体系DOX-CDots-FA, 碳点非靶向载药体系DOX-Cdots对HeLa和L929细胞的毒性, 其结果如图 9所示. 从图 9(A)可以看出, 对于叶酸过度表达 (FR+)HeLa细胞, 随着DOX浓度逐渐增大, DOX-CDots-FA与DOX-Cdots的细胞毒性差别较大, 其中碳点靶向载药体系DOX-CDots-FA表现出优越的细胞毒性. 这是因为FR阳性HeLa肿瘤细胞里含有大量过度表达的叶酸受体, 能与叶酸靶向载药系统DOX-CDots-FA特异性地结合, 通过内吞作用进入细胞, 从而大大增加了细胞对DOX-CDots-FA的摄取量, 有效提高癌症治疗效果.

  然而, 从图 9(B)可以看出, 对于无叶酸过度表达L929(FR-)细胞, 碳点靶向载药体系DOX-CDots-FA与非靶向载药体系DOX-Cdots的细胞毒性差别不大, 叶酸靶向基团并不能提高DOX-CDots-FA碳点载药体系的细胞毒性. 这主要是因为FR阴性正常细胞表面不含过度表达的叶酸受体, DOX-CDots-FA不能与之发生特异性结合, 细胞摄取量不大, 从而表现与DOX-CDots体系的效果相当, 细胞毒性的效果一般. 与纳米载药体系相比, 游离阿霉素对细胞呈现出较低的细胞存活率. 这是由于游离DOX为疏水小分子, 通常是以被动扩散形式进入，HeLa与L929细胞对纯DOX的摄取量都比较大, 细胞存活率低. 而DOX-CDots-FA和DOX-Cdots纳米体系粒径较大, 一般通过内吞作用进入细胞, 摄取过程较为缓慢, 从而较游离的DOX细胞存活率高^[23]. 因此, 叶酸受体介导能增加细胞的内吞作用, 提高细胞对载药系统的摄取量, 在叶酸受体过度表达的HeLa细胞中, 叶酸靶向载药体系DOX-CDots-FA的细胞毒性明显好过非靶向载药体系DOX-CDots.

  

  图9 不同浓度DOX的DOX-CDots-FA和DOX-CDots载药体系及纯DOX的在(A) Hela (FR+)和(B) L929 (FR-)细胞存活率

  Figure 9. Cytotoxic effects of DOX, DOX-CDots-FA and DOX-CDots particles against (A) HeLa (FR+) and (B) L929 (FR-) cells with increasing DOX concentrations. Three independent experiments were performed, each with sets of eight replicates. Data represent mean ± SD from three independent experiments

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  图8 碳点靶向载药体系DOX-CDots-FA细胞药物释放作用示意图

  Figure 8. Schematic illustration for a targeted prodrug system based on CDots

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  2.4    细胞摄取

  

  图11 DOX-CDots-FA在HeLa细胞中培养6 h后的共聚焦荧光显微镜成像图

  Figure 11. The CLSM images of HeLa cells treated with DOX-CDots-FA (A, B, C) at 37 ℃ for 6 h. (The DOX-equivalent dose: 10 mg/mL)

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  图10 DOX-CDots-FA与DOX-CDots在HeLa细胞中培养1, 2, 6 h后的共聚焦荧光显微镜成像图

  Figure 10. The CLSM images of Hela cells treated with DOX-CDots-FA (A1, B1, C1) and DOX-CDots (D1, E1, F1) at 37 ℃ for 1, 2 and 6 h. (The DOX-equivalent dose: 10 mg/mL)

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  HeLa细胞对碳点靶向载药体系DOX-CDots-FA及碳点载药体系DOX-CDots的药物摄取情况用激光共聚焦荧光显微镜成像观察, 其结果如图 10所示. HeLa细胞分别与DOX-CDots-FA和碳点载药体系DOX-CDots共培养1, 2, 6 h, 两体系都能收到蓝色和红色荧光信号, 且A1, B1, C1的荧光信号强度明显好于D1, E1, F1, 说明两种体系都被HeLa细胞所摄取, 且细胞对DOX-CDots-FA载药体系的摄取量要高于DOX-CDots载药体系, 由此可以证明DOX-CDots-FA靶向载药体系通过叶酸介导靶向进入细胞内, 增大了细胞对该体系的摄取量. 另外, 随着与细胞共培养时间的增加, 红色通道和蓝色通道的荧光信号都逐渐增强, 说明HeLa细胞所摄取载药体系DOX-CDots-FA和DOX-CDots的量越来越大. 当载药体系与细胞孵化1 h后, 观察蓝色与红色通道叠加照片C1, F1发现, 红色荧光信号与蓝色荧光信号具有很好的共区域化现象, 说明此时的载药体系虽然已经进入了细胞, 但是药物的释放量还很少. 当与细胞孵化2 h后, 在细胞核周边区域可以观察到微弱的红色荧光信号, 说明载药体系逐渐进入pH值较低的溶酶体, 连接键羧酸腙键发生水解而断裂, 抗癌药物阿霉素(DOX)逐渐被释放出来了, 且渐渐的进入了HeLa细胞的细胞核区域. 细胞孵化6 h后, 观察由A1, B1, C1所放大图片A, B, C(图 11)发现, 蓝色荧光信号只存在于细胞膜和细胞质区域, 而在细胞核中没有看到. 红色荧光信号除了存在于细胞膜与细胞质区域外, 还明显存在于细胞的细胞核区域, 说明经过6 h的孵化后, DOX-CDots-FA释放出大量的阿霉素药物并进入细胞核区域, 破坏DNA, 抑制细胞的生长.

  2.1.3    载药体系DOX-CDots-FA及其中间产物紫外-可见吸收光谱及载药量测定

  其中, S_FA为FA上苯环质子峰的积分面积; S_DOX为DOX上苯环上质子峰的积分面积; 441为叶酸的摩尔分子质量, 经计算, 碳点靶向载药体系中的叶酸量为3.13%.

  

  图5 载药体系DOX-CDots-FA(红色)、DOX- CDots(黑色)、FA(蓝色)、CDots-FA(绿色)及CDots(粉色)的紫外可见吸收光谱

  Figure 5. UV-Vis absorption spectra of DOX-CDots-FA (red), DOX- CDots (black), FA (blue), CDots-FA-Le (green) and CDots (pink) in PBS

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  图 5为载药体系DOX-CDots-FA及其中间产物紫外-可见吸收光谱. 由图 5可知, 叶酸和阿霉素分别在275和485 nm有明显特征吸收峰. 与叶酸(FA)和阿霉素(DOX)的紫外吸收光谱相比, DOX-CDots-FA的紫外-可见吸收光谱不仅在275 nm有吸收峰, 而且在485 nm处出现DOX的特征吸收峰, 由此表明叶酸和阿霉素都成功接枝到碳点表面. 同理, DOX-CDots的紫外-可见吸收光谱也可证明对比样品DOX-CDots成功合成.

  采用紫外可见吸收光谱研究碳点靶向载药体系DOX-CDots-FA的阿霉素载药量^[21]. 从图 5可以看出, 阿霉素与碳点的吸收光强度会产生重叠, 我们可以扣除碳点的吸收光而得到阿霉素的净吸收, 然后按照阿霉素的标准曲线计算载药体系中阿霉素载药量. 经过计算, 目标碳点靶向载药体系中阿霉素载药量约为13.5%. 另外, 通过¹H NMR图谱图 4计算FA在CDots表面的含量, 具体计算式如下:

  2.1.2    目标载药体系DOX-CDots-FA的¹H NMR表征

  图 4为目标载药体系DOX-CDots-FA在D₂O中的¹H NMR谱图, 从图中可知, 化学位移在δ 8.4和6.4处的吸收峰为叶酸(FA)苯环和喋啶环上的质子振动峰, 化学位移在δ 7.5处的吸收峰为阿霉素(DOX)苯环上的质子振动峰. 结果表明, 阿霉素(DOX)与叶酸(FA)都成功键接到碳点表面, 从而制备出目标碳点载药体系DOX-CDots-FA.

  

  图4 目标载药体系DOX-CDots-FA的¹H NMR谱图

  Figure 4. The ¹H NMR spectrum of DOX-CDots-FA

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  2.1.1    化合物1和2的结构表征

  图 2(A)为化合物1的核磁共振氢谱图. 化学位移δ 1.69和3.66分别表示主链上仲胺的β位的两个亚甲基和四个甲酯基团的质子峰, 且这两处峰的积分面积比为1:3, 由此表明化合物1为目标产物. 图 2(B)则给出了四臂连接化合物2的¹H NMR谱图. 从图 2中可知, 与化合物1的¹H NMR谱图相比, δ 3.66处的甲酯特征振动峰消失, 且在δ 8.5处出现了新的质子振动峰, 由此可以证明甲酯基已经转化为酰肼, 表明化合物2已经成功合成. 此外, 为了进一步确认四臂连接化合物2为目标产物, 对其相对分子质量进行了质谱测试, 其结果见图 3所示. 其化学分子式为C₂₂H₄₈N₁₀O₇, 理论分子量为564.37, 在质谱结果中的分子质量是564.65. 质谱图中的分子量与理论分子量相一致, 进一步确认了化合物2的结构, 结合¹H NMR谱图可知, 化合物2已被成功合成.

  

  图2 化合物1 (A)和2 (B)的¹H NMR谱图

  Figure 2. The ¹H NMR spectra of compounds 1 (A) and 2 (B)

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  图3 化合物2的质谱图

  Figure 3. The ESI-MS spectrum of compound 2

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  2.1.4    碳点CDots的粒径分析及其荧光光谱性质研究

  

  图6 碳点CDots的高分辨率透射电子显微镜图(A), 原子力显微镜(AFM)图像(B), 荧光发射光谱图(C)和载药体系DOX-CDots-FA的高分辨率透射电子显微镜图(D)

  Figure 6. The HR-TEM image (A), AFM topography image (B), photoluminescence spectrum (C) of the CDots and the HR-TEM image (D) of DOX-CDots-FA

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  图 6(A)为CDtos的高分辨率透射电子显微镜(HR-TEM)图, 从图中可以看出, 碳点的表面分布均匀, 平均粒径约为4 nm. 另外, 图 6(B)为CDtos的原子力显微镜图. 同样, 碳点颗粒分布均匀, 呈圆形, 平均厚度在4 nm左右. 另外, 我们对DOX-CDots-FA载药体系的粒径进行了测试, 其结果见图 6(D). 从图中可以看出, DOX-CDots-FA载药体系的平均粒径约为6 nm, 比碳点的平均粒径略大, 较大的粒径可能是阿霉素通过四臂连接化合物到碳点表面引起的.

  图 6(C)为碳点CDots在不同激发波长照射下的荧光光谱图(激发波长分别为350～440 nm, 每间隔10 nm). 随着激发波长的逐渐增加, 荧光强度呈现先升高再下降的趋势, 且最大发射峰的位置也发生了显著的红移现象. 这与先前报道的碳点的荧光性质是一致的^[22].

  3    结论

  采用一步微波法制备了氨基化碳点, 并将叶酸与阿霉素药物接枝到其表面, 成功制备了一种基于碳点的多功能靶向载药系统DOX-CDots-FA. DOX-CDots-FA具有良好的pH响应性, 随着pH值降低, 药物释放速率加快. 与非靶向载药体系DOX-Cdots相比, 由于叶酸受体的介导作用, 碳点靶向载药体系DOX-CDots-FA能被HeLa (FR+)细胞快速摄取, 并表现出更强的细胞毒性. 细胞摄入成像实验表明, DOX-CDots-FA在叶酸介导下进入HeLa细胞释放出药物阿霉素, 随后阿霉素进入细胞核区域, 破坏DNA, 抑制细胞的生长, 从而实现有效的靶向治疗.

  4    实验部分

  4.1    材料与仪器

  盐酸阿霉素(DOX•HCl)购买于Wako Chemicals(日本); 叶酸(FA), N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基-碳二亚胺盐酸盐(EDC), 乙酰丙酸(Levulinic acid, LA), 三氟乙酸(TFA), N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS), 4, 7, 10-三氧- 1, 13-十三烷二胺均购买于阿拉丁试剂; MTT盐, 二甲基亚砜(生物级DMSO), 丙烯酸甲酯, 水合肼(N₂H₄•H₂O 80%)均购于Sigma-Aldrich试剂; 三乙胺(TEA), 二甲基甲酰胺(DMF), 甲醇, 丙酮, 磷酸二氢钠(NaH₂PO₄), 磷酸氢二钠(Na₂HPO₄), 醋酸均为分析纯, 购买于广州化学试剂厂; HeLa细胞株(人体宫颈癌细胞, FR阳性细胞), L929细胞株(小鼠成纤维细胞, FR阴性细胞)均购买于ATCC; RPMI 1640基础培养基, 含叶酸基础培养基RPMI 1640(+FA), 不含叶酸基础培养基RPMI 1640 (-FA)购买于Invitrogen; 胎牛血清(FBS), 购买于HyClone; 双抗(青霉素/链霉素, 浓度为10⁴ U/mL), 胰蛋白酶(0.25% Trypsin-EDTA)均购买于Gibco; 实验室所用去离子水, 自制.

  DI Veeko Multimode V型原子力显微镜(德国Bruker公司), JEM-2100(HR)型高分辨率透射电子显微镜(日本JEOL公司), U-3010型紫外-可见光分光光度计(日本Hitachi公司), Multiskan MK3酶标仪(美国Thermo公司), Avance Digital 400 MHz超导核磁共振仪(德国Bruker公司), LCQ DECA XP型高效液相色谱-质谱联用仪(美国Thermo公司), TCS-SP2型激光共聚焦显微镜(德国Leica公司).

  4.2    实验方法

  4.2.6    阿霉素(DOX)载药量测试方法

  用紫外-可见吸收光谱测量载药体系DOX-CDots-FA, 碳点(CDots)等物质的紫外-可见光吸收光谱, 测定样品在485 nm处的吸光光度值, 用差减法根据阿霉素的标准曲线计算DOX-CDots-FA的载药量.

  4.2.8    细胞毒性测试方法

  选用HeLa细胞株(人体宫颈癌细胞, FR过度表达)和L929细胞株(小鼠成纤维细胞, 正常细胞, 无FR过度表达)作为实验对象. 碳点靶向载药体系DOX-CDots-FA, 碳点非靶向载药体系DOX-CDots, 以及游离阿霉素(DOX)分子细胞毒性测试采用MTT比色法来检测. 分别将两种细胞接种于96孔板中, 接种浓度为5000个/孔, 选用A₀孔作为参照孔, 放置于37 ℃的含有5%的CO₂培养箱中培养. 待培养24 h后, 取出96孔板, 换液, 随后加入200 mL含有不同浓度阿霉素的游离DOX分子, DOX-CDots-FA载药体系, DOX-CDots载药体系, 其中, DOX的浓度分别为0, 2, 4, 6, 8, 10 μg/mL; 随后放入培养箱培养48 h. 待培养完后, 换液冲洗, 然后每孔加180 mL培养基后, 继续加20 mL MTT盐溶液(MTT的最终浓度为0.5 mg/mL), 摇匀, 使MTT盐分散均匀, 置于培养箱中继续培养. 4 h后, 取出96孔板, 吸出液体, 每孔分别加DMSO (150 mL), 溶解晶体沉淀. 最后, 放入Thermo MK3 ELISA 酶标仪测试在570 nm下的吸光强度, 从而计算细胞的存活率.

  4.2.2    表面氨基化碳点(CDots)的制备

  表面氨基化碳点的合成参照Zhang等^[24]在文献中的制备方法. 将2 mL 4, 7, 10-三氧-1, 13-十三烷二胺和6 mL水加入到4 mL甘油/水(V/V＝2:1) 的混合溶液中, 室温超声5 min, 得到澄清透明的溶液. 随后放入750 W微波炉中辐射6 min, 冷却后得到黄棕色的粘稠状物质. 然后加入少量水后, 在透析膜(截留分子量为100) 中透析过夜48 h, 取出透析液, 减压除水, 随后干燥, 可得CDots产物.

  4.2.3    FA-CDots-Le的制备

  首先, 称取115 mg (1.0 mmol)乙酰丙酸至100 mL氮气保护下的烧瓶中, 加入20 mL干燥的DMSO溶解, 随后加入345 mg (1.8 mmol) EDC和345 mg (1.59 mmol) sulfo-NHS, 在室温条件下搅拌1 h活化羧基. 然后将上述溶液加入到预先准备好的1 g碳点溶液、DMSO (20 mL)和三乙胺(150 μL)混合溶液中, 混合搅拌24 h后, 得CDots-Le溶液.

  另外, 称取13 mg (0.03 mmol)叶酸(FA)加入到 5 mL DMSO中, 随后加入9.6 mg (0.05 mmol) EDC和10.6 mg (0.05 mmol) sulfo-NHS, 在室温条件下搅拌1 h后, 加入CDots-Le溶液, 室温下避光继续搅拌24 h. 待反应完全后, 将反应溶液滴入到甲醇沉淀, 然后用甲醇与丙酮反复洗涤3遍后得到棕色固体. 随后将棕色固体溶于少量双蒸水中, 并用截留分子量为500DA的透析膜透析除去杂质, 透析完后, 取出透析液, 减压除水, 随后干燥, 可得FA-CDots-Le产物.

  4.2.9    细胞摄取药物成像

  用培养皿培养HeLa细胞(FR过度表达)和L929细胞(无FR过度表达), 待细胞爬板后, 加入一定量的药物和培养基, 控制总体积为2000 mL, DOX的浓度为10 mg/mL. 其中, 以碳点靶向载药体系DOX-CDots-FA作为实验样, 碳点非靶向载药体系DOX-CDots作为对照样. 各自继续培养1, 2, 6 h后, 从培养箱取出, 用PBS冲洗, 用Leica TCS-SP2型激光共聚焦显微镜观察, 拍照. 激光共聚焦显微镜采用双通道成像系统, 碳点所用激发波长为405 nm, 收集415～515 nm范围的荧光; 阿霉素所用激发波长为488 nm, 收集550～600 nm波长范围的荧光.

  4.2.7    体外药物释放行为测试方法

  首先, 用Na₂HPO₄和NaH₂PO₄模拟生理条件配制pH为7.4的0.1 mol/L的PBS缓冲溶液; 用乙酸盐模拟酸性条件分别配制pH为6.0和5.2的酸性缓冲溶液. 其次, 称取2 mg的DOX-CDots-FA和DOX-CDots碳点纳米粒子载药体系, 各自分散在5 mL的缓冲液中, 超声5 min, 然后置于截留分子量为1000透析袋中透析. 然后将透析袋置于95 mL的缓冲液中, 搅拌速度和实验温度分别控制在100 r/min和 37 ℃. 随后于不同时间段取出2 mL液体, 并补加2 mL新鲜对应的缓冲溶液. 最后采用紫外-可见光谱测试不同时间段的所取样品在485 nm处的吸光光度值, 计算DOX的释放量.

  4.2.4    DOX-CDots-FA的制备

  取200 mg FA-CDots-Le, 溶解于5 mL精制的DMF中, 随后加入到上述反应混合液中, 磁力搅拌, 于室温条件下继续避光反应24 h. 将反应溶液滴入到甲醇沉淀, 然后用甲醇与丙酮反复洗涤3遍后得到棕色固体. 随后将棕色固体溶于少量双蒸水中, 并用截留分子量为500DA的透析膜透析除去杂质, 透析完后, 取出透析液, 减压除水, 随后干燥, 可得DOX-CDots-FA产物.

  首先, 称取化合物2 (271 mg, 0.48 mmol)溶解在10 mL的DMF中, 然后加入盐酸阿霉素(DOX•HCl) (145 mg, 0.25 mmol)于室温条件下避光继续反应24 h.

  4.2.5    DOX-CDots的制备

  DOX-CDots由CDots-Le (100 mg)和20 mg盐酸阿霉素(DOX•HCl)采取同样的方法制得.

  4.2.1    化合物2的制备

  将10 mL丙烯酸甲酯与10 mL甲醇按1:1 (V:V)混合后, 加入2.2 g (10 mmol) 4, 7, 10-三氧-1, 13-十三烷二胺, 并在25 ℃搅拌48 h. 待反应结束后, 旋蒸, 除去溶剂, 放入40 ℃真空干燥箱干燥24 h, 得油状产物1. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 3.66 (s, 12H), 3.65～3.61 (m, 4H), 3.61～3.52 (m, 4H), 3.45 (t, J＝6.3 Hz, 4H), 2.75 (t, J＝7.1 Hz, 8H), 2.52～2.46 (m, 4H), 2.44 (t, J＝7.1 Hz, 8H), 1.66～1.72 (m, 4H).

  往一圆底烧瓶中加入2.82 g (5 mmol)化合物1, 随后加入15 mL甲醇溶解, 在室温下剧烈搅拌均匀, 加入15 mL水合肼(N₂H₄•H₂O 80%)后室温下继续反应12 h. 待反应结束后, 除去溶剂, 干燥, 得到油状产物, 得化合物2. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 3.71～3.61 (m, 4H), 3.60～3.51 (m, 4H), 3.34 (t, J＝5.6 Hz, 4H), 2.65～2.55 (m, 8H), 2.37 (t, J＝6.3 Hz, 4H), 2.27～2.17 (m, 8H), 1.54～1.60 (m, 4H). HRMS (ESI): calcd for C₂₂H₄₈N₁₀O₇, 564.37; found, 564.65.

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  图 1  载药系统DOX-CDots-FA的合成路线

  Figure 1  Synthesis route for the DOX-CDots-FA (the Cdots-based targeted prodrug). The numbers for the functional groups on the Cdot do not reflect their actual numbers

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  图 2  化合物1 (A)和2 (B)的¹H NMR谱图

  Figure 2  The ¹H NMR spectra of compounds 1 (A) and 2 (B)

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  图 3  化合物2的质谱图

  Figure 3  The ESI-MS spectrum of compound 2

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  图 4  目标载药体系DOX-CDots-FA的¹H NMR谱图

  Figure 4  The ¹H NMR spectrum of DOX-CDots-FA

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  图 5  载药体系DOX-CDots-FA(红色)、DOX- CDots(黑色)、FA(蓝色)、CDots-FA(绿色)及CDots(粉色)的紫外可见吸收光谱

  Figure 5  UV-Vis absorption spectra of DOX-CDots-FA (red), DOX- CDots (black), FA (blue), CDots-FA-Le (green) and CDots (pink) in PBS

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  图 6  碳点CDots的高分辨率透射电子显微镜图(A), 原子力显微镜(AFM)图像(B), 荧光发射光谱图(C)和载药体系DOX-CDots-FA的高分辨率透射电子显微镜图(D)

  Figure 6  The HR-TEM image (A), AFM topography image (B), photoluminescence spectrum (C) of the CDots and the HR-TEM image (D) of DOX-CDots-FA

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  图 7  不同pH下碳点靶向载药体系DOX-CDots-FA的DOX释放曲线

  Figure 7  DOX release profile from the DOX-CDots-FA prodrug at 37 ℃

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  图 8  碳点靶向载药体系DOX-CDots-FA细胞药物释放作用示意图

  Figure 8  Schematic illustration for a targeted prodrug system based on CDots

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  图 9  不同浓度DOX的DOX-CDots-FA和DOX-CDots载药体系及纯DOX的在(A) Hela (FR+)和(B) L929 (FR-)细胞存活率

  Figure 9  Cytotoxic effects of DOX, DOX-CDots-FA and DOX-CDots particles against (A) HeLa (FR+) and (B) L929 (FR-) cells with increasing DOX concentrations. Three independent experiments were performed, each with sets of eight replicates. Data represent mean ± SD from three independent experiments

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  图 10  DOX-CDots-FA与DOX-CDots在HeLa细胞中培养1, 2, 6 h后的共聚焦荧光显微镜成像图

  Figure 10  The CLSM images of Hela cells treated with DOX-CDots-FA (A1, B1, C1) and DOX-CDots (D1, E1, F1) at 37 ℃ for 1, 2 and 6 h. (The DOX-equivalent dose: 10 mg/mL)

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  图 11  DOX-CDots-FA在HeLa细胞中培养6 h后的共聚焦荧光显微镜成像图

  Figure 11  The CLSM images of HeLa cells treated with DOX-CDots-FA (A, B, C) at 37 ℃ for 6 h. (The DOX-equivalent dose: 10 mg/mL)

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