English

• 1.   引言

  中药作为中华民族传统文化的瑰宝,是我国具有国际竞争优势的产业之一^[1]。重金属问题已成为影响中药出口和阻碍中医药行业发展的主要问题,因此准确检测和限定重金属的量是保障人民用药安全,促进中药走向国际化的关键^[2~5]。中药中重金属主要来自于药材的生长环境,如土壤、大气、水、化肥等;或与药材本身特性相关,如对重金属的自主吸收和富集功能。此外,储存环境、加工炮制等因素也可能导致中药的重金属污染。

  国家食品药品监督管理总局的2014年国家药品抽验计划将柏子养心片定为抽验品种。柏子养心片是《中国药典》2010版收载的品种,由柏子仁、朱砂、川芎等13 味中药材配伍而成^[6],产品剂型有薄膜衣片和糖衣片两种。对于柏子养心片中的朱砂毒理药理尚未明确,朱砂的主成分为硫化汞(HgS),按国家药品标准规定,每片柏子养心片含朱砂以HgS计,应为30.0~38.0 mg。HgS为难溶物质,简单地以总汞量来评价显然不能准确反映其中重金属含量。基于此,本实验重点考察分析柏子养心片中可溶性汞,同时也对柏子养心片中其它可溶性重金属进行分析。利用人工胃液模拟柏子养心片在人体内的吸收情况,提取药物利用过程中的可溶性重金属进行评价,即:采用胃液模拟仿生提取法提取,利用微波消解法对提取液进行消解,再通过电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS法)检测柏子养心片中可溶性重金属含量^[7~9]。ICP-MS法近年来在医学、药学、环境、化学和食品科学等分析领域的微量、痕量元素测定中被广泛应用^[10~17]。

  2.   实验部分

  2.1.   仪器与试剂

  7700 ICP-MS电感耦合等离子体质谱仪(美国安捷伦科技公司),KS 4000i 恒温培养摇床(德国IKA公司),AE200 电子分析天平(德国梅特勒-托利多公司),MARS 6 CLASSIC 微波消解仪(美国培安科技公司),X3离心机(美国热电公司),Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)。

  HCl(优级纯),HNO₃(MOS级),实验用水均为Milli-Q超纯水(18.2 MΩ·cm)。ICP-MS仪使用的5% HNO₃及清洗用的水均来自安捷伦科技公司。

  10 mg/L混合元素标准溶液(Ag,Al,As,Ba,Be,Ca,Cd,Co,Cr,Cs,Cu,Fe,Ga,K,Li,Mg,Mn,Na,Ni,Pb,Rb,Se,Sr,Tl,U,V和Zn,lot No.8-84YPY2)、10 mg/L汞单元素标准溶液(安捷伦科技公司)、100 mg/L内标元素标准溶液(Bi,Ge,In,⁶Li,Lu,Rh,Se,Tb)和1.0 μg/L质谱调谐液(Ce,Co,Li,Mg,Tl,Y)均购自安捷伦科技公司。胃蛋白酶(酶活力1∶3000上海蓝季科技发展有限公司)。人工胃液:按照《中国药典》2010 版二部附录85要求配制人工胃液。即:取稀HCl 16.4 mL,加水800 mL与胃蛋白酶10 g,摇匀后,加水稀释成1000 mL,即得。

  取混合元素标准溶液和汞单元素标准溶液适量,用2% HNO₃逐级稀释成各种浓度的混合标准溶液,浓度为:0,5.0,10,25,50,100和200 μg/L,摇匀,待测。

  采集柏子养心片糖衣片18批,分别编号1~18,样品覆盖吉林等9个省(区、市),柏子养心片糖衣片的现行质标准为《中国药典》2010版一部。

  2.2.   仪器工作条件

  ICP-MS仪器优化条件为: 冷却气流量,15 L/min; 辅助气流量,0.8 L/min; 载气流量,0.8 L/min; 补偿气流量,0.8 L/min; 功率,1250 W; 数据采集模式,跳峰; 扫描次数,3次。

  2.3.   实验步骤

  采用模拟人体消化药物的参数条件。即:取柏子养心片0.3 g左右,准确称定,放入50 mL离心管中,加50 mL人工胃液,在恒温振荡器中(37℃,250 r/min)振荡,4 h后,5000 r/min离心分离5 min。取上清液,过0.45 μm 水溶性滤膜。取4 mL过滤后的胃液,置聚四氟乙烯消解罐中,加入3 mL HNO₃消解液,按表 1所示程序进行微波消解,消解完毕后,设置赶酸仪的温度为120℃,赶酸2~3 h,至溶液体积剩余2~3 mL。用超纯水定容至20 mL,待测。同时制备空白样品。按照ICP-MS仪器优化条件进行3次平行实验检测。

  表 1

  

  表 1  微波消解程序

  Table 1.  Parameters for microwave digestion

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  步骤 Step	爬升 Ramp (min)	保持 Hold (min)	温度 Temperature (℃)	功率 Power (W)
  1	5	3	120	1600
  2	5	8	150	1600
  3	10	25	190	1600

  3.   结果与讨论

  3.1.   提取液的处理方法考察

  取3批柏子养心片进行胃液仿生提取4 h,平行3组。提取液离心分离后取上清液。经[CM(20]0.45 μm水溶性滤膜过滤,直接用ICP-MS检测,会出现等离子猝灭现象。为避免猝灭现象发生,实验采用微波消解技术对胃液模拟后的提取液进行消解处理。对胃液模拟提取液采用直接微波消解及添加适量HNO₃的提取液消解两种模式。从消解后的澄清度表观分析,添加HNO₃的消解液透明程度明显优于未添加HNO₃的消解液。

  3.2.   方法学考察

  考察了加入2,3和4 mL HNO₃的影响。加入2 mL HNO₃,组重金属含量波动较大;加入3或4 mL,HNO₃组重金属含量基本无变化,本实验选择加入3 mL HNO₃处理胃液提取液。采用表 1所示的微波消解程序进行消解。

  考虑该仪器ICP-MS的记忆效应,混合标准溶液浓度并未高于200 μg /L,因而将线性考察范围确定为检出限值~200 μg/L之间。依次将已经配制好的各个浓度的混合标准品溶液以每个浓度测得的3次读数的平均值为纵坐标,相应元素标准溶液浓度(μg/L)为横坐标,作标准曲线,确定其相关系数及线性范围,各元素的标准曲线关系式及相关系数等见表 2。

  表 2

  

  表 2  方法学考察结果

  Table 2.  Inspection results of methodology

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  元素 Elements	回归方程 Linear equation	线性范围 Linear range (μg/L)	线性相关系数 Correlation coefficient	检出限 LOD (μg/L)	精密度 Precision (RSD, %,n=6)	重复性 Repeatability (RSD, %,n=6)	加标回收率 Standard addition recovery (%,n=6)
  Co	y=2.56x+2.58	2.5~200	0.9999	2.5	1.6	4.1	90.1±1.1
  Cr	y=1.38x-1.73	0.54~200	0.9998	0.54	2.7	3.5	98.4±3.5
  Cu	y=6.32x-2.56	8.8~200	0.9998	8.8	1.7	3.1	98.6±1.6
  Ba	y=1.25x-2.37	2.2~200	0.9998	2.2	5.5	6.2	90.1±3.2
  Cd	y=0.99x-2.08	0.76~200	1	0.76	1.5	2.6	95.0±1.8
  Mn	y=0.17x-1.05	0.14~200	0.9999	0.41	1.7	2.1	98.1±2.2
  Ni	y=2.60x-4.77	0.79~200	1	0.79	2.8	2.5	92.5±1.9
  Pb	y=12.70x+2.16	5.6~200	0.9993	5.6	5.6	4.3	90.2±2.9
  Hg	y=17.01x-9.92	2.1~200	0.9996	2.1	1.9	3.6	93.8±3.3
  Sr	y=0.04x-1.28	0.19~200	0.9999	0.19	2.9	3.8	89.3±1.6
  Zn	y=0.89x-13.5	1.8~200	0.9989	1.8	2.5	4.0	95.6±2.3

  利用仿生提取法制备11个空白试剂,按与样品测定完全相同的实验条件同时测定,计算11次测定结果的标准偏差,取其结果的3倍标准偏差所对应的浓度值为每种元素的检出限,检出限结果见表 2。

  取编号为"4"的混合标准溶液,连续进样6次,测定,所得各金属元素的相对标准偏差(RSD)分别见表 2。准确称取样品0.4 g,按照样品处理的方法平行制备6份样品,按上述仪器条件进行测定,计算6次测定的各金属的平均含量和RSD分别见表 2。

  称取样品0.2 g,加入适量混合标准溶液,按照仿生提取法对样品进行加标回收实验,平行测定6次。结果见表 2。

  将混合标准溶液加入汞单元素标准溶液,共有28种元素进行方法学考察,有11种元素通过方法学考察,结果见表 2。

  从表 2可知,线性相关系数为0.9989~1.0000,检出限在0.19~8.8 μg/L之间,满足检测要求。本方法重复性RSD值均小于6.2%,精密度的RSD值均小于5.6%,加标回收率在87.7%~101.9%之间。结果表明,本方法能够满足柏子养心片中11种元素检测的要求。

  3.3.   样品分析

  根据实验优化条件下的仿生提取-微波消解技术对柏子养心片进行前处理,利用ICP-MS仪器优化工作条件对样品进行测定,柏子养心片中通过方法学考察的11种元素检测结果见表 3。

  表 3

  

  表 3  柏子养心片中可溶性重金属的含量(mg/kg,n=3)

  Table 3.  Concentration of soluble heavy metals from Baizi Yangxin tablets (mg/kg,n=3)

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  样品编号 Sample No.	Co	Cr	Cu	Ba	Cd	Mn	Ni	Pb	Hg	Sr	Zn
  1	0.3	0.4	2.1	10.9	0.1	37.3	0.8	-	3.3	6.2	8.6
  2	0.2	0.2	2.4	19.6	0.1	37.2	0.7	-	9.3	8.6	13.2
  3	0.3	0.5	3.0	15.2	0.1	34.8	0.8	-	4.6	8.6	16.1
  4	0.2	0.5	1.4	79.1	0.1	34.6	0.6	0.1	6.6	8.3	14.0
  5	0.2	0.3	1.6	16.4	0.1	36.8	0.8	-	8.0	8.6	13.0
  6	0.2	0.8	3.1	24.4	0.1	62.7	0.7	2.0	7.2	14.7	12.2
  7	0.2	0.4	1.6	20.2	0.1	35.5	0.6	-	3.9	8.2	10.8
  8	0.2	0.2	2.4	13.1	0.1	35.4	0.7	-	2.4	7.3	11.0
  9	0.2	0.4	1.8	27.7	0.1	39.6	0.7	-	3.2	7.8	11.8
  10	0.2	0.5	2.0	21.6	0.1	50.8	0.6	0.3	5.8	13	10.5
  11	0.2	0.3	2.0	28.5	0.1	43.8	0.7	-	8.6	8.3	13.3
  12	0.1	0.3	1.2	22.4	0.1	36.0	0.5	-	6.7	7.1	9.9
  13	0.3	0.5	2.8	15.4	0.1	38.8	0.7	-	5.6	8.4	11.9
  14	0.3	0.5	2.9	18.6	0.1	51.4	0.8	-	10.6	8.7	13.5
  15	0.2	0.4	2.0	13.6	0.1	39.2	0.7	-	12.4	7.6	11.4
  16	0.2	0.3	3.1	13.5	0.1	42.5	0.7	-	5	6.8	11.0
  17	0.2	0.4	2.3	20.7	0.1	33.6	0.7	-	22.5	8.2	10.7
  18	0.3	0.4	2.4	15.8	0.1	43.3	0.8	-	12.5	9.1	12.0
  -: 未检出; 高于标准曲线的最高浓度的样品,均将其稀释后进样检测。 -: Not detected; when the Hg contents of the sample were over the standard curve,the sample solutions were diluted before detection.

  参照中华人民共和国对外贸易经济合作部《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》^[18]规定重金属限量标准:Pb≤5.0 mg/kg,Cd≤0.3 mg/kg,Cu≤20.0 mg/kg,Hg≤ 0.2 mg/kg。根据表 3结果,经过4 h的胃液模拟仿生提取,18个样品的胃液模拟后的结果显示,Pb,Cd,Cu含量均低于限量标准。Hg含量均高于标准限量值,18批样品的平均值为7.68 mg/kg,其中17号样品含量最高达22.5 mg/kg。可溶性汞含量超标。柏子养心片为含矿物朱砂的中成药,尽管朱砂在中成药的药理作用机制不明确,众所周知,高浓度汞含量对人类具有一定的毒性。因此,含朱砂中成药应严格规范。研究表明,汞的毒性还与其形态密切相关^[19~21]。 所以,对柏子养心片中可溶性重金属含量分析有助于其质量分析研究。

  4.   结 论

  通过建立的仿生提取-微波消解-ICP-M法对柏子养心片中主要可溶性重金属进行检测,利用人工胃液模拟柏子养心片在人体内的消化分解,通过仿生提取的可溶性重金属检测更能在一定程度上反应柏子养心片中重金属真实作用情况的含量大小。

  应对柏子养心片中汞的形态进一步进行分析和确定,合理科学地评价柏子养心片中汞的毒性和药效作用。对抽检柏子养心片的可溶性重金属含量检测,在一定程度上反馈抽检厂家的柏子养心片的整体水平,并为柏子养心片的炮制加工等工艺提供技术参考,为该药品的质量监控提供数据参考。

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• Table 1.  Parameters for microwave digestion

  步骤 Step	爬升 Ramp (min)	保持 Hold (min)	温度 Temperature (℃)	功率 Power (W)
  1	5	3	120	1600
  2	5	8	150	1600
  3	10	25	190	1600

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  Table 2.  Inspection results of methodology

  元素 Elements	回归方程 Linear equation	线性范围 Linear range (μg/L)	线性相关系数 Correlation coefficient	检出限 LOD (μg/L)	精密度 Precision (RSD, %,n=6)	重复性 Repeatability (RSD, %,n=6)	加标回收率 Standard addition recovery (%,n=6)
  Co	y=2.56x+2.58	2.5~200	0.9999	2.5	1.6	4.1	90.1±1.1
  Cr	y=1.38x-1.73	0.54~200	0.9998	0.54	2.7	3.5	98.4±3.5
  Cu	y=6.32x-2.56	8.8~200	0.9998	8.8	1.7	3.1	98.6±1.6
  Ba	y=1.25x-2.37	2.2~200	0.9998	2.2	5.5	6.2	90.1±3.2
  Cd	y=0.99x-2.08	0.76~200	1	0.76	1.5	2.6	95.0±1.8
  Mn	y=0.17x-1.05	0.14~200	0.9999	0.41	1.7	2.1	98.1±2.2
  Ni	y=2.60x-4.77	0.79~200	1	0.79	2.8	2.5	92.5±1.9
  Pb	y=12.70x+2.16	5.6~200	0.9993	5.6	5.6	4.3	90.2±2.9
  Hg	y=17.01x-9.92	2.1~200	0.9996	2.1	1.9	3.6	93.8±3.3
  Sr	y=0.04x-1.28	0.19~200	0.9999	0.19	2.9	3.8	89.3±1.6
  Zn	y=0.89x-13.5	1.8~200	0.9989	1.8	2.5	4.0	95.6±2.3

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  Table 3.  Concentration of soluble heavy metals from Baizi Yangxin tablets (mg/kg,n=3)

  样品编号 Sample No.	Co	Cr	Cu	Ba	Cd	Mn	Ni	Pb	Hg	Sr	Zn
  1	0.3	0.4	2.1	10.9	0.1	37.3	0.8	-	3.3	6.2	8.6
  2	0.2	0.2	2.4	19.6	0.1	37.2	0.7	-	9.3	8.6	13.2
  3	0.3	0.5	3.0	15.2	0.1	34.8	0.8	-	4.6	8.6	16.1
  4	0.2	0.5	1.4	79.1	0.1	34.6	0.6	0.1	6.6	8.3	14.0
  5	0.2	0.3	1.6	16.4	0.1	36.8	0.8	-	8.0	8.6	13.0
  6	0.2	0.8	3.1	24.4	0.1	62.7	0.7	2.0	7.2	14.7	12.2
  7	0.2	0.4	1.6	20.2	0.1	35.5	0.6	-	3.9	8.2	10.8
  8	0.2	0.2	2.4	13.1	0.1	35.4	0.7	-	2.4	7.3	11.0
  9	0.2	0.4	1.8	27.7	0.1	39.6	0.7	-	3.2	7.8	11.8
  10	0.2	0.5	2.0	21.6	0.1	50.8	0.6	0.3	5.8	13	10.5
  11	0.2	0.3	2.0	28.5	0.1	43.8	0.7	-	8.6	8.3	13.3
  12	0.1	0.3	1.2	22.4	0.1	36.0	0.5	-	6.7	7.1	9.9
  13	0.3	0.5	2.8	15.4	0.1	38.8	0.7	-	5.6	8.4	11.9
  14	0.3	0.5	2.9	18.6	0.1	51.4	0.8	-	10.6	8.7	13.5
  15	0.2	0.4	2.0	13.6	0.1	39.2	0.7	-	12.4	7.6	11.4
  16	0.2	0.3	3.1	13.5	0.1	42.5	0.7	-	5	6.8	11.0
  17	0.2	0.4	2.3	20.7	0.1	33.6	0.7	-	22.5	8.2	10.7
  18	0.3	0.4	2.4	15.8	0.1	43.3	0.8	-	12.5	9.1	12.0
  -: 未检出; 高于标准曲线的最高浓度的样品,均将其稀释后进样检测。 -: Not detected; when the Hg contents of the sample were over the standard curve,the sample solutions were diluted before detection.

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