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• 1.   引言

  膀胱癌(Bladder cancer，BC)是常见癌症之一，近几十年全球范围内膀胱癌的发病率和死亡率逐渐上升^{[1, 2]}。基于BC不同阶段和临床表现，早期诊断的患者存活率高达95%;然而对于晚期发现患者存活率降低到50%左右^[3]。因此，早期诊断和治疗会大大提高患者的存活率，辅助诊断标志物的发现是膀胱癌的研究重点之一^[4]。

  代谢组学是研究生命过程中内源性小分子变化的有效手段，能够将表型与基因型联系起来。代谢组学在发现潜在生物标志物和辅助膀胱癌早期诊断方面有独特的特点^[5]。血清中几乎包括了身体各个器官和组织的代谢物，因此在针对膀胱癌开展代谢组学研究时可以作为重点筛查对象。Zhou等^[6]采用气相色谱/质谱联用的拟靶向方法对血清进行代谢组学研究，发现富马酸、苹果酸、葡糖二酸可作为诊断膀胱癌的联合潜在生物标志物。液相色谱/质谱联用技术为疾病代谢组学主要的研究手段，陈永婧等^[7]采用反相液相色谱/电喷雾质谱联用对膀胱癌患者血清进行研究，探讨13种差异代谢物作为联合标志物进行膀胱癌辅助诊断的可能性。

  目前报道的针对膀胱癌潜在生物标志物的分析方法主要包括气相色谱-质谱联用以及反相液相色谱-质谱联用技术等^[7]，针对极性肿瘤标志物的亲水色谱-质谱联用方法尚未见广泛报道。然而血清中所含小分子代谢物种类多、极性跨度大，一些极性亲水的氨基酸、有机酸、葡萄糖、核苷酸等具有重要的生物学功能^[8]，但采用常用的反相色谱-质谱联用的方法难于分离检测，基于亲水作用色谱的代谢组学分析方法越来越多地用于疾病研究^[9]。本研究发展了一种基于两性离子的亲水作用色谱与质谱联用的非靶向代谢组学方法，用于膀胱癌患者血清中极性物质的分离分析，寻找膀胱癌的潜在代谢标志物，以期用于辅助膀胱癌诊断。

  2.   实验部分

  2.1   仪器与试剂

  采用Acquity^TMUPLC液相色谱仪(美国Waters公司)与TripleTOF 5600质谱仪(美国AB SCIEX公司)联用进行代谢组学分析，分别使用正负离子扫描模式进行检测。4种候选色谱柱分别为: (1)两性离子型亲水色谱柱SeQuant ZIC-HILIC(150 mm×2.1 mm，3 μm, 德国Merk公司)，适用pH 2~8; (2)ACQUITY UPLC BEH HILIC(100 mm×2.1 mm，1.7 μm, 美国Waters公司)，适用pH 1~8; (3)ACQUITY UPLC BEH Amide(100 mm×2.1 mm，1.7 μm, 美国Waters公司)，适用pH 2~11; (4)五氟苯基柱Discovery HS F5-3(150 mm×2.1 mm，3 μm，美国Supelco公司), 适用pH 2~8。

  甲醇、乙腈(HPLC级，德国Merck公司); 甲酸、乙酸、乙酸铵(HPLC级，美国Fisher Scientific公司); 氨基酸、有机酸、脂肪酸、胺类、糖类、核苷等69个标样购自美国Sigma-Aldrich公司、Alfa aesar和美国百灵威公司。实验用超纯水由Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)制备。

  2.2   血液样本采集

  96例膀胱癌患者血样和49例正常人血样由上海长海医院和上海医疗中心提供。经过上海长海医院伦理委员会批准，所有患者都签署了知情同意书。根据2004年世界卫生组织/国际泌尿病理学会颁布的分类标准, 采用组织病理学检查区分低级别(Low grade，LG)和高级别(High grade，HG)膀胱癌。共有96例膀胱癌患者被招募，其中包括43 LG和53 HG的病人。共有49个性别、年龄相匹配的来自上海医疗中心的健康志愿者作为对照组，样品统计信息见表 1。采样对象前一天空腹过夜，于次日早晨采血。采集到的血样在4℃下4500 r/min离心15 min，取血清置于-80℃保存。

  表 1

  

  表 1  样本统计信息

  Table 1.  Basic information of the enrolled subjects of bladder cancer (BC) patient and normal control

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  样本特征 Characteristics	发现集 Discovery set			验证集 Validation set
  	膀胱癌患者 BC patients	健康对照 Normal controls		膀胱癌患者 BC patients	健康对照 Normal controls
  样本数目 No. of subjects	64	32		32	17
  年龄(平均值，范围) Age(Average, range)	64，28~84	66，57~83		70，29~92	65，48~80
  男性/女性 Male/female	50/14	21/11		26/6	11/6

  2.3   样本预处理

  用50%(V/V)乙腈配制标准代谢物混合溶液，考察方法线性范围时配制浓度范围为0.001~100 μg/mL的系列混合标准溶液。

  血样于4℃下解冻后，取100 μL于2 mL离心管中，加入400 μL含内标的甲醇提取剂，涡旋1 min，于4℃以14000 r/min离心15 min。取上清液400 μL平均分装于2个1.5 mL离心管中冻干。复溶时加入50 μL 50%(V/V)乙腈，涡旋30 s，离心后，取40 μL上清液用于进样。含内标的甲醇提取剂包含:肉碱C2: 0-d3为0.16 μg/mL，溶血性磷脂酰胆碱LPC 19:0为0.75 μg/mL，游离脂肪酸FFA 16-d3和FFA 18-d3为2.50 μg/mL，胆酸CA-d4为1.85 μg/mL，鹅脱氧胆酸CDCA-d4为1.49 μg/mL, 亮氨酸-d3为5.00 μg/mL，缬氨酸-1-¹³C为4.00 μg/mL，苯丙氨酸-d5为3.61 μg/mL, 色氨酸-d5为4.25 μg/mL。

  质量控制样本(Quality control，QC)由全部96例膀胱癌患者和49例正常人的血样混合而成，预处理过程与血样相同。用QC样本平衡仪器，待仪器响应稳定后再进行样本分析，每6个样本插入1个QC样本，用于评价整个分析过程的重复性。

  2.4   样本分析

  色谱条件:色谱柱为SeQuant ZIC HILIC (150 mm ×2. 1 mm，3.5 μm)。流动相A为包含10 mmol/L乙酸铵和0.02%(V/V)乙酸的95%(V/V)乙腈溶液; 流动相B包含10 mmol/L乙酸铵和0. 02%(V/V)乙酸溶液。梯度洗脱: 0~8 min，100% A; 8~20 min，75% A; 20~25 min，43% A; 25~35 min，100% A。流动相流速为0.3 mL/min。柱温维持在40℃，自动进样器温度4℃。进样量为5 μL。

  质谱条件:在全扫获得一级谱图的同时进行数据相关采集模式(IDA)获得二级谱图。质谱扫描范围m/z 50~1000，质量偏差为50 mDa。正离子模式下离子源雾化气Gas1和辅助气Gas2都为344.75 Pa，气帘气Curtain Gas为241.33 Pa，温度为500℃，喷雾电压(Ion spray voltage floating，ISVF)为5500 V。去簇电压(Declustering potential，DP)为80 V，碰撞能(Collision energy，CE)为30 eV。负离子模式下离子源雾化气Gas1和辅助气Gas2都为379.23 Pa，气帘气为241.33 Pa，温度为600℃，喷雾电压ISVF为-4500 V。去簇电压DP为-100 V，碰撞能CE为-30 eV。

  2.5   数据处理

  原始数据经Markerview软件(美国AB SCIEX公司)进行特征峰识别与峰匹配。得到的代谢物特征用80%规则处理去除零值^[10]，并用QC校正其强度^[11]。非参数检验、二元逻辑回归分析以及Receiver Operating Characteristic(ROC)曲线由SPSS 20.0(美国SPSS公司)获得。差异物质通过精确质量数、二级质谱信息、保留时间等结合METLIN (http://metlin.scripps.edu/)、The human metabolite database (HMDB，http://www.hmdb.ca/)等数据库进行结构鉴定。差异代谢物热图由MultiExperiment viewer 4.9.0获得。

  3.   结果与讨论

  3.1   色谱柱的选择

  考察氨基酸、有机酸、脂肪酸、胺类、糖类、核苷、核苷酸等共69个常见极性代谢物标样在4根色谱柱(ZIC-HILIC、BEH HILIC、BEH Amide、Discovery HS F5-3)上的分离检测情况，筛选一种合适的色谱柱分析系统，结果见图 1A和1B。由特征峰提取数目可知，ZIC HILIC柱最多，正离子可检出47个代谢物，负离子可检出56个代谢物，正负离子共有64个代谢物可以被检测。其次为五氟苯基柱，正负离子共可检测59个代谢物。由峰响应值可知，ZIC HILIC柱最高，其次为BEH HILIC柱。五氟苯基柱提高了极性代谢物的保留，已有研究用五氟苯基柱进行极性代物的代谢组学分析^[12]，然而其是反相色谱柱，极性代谢物基本集中于前5 min出峰，离子抑制较为严重，影响峰强度，得到的总峰面积远小于ZIC HILIC柱。一些极性代谢物，如N-乙酰酪氨酸、鸟嘌呤、马尿酸等在BEH HILIC上有很好的响应，得到较大的总峰面积(图 1A和1B)，但由于柱内填料对水敏感，影响部分特征峰的峰形。因此，综合峰提取个数和峰响应强度，最终选择ZIC-HILIC柱。ZIC-HILIC柱对标样中大部分氨基酸、有机酸、磷酸糖类和核苷类物质都具有较好的分离选择性，且都能得到较对称的色谱峰。

  图 1

  

  图 1.  标样、血样在不同色谱柱分析下的峰检出数目和总响应比较。A、B代谢物标样; C、D血清样本。A、C正离子模式; B、D负离子模式。PFP:五氟苯基柱

  Figure 1.  Comparison of total peak number and peak area of mixture of 69 standards and serum detected by 4 candidate chromatographic column. A, B for mixture of 69 standards; C, D for serum. A, C for positive mode; B, D for negative mode. PFP: pentafluorophenyl column

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  此外，考察了4根色谱柱用于血样的分析效果，分析结果见图 1C和1D。无论是正离子还是负离子模式下，ZIC-HILIC柱峰匹配得到的特征峰总响应均高于其它柱，特征峰总数目也较多。

  综合上述实验结果，选择ZIC-HILIC柱作为下一步代谢组学研究的分析柱。

  3.2   色谱条件的优化

  增大缓冲盐浓度可改善峰形、提高色谱峰的分离度，但盐浓度过大会影响代谢物在质谱上的离子化效率，从而降低检测灵敏度，同时造成离子源的污染，导致检测结果重复性差^[10]。首先对盐浓度进行了优化，分别选择含5、10和15 mmol/L乙酸铵缓冲盐的溶液，69个标样在不同盐浓度流动相条件下的出峰结果见附图 1A和1B。实验表明，69个标样在乙酸铵盐浓度为10 mmol/L时检出峰数目最多，并且总峰面积也较高。非靶向代谢组学的目的是通过色谱分离得到尽可能多的代谢物信息，同时选择检测到的化合物有较高质谱响应的条件进行液相色谱分离^[10]。综合考虑以上两方面因素，流动相中乙酸铵浓度选择10 mmol/L。血清在不同盐浓度流动相下的出峰结果见附图 1C和1D(见电子版文后支持信息)。

  然后对流动相的pH值进行了优化。在含10 mmol/L乙酸铵的流动相中分别考察不加乙酸以及加入0.02%、0.06%、0.12% (V/V)乙酸(对应pH值分别为6.8、5.0、4.5、4.0)对代谢物标样和血样的分离。正离子模式下，随着pH值增加，标准品的检出峰数目增大; 负离子模式下，pH=5.0时检出的代谢物最多，并且含磷酸基团的物质(如核苷酸等)在较高pH值时，峰形对称性较好。无论在正离子还是负离子模式下，pH=5.0时总峰面积也最高。因此，选择pH =5.0的流动相条件进行分析。

  3.3   方法考察

  选择50个可以利用的代谢物标样按优化的色谱方法进行分析，考察方法的线性范围与检出限，结果见表 2。60%代谢物的线性范围为4~5个数量级，其余40%代谢物的线性范围为3个数量级，且78%代谢物的线性相关系数(r)>0.99，50个代谢物的检出限均在ng/mL数量级以下。表明本方法线性良好，灵敏度高。

  表 2

  

  表 2  50个代表极性物质的线性回归方程、相关系数、线性范围和检出限

  Table 2.  Linear regression equations, correlation coefficients (r), linear ranges and the lowest limits of detection (LLOD) of 50 representative compounds

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  序号 No	化合物 Compound	线性回归方程 Regression equation	相关系数 (r)	线性范围 Linear range (μg/mL)	检出限 LOD (ng/mL)	检测模式 Detection mode	内标 Internal standard
  1	黄嘌呤 Xanthine	y=0.0711x+0.0107	0.9953	0.005~10	0.0117	[M+H]+	CDCA-d4
  2	二磷酸腺苷 ADP	y=0.0267x－0.0391	0.9851	0.025~50	0.0003	[M+H]+	CDCA-d4
  3	瓜氨酸 Citrulline	y=0.3248x－0.0136	0.9978	0.005~100	0.0093	[M+H]+	Val-1-13C
  4	胱氨酸 Cystine	y=0.3358x+0.0541	0.9839	0.025~25	0.0073	[M+H]+	Val-1-13C
  5	蛋氨酸 Methionine	y=0.1135x+0.0011	0.9996	0.01~10	0.2727	[M+H]+	Val-1-13C
  6	谷氨酸 Glutamic acid	y=0.0982x－0.0272	0.9965	0.01~25	0.1429	[M+H]+	Val-1-13C
  7	色氨酸 Tryptophan	y=0.2271x+0.0141	0.9996	0.05~10	0.1000	[M+H]+	Val-1-13C
  8	异亮氨酸 Isoleucine	y=0.1064x+0.0375	0.9949	0.05~10	0.0714	[M+H]+	Val-1-13C
  9	次黄嘌呤 Hypoxanthine	y=1.4066x－0.0371	0.9992	0.005~25	0.0008	[M+H]+	CDCA-d4
  10	甘磷酸胆碱 GPC	y=0.9972x+3.8458	0.9825	0.005~100	0.0040	[M+H]+	Val-1-13C
  11	庚胺 Heptylamine	y=8.5723x+4.8012	0.9934	0.005~25	0.0006	[M+H]+	Val-1-13C
  12	黄苷 Xanthosine	y=0.1881x－0.3256	0.9945	0.1~100	0.1364	[M+H]+	Val-1-13C
  13	肌苷 Inosine	y=0.1066x－0.0002	0.9977	0.001~10	0.0326	[M+H]+	CDCA-d4
  14	马尿酸 Hippuric acid	y=0.0091x+0.0003	0.9973	0.005~10	0.0103	[M+H]+	CDCA-d4
  15	鸟苷 Vernine	y=1.3579x+0.5996	0.9825	0.005~25	0.0163	[M+H]+	Val-1-13C
  16	尿嘧啶 Uracil	y=0.0193x－0.0067	0.9833	0.005~100	0.0046	[M+H]+	CDCA-d4
  17	乳糖酸 Lactobionic acid	y=0.1655x－0.0969	0.9965	0.005~50	0.3333	[M+H]+	Val-1-13C
  18	烟酸 Nicotinic acid	y=0.4513x+0.0449	0.9909	0.005~10	0.0106	[M+H]+	CDCA-d4
  19	吲哚-3-丙酸 3-Indolepropionic acid	y=0.0531x+0.0308	0.9931	0.025~25	0.0236	[M+H]+	Val-1-13C
  20	正己胺 n-hexylamine	y=1.4844x+1.3081	0.9915	0.005~100	0.0016	[M+H]+	Val-1-13C
  21	脱氧胞苷 Deoxycytidine	y=0.0155x+0.0034	0.9895	0.005~10	0.0160	[M－H]-	CA-d4
  22	十六碳三稀酸 Hexadecatrienoic acid	y=0.1580x－0.0813	0.9972	0.01~10	0.0026	[M－H]-	FFA C16:0-d3
  23	花生四烯酸 Arachidonic acid	y=0.0293x+0.0175	0.9964	0.025~100	0.0018	[M－H]-	CDCA-d4
  24	二十碳二烯酸 Eicosadienoic acid	y=0.2673x+0.2070	0.9954	0.005~100	0.0018	[M－H]-	CDCA-d4
  25	十二碳烯酸 Dodecenoic acid	y=0.1494x－0.0045	0.9954	0.05~100	0.0032	[M－H]-	CDCA-d4
  26	丝氨酸 Serine	y=0.0068x+0.0057	0.9966	0.025~50	0.0107	[M－H]-	Trp-d5
  27	苏氨酸 Threonin	y=0.0052x－0.0009	0.9927	0.001~50	0.0294	[M－H]-	leu-d3
  28	脱氧胸苷酸 dTMP	y=0.0951x+0.0681	0.9958	0.05~50	0.0033	[M－H]-	Trp-d5
  29	谷氨酰胺 Glutamine	y=0.0217x+0.0303	0.9954	0.025~100	0.0769	[M－H]-	Trp-d5
  30	酪氨酸 Tyrosine	y=0.1452x+0.0273	0.9997	0.01~100	0.0446	[M－H]-	Val-1-13C
  31	鸟氨酸 Ornithine	y=0.0635x+0.0213	0.9988	0.01~25	0.0155	[M－H]-	Val-1-13C
  32	羟脯氨酸 Homoproline	y=0.0623x－0.0195	0.9990	0.005~100	0.0429	[M－H]-	Val-1-13C
  33	天冬氨酸 Aspartic acid	y=0.0238x+0.0032	0.9887	0.001~50	0.0115	[M－H]-	Trp-d5
  34	N-乙酰亮氨酸 N-acetylleucine	y=0.4759x+2.2674	0.9818	0.01~100	0.0008	[M－H]-	leu-d3
  35	N-乙酰天冬氨酸 N-acetylaspartic acid	y=0.2655x+0.0226	0.9862	0.005~5	0.0094	[M－H]-	Trp-d5
  36	α-羟基异丁酸 α-Hydroxyisobutyrate	y=0.0168x－0.0013	0.9970	0.01~10	0.0066	[M－H]-	CA-d4
  37	乳糖 β-lactose	y=0.0014x+0.0025	0.9914	0.05~100	0.0309	[M－H]-	FFAC16:0-d3
  38	阿拉伯糖醇 Arabitol	y=0.0032x－0.0033	0.9935	0.025~100	0.2500	[M－H]-	CDCA-d4
  39	胞嘧啶 Cytosine	y=0.0038x－0.0034	0.9911	0.005~100	0.0375	[M－H]-	FFA C16:0-d3
  40	富马酸 Fumaric acid	y=0.0397x－0.0023	09989	0.05~10	0.0041	[M－H]-	Trp-d5
  41	肌醇 Inositol	y=0.0337x－0.0004	0.9945	0.01~100	0.2308	[M－H]-	Val-1-13C
  42	肌酸 Creatine	y=0.0454x+0.0036	0.9851	0.005~5	0.0411	[M－H]-	Trp-d5
  43	焦谷氨酸 Pyroglutamic acid	y=0.0315x+0.0031	0.9952	0.01~50	0.0092	[M－H]-	leu-d3
  44	精氨酸 Arginine	y=0.0478x－0.0305	0.9984	0.01~100	0.0278	[M－H]-	Val-1-13C
  45	麦芽三塘 Maltotriose	y=0.0232x+0.0158	0.9981	0.005~100	0.0326	[M－H]-	Val-1-13C
  46	鸟嘌呤 Guanine	y=0.0324x+0.0006	0.9974	0.025~10	0.0059	[M－H]-	CA-d4
  47	尿苷 Uridine	y=0.1550x+0.1757	0.9857	0.005~50	0.0073	[M－H]-	CDCA-d4
  48	脯氨酸 Proline	y=0.0107x+0.0153	0.9907	0.01~100	0.1667	[M－H]-	Trp-d5
  49	乳清酸 Orotic acid	y=0.0102x+0.0008	0.9971	0.01~10	0.0263	[M－H]-	CA-d4
  50	缬氨酸 Valine	y=0.0512x+0.1020	0.9929	0.25~100	0.0214	[M－H]-	Val-1-13C

  考察了本方法用于实际血清分析的日内和日间精密度。使用Markerview软件对采集到的血清代谢谱信息进行峰匹配，正、负离子模式下分别识别出2816和4446个离子信息。QC样品连续进样分析6次，测试日内精密度。正离子模式下56%代谢物峰面积RSD为5%~15%。累计约85%以上代谢物峰面积的RSD值小于30%，且其峰面积的累积响应值占全部代谢物总面积的95%以上，结果见图 2A。负离子模式下约43%代谢物峰面积的RSD < 5%，36%代谢物峰面积RSD为5%~15%。累计约90%以上代谢物峰面积的RSD值小于30%，且其峰面积的累积响应值占全部代谢物总面积的95%以上，结果见图 2B。日间精密度测试中QC样品连续3天进样分析，每天重复分析4次，峰面积RSD < 30%的代谢物占全部代谢物的85%以上，其峰面积的累积响应值占总代谢物峰面积的85%以上，结果见图 2C和2D。

  图 2

  

  图 2.  日内精密度(A、B)和日间精密度(C、D)考察。A、C正离子模式; B、D负离子模式。a: RSD≤5%; b: 5% < RSD≤15%; c: 15% < RSD≤30%; d: 30% < RSD≤50%; e: RSD＞50%

  Figure 2.  Intra-and inter-day precision of the method. A, C for positive mode; B, D for negative mode. a: RSD≤5%; b: 5% < RSD≤15%; c: 15% < RSD≤30%; d: 30% < RSD≤50%; e: RSD > 50%

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  3.4   方法应用

  采用本研究建立的亲水作用色谱/质谱联用的非靶向代谢组学分析方法, 分别在正离子、负离子模式下, 对64例膀胱癌患者和32例正常对照组血清进行分析。数据经QC校正及80%规则去零值后进行非参数检验，p < 0.05表示该代谢物在膀胱癌患者和正常人血清中含量有显著性差异。利用保留时间、精确质量数以及二级质谱的断裂方式进行数据库查询，对这些差异变量进行结构鉴定。再将候选化合物的色谱-质谱信息与标准样品的色谱-质谱信息进行比对确认。最终在正、负离子模式下共鉴定出35种差异代谢物(见电子版文后支持信息附表 2)，这些差异化合物可视化变化结果显示在热图中(图 3)。从图 3可见，相对于正常人，膀胱癌患者中组氨酸、亮氨酸、水杨酸、鹅去氧胆酸、部分游离脂肪酸等含量下调; 而胱氨酸、色氨酸、苹果酸、甘磷酸胆碱(Glycerophosphorylcholine，GPC)、肌醇、黄苷等含量上调。

  图 3

  

  图 3.  膀胱癌患者与正常人血清差异代谢物的热图

  Figure 3.  A heat map of the significantly different metabolites between bladder cancer group and normal control group

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  为了对甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸、鹅去氧胆酸这些膀胱癌的潜在联合标志物进行验证，采用另一批样本进行分析。32例膀胱癌患者血清和17例正常人血清，用同样的采集方法、仪器分析方法和数据处理方法进行研究，发现相对于正常组中，甘磷酸胆碱、胱氨酸、二十烯酸的含量在膀胱癌组中显著上调，而十二碳烯酸和鹅去氧胆酸的含量在膀胱癌组中有显著性下调。在之前的分析批次样本中，相对于在正常组，甘磷酸胆碱、胱氨酸、二十烯酸的含量在膀胱癌组中也都显著上调，十二碳烯酸和鹅去氧胆酸的含量在膀胱癌组中显著下调。在这点上两批次的结果是吻合的(图 5)。甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸和鹅去氧胆酸运用二元逻辑回归的方法联合成为一个标志物，用ROC曲线评价其效果得到的AUC为0.888，表明其灵敏度和特异性均令人满意，见图 4B。验证结果表明，甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸和鹅去氧胆酸，可以作为膀胱癌的联合潜在标志物。

  图 4

  

  图 4.  5种差异代谢物联合使用的ROC曲线。A为发现集，B为验证集

  Figure 4.  Receiving operator characteristic (ROC) curves of combination of five differential metabolites, choline GlycerophosphateCholine (GPC), cysteine, dodecenoic acid, eicosenoic acid and chenodeoxycholic acid in the discovery set (A) and validation set (B)

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  图 5

  

  图 5.  5种差异代谢物在发现集和验证集中含量的箱图。A:鹅去氧胆酸; B:二十碳烯酸; C:甘磷酸胆碱GPC; D:十二碳烯酸; E:胱氨酸。每组图中左侧为发现集，右侧为验证集。NC表示对照组，BC表示膀胱癌组

  Figure 5.  Box plots of selected serum biomarkers both in discovery (left) and validation set (right). A:chenodeoxycholic acid; B: eicosenoic acid; C:GPC; D: dodecenoic acid; E:cystine. NC: normal control group; BC: bladder cancer group

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  采用本研究建立的亲水作用色谱/质谱联用方法可以检测出许多在反相柱上弱保留的极性代谢物，如亮氨酸、胱氨酸、组氨酸等氨基酸、苹果酸等有机酸、黄苷等核苷以及肌醇、己六醇等醇类。本研究结果表明，在膀胱癌组中胱氨酸含量上调。胱氨酸具有促进细胞氧化还原的功能，与细胞能量代谢密切相关。对胱氨酸在其它癌症细胞中的代谢功能的研究表明，三阴性乳腺癌对胱氨酸上瘾，在缺少胱氨酸这种关键的营养成分后癌细胞会快速死亡^[13]。鹅去氧胆酸是一种具有杀菌、抗炎作用的胆汁酸，不仅参与机体脂质的乳化吸收和运输，还通过多种细胞膜、胞内蛋白共同作用所介导的信号事件在机体的糖代谢、脂代谢以及能量代谢中起着重要的调节作用^[14]。胆汁酸代谢紊乱与癌症的发生息息相关，近年来, 胆汁酸特别是脱氧胆酸被认为是胃肠道的致癌因子，通过改变细胞内信号系统及基因表达从而破坏细胞增生、分化、凋亡的正常平衡而致癌^[15]。除此之外，本研究还测得在膀胱癌和正常组中游离脂肪酸、溶血卵磷脂、胆碱含量存在显著性差异，表明在膀胱癌患者体内存在脂类代谢紊乱。癌细胞需要大量的脂类用以增殖、生长、能量和氧化还原平衡以及侵入，所以它们保持着活跃的内源性脂类合成^[16]。十二碳烯酸和二十碳烯酸均为游离不饱和脂肪酸，前者在膀胱癌患者血清中含量下调，后者上调。游离脂肪酸是人体内的储能物质，临床上很多疾病的发生发展与血清中游离脂肪酸的浓度异常密切相关^[17]，本课题组前期的相关研究表明，与脂肪酸生物合成相关的11-二十烯酸、神经酸含量在患病组中发生显著性变化^[6]，这与本研究的结果一致。相对于正常组，膀胱癌组血清中溶血卵磷脂的含量下调。溶血卵磷脂(Lysophosphatidylcholine，LPC)是磷脂酰胆碱的衍生物，是细胞膜基本组成之一，它对由疾病等病理因素引起的刺激有促炎症功能的生物活性，可作为许多癌症的生物标志物，如卵巢癌^[18]、直肠癌^[19]等。

  4.   结论

  代谢组学在发现癌症标志物方面具有巨大的潜力。本研究发展了一种两性离子亲水作用色谱/质谱联用技术并对其流动相盐浓度、pH值进行优化。本方法可以检测到氨基酸、有机酸、核苷酸、磷酸糖等各种极性物质，具有较宽的线性范围，日内、日间精密度及重现性良好。运用本方法对膀胱癌患者和正常人血清进行非靶向代谢组学分析，扩展了其差异代谢物的范围，发现35种代谢物在患病组和正常组中存在显著差异，包括溶血磷脂酰胆碱、游离脂肪酸、氨基酸、胆汁酸、有机酸、核苷等。经过筛选及验证，选择甘磷酸胆碱、胱氨酸、十二碳烯酸、二十碳烯酸和鹅去氧胆酸联合使用作为区分膀胱癌和正常的潜在标志物，它们在膀胱癌的早期诊断中有一定的应用前景。本方法不仅可用于膀胱癌患者血清代谢组分析，而且对其它样本内极性物质的分离分析也有潜在的应用价值。

  
  
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• 

  图 1  标样、血样在不同色谱柱分析下的峰检出数目和总响应比较。A、B代谢物标样; C、D血清样本。A、C正离子模式; B、D负离子模式。PFP:五氟苯基柱

  Figure 1  Comparison of total peak number and peak area of mixture of 69 standards and serum detected by 4 candidate chromatographic column. A, B for mixture of 69 standards; C, D for serum. A, C for positive mode; B, D for negative mode. PFP: pentafluorophenyl column

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  图 2  日内精密度(A、B)和日间精密度(C、D)考察。A、C正离子模式; B、D负离子模式。a: RSD≤5%; b: 5% < RSD≤15%; c: 15% < RSD≤30%; d: 30% < RSD≤50%; e: RSD＞50%

  Figure 2  Intra-and inter-day precision of the method. A, C for positive mode; B, D for negative mode. a: RSD≤5%; b: 5% < RSD≤15%; c: 15% < RSD≤30%; d: 30% < RSD≤50%; e: RSD > 50%

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  图 3  膀胱癌患者与正常人血清差异代谢物的热图

  Figure 3  A heat map of the significantly different metabolites between bladder cancer group and normal control group

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  图 4  5种差异代谢物联合使用的ROC曲线。A为发现集，B为验证集

  Figure 4  Receiving operator characteristic (ROC) curves of combination of five differential metabolites, choline GlycerophosphateCholine (GPC), cysteine, dodecenoic acid, eicosenoic acid and chenodeoxycholic acid in the discovery set (A) and validation set (B)

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  图 5  5种差异代谢物在发现集和验证集中含量的箱图。A:鹅去氧胆酸; B:二十碳烯酸; C:甘磷酸胆碱GPC; D:十二碳烯酸; E:胱氨酸。每组图中左侧为发现集，右侧为验证集。NC表示对照组，BC表示膀胱癌组

  Figure 5  Box plots of selected serum biomarkers both in discovery (left) and validation set (right). A:chenodeoxycholic acid; B: eicosenoic acid; C:GPC; D: dodecenoic acid; E:cystine. NC: normal control group; BC: bladder cancer group

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  表 1  样本统计信息

  Table 1.  Basic information of the enrolled subjects of bladder cancer (BC) patient and normal control

  样本特征 Characteristics	发现集 Discovery set			验证集 Validation set
  	膀胱癌患者 BC patients	健康对照 Normal controls		膀胱癌患者 BC patients	健康对照 Normal controls
  样本数目 No. of subjects	64	32		32	17
  年龄(平均值，范围) Age(Average, range)	64，28~84	66，57~83		70，29~92	65，48~80
  男性/女性 Male/female	50/14	21/11		26/6	11/6

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  表 2  50个代表极性物质的线性回归方程、相关系数、线性范围和检出限

  Table 2.  Linear regression equations, correlation coefficients (r), linear ranges and the lowest limits of detection (LLOD) of 50 representative compounds

  序号 No	化合物 Compound	线性回归方程 Regression equation	相关系数 (r)	线性范围 Linear range (μg/mL)	检出限 LOD (ng/mL)	检测模式 Detection mode	内标 Internal standard
  1	黄嘌呤 Xanthine	y=0.0711x+0.0107	0.9953	0.005~10	0.0117	[M+H]+	CDCA-d4
  2	二磷酸腺苷 ADP	y=0.0267x－0.0391	0.9851	0.025~50	0.0003	[M+H]+	CDCA-d4
  3	瓜氨酸 Citrulline	y=0.3248x－0.0136	0.9978	0.005~100	0.0093	[M+H]+	Val-1-13C
  4	胱氨酸 Cystine	y=0.3358x+0.0541	0.9839	0.025~25	0.0073	[M+H]+	Val-1-13C
  5	蛋氨酸 Methionine	y=0.1135x+0.0011	0.9996	0.01~10	0.2727	[M+H]+	Val-1-13C
  6	谷氨酸 Glutamic acid	y=0.0982x－0.0272	0.9965	0.01~25	0.1429	[M+H]+	Val-1-13C
  7	色氨酸 Tryptophan	y=0.2271x+0.0141	0.9996	0.05~10	0.1000	[M+H]+	Val-1-13C
  8	异亮氨酸 Isoleucine	y=0.1064x+0.0375	0.9949	0.05~10	0.0714	[M+H]+	Val-1-13C
  9	次黄嘌呤 Hypoxanthine	y=1.4066x－0.0371	0.9992	0.005~25	0.0008	[M+H]+	CDCA-d4
  10	甘磷酸胆碱 GPC	y=0.9972x+3.8458	0.9825	0.005~100	0.0040	[M+H]+	Val-1-13C
  11	庚胺 Heptylamine	y=8.5723x+4.8012	0.9934	0.005~25	0.0006	[M+H]+	Val-1-13C
  12	黄苷 Xanthosine	y=0.1881x－0.3256	0.9945	0.1~100	0.1364	[M+H]+	Val-1-13C
  13	肌苷 Inosine	y=0.1066x－0.0002	0.9977	0.001~10	0.0326	[M+H]+	CDCA-d4
  14	马尿酸 Hippuric acid	y=0.0091x+0.0003	0.9973	0.005~10	0.0103	[M+H]+	CDCA-d4
  15	鸟苷 Vernine	y=1.3579x+0.5996	0.9825	0.005~25	0.0163	[M+H]+	Val-1-13C
  16	尿嘧啶 Uracil	y=0.0193x－0.0067	0.9833	0.005~100	0.0046	[M+H]+	CDCA-d4
  17	乳糖酸 Lactobionic acid	y=0.1655x－0.0969	0.9965	0.005~50	0.3333	[M+H]+	Val-1-13C
  18	烟酸 Nicotinic acid	y=0.4513x+0.0449	0.9909	0.005~10	0.0106	[M+H]+	CDCA-d4
  19	吲哚-3-丙酸 3-Indolepropionic acid	y=0.0531x+0.0308	0.9931	0.025~25	0.0236	[M+H]+	Val-1-13C
  20	正己胺 n-hexylamine	y=1.4844x+1.3081	0.9915	0.005~100	0.0016	[M+H]+	Val-1-13C
  21	脱氧胞苷 Deoxycytidine	y=0.0155x+0.0034	0.9895	0.005~10	0.0160	[M－H]-	CA-d4
  22	十六碳三稀酸 Hexadecatrienoic acid	y=0.1580x－0.0813	0.9972	0.01~10	0.0026	[M－H]-	FFA C16:0-d3
  23	花生四烯酸 Arachidonic acid	y=0.0293x+0.0175	0.9964	0.025~100	0.0018	[M－H]-	CDCA-d4
  24	二十碳二烯酸 Eicosadienoic acid	y=0.2673x+0.2070	0.9954	0.005~100	0.0018	[M－H]-	CDCA-d4
  25	十二碳烯酸 Dodecenoic acid	y=0.1494x－0.0045	0.9954	0.05~100	0.0032	[M－H]-	CDCA-d4
  26	丝氨酸 Serine	y=0.0068x+0.0057	0.9966	0.025~50	0.0107	[M－H]-	Trp-d5
  27	苏氨酸 Threonin	y=0.0052x－0.0009	0.9927	0.001~50	0.0294	[M－H]-	leu-d3
  28	脱氧胸苷酸 dTMP	y=0.0951x+0.0681	0.9958	0.05~50	0.0033	[M－H]-	Trp-d5
  29	谷氨酰胺 Glutamine	y=0.0217x+0.0303	0.9954	0.025~100	0.0769	[M－H]-	Trp-d5
  30	酪氨酸 Tyrosine	y=0.1452x+0.0273	0.9997	0.01~100	0.0446	[M－H]-	Val-1-13C
  31	鸟氨酸 Ornithine	y=0.0635x+0.0213	0.9988	0.01~25	0.0155	[M－H]-	Val-1-13C
  32	羟脯氨酸 Homoproline	y=0.0623x－0.0195	0.9990	0.005~100	0.0429	[M－H]-	Val-1-13C
  33	天冬氨酸 Aspartic acid	y=0.0238x+0.0032	0.9887	0.001~50	0.0115	[M－H]-	Trp-d5
  34	N-乙酰亮氨酸 N-acetylleucine	y=0.4759x+2.2674	0.9818	0.01~100	0.0008	[M－H]-	leu-d3
  35	N-乙酰天冬氨酸 N-acetylaspartic acid	y=0.2655x+0.0226	0.9862	0.005~5	0.0094	[M－H]-	Trp-d5
  36	α-羟基异丁酸 α-Hydroxyisobutyrate	y=0.0168x－0.0013	0.9970	0.01~10	0.0066	[M－H]-	CA-d4
  37	乳糖 β-lactose	y=0.0014x+0.0025	0.9914	0.05~100	0.0309	[M－H]-	FFAC16:0-d3
  38	阿拉伯糖醇 Arabitol	y=0.0032x－0.0033	0.9935	0.025~100	0.2500	[M－H]-	CDCA-d4
  39	胞嘧啶 Cytosine	y=0.0038x－0.0034	0.9911	0.005~100	0.0375	[M－H]-	FFA C16:0-d3
  40	富马酸 Fumaric acid	y=0.0397x－0.0023	09989	0.05~10	0.0041	[M－H]-	Trp-d5
  41	肌醇 Inositol	y=0.0337x－0.0004	0.9945	0.01~100	0.2308	[M－H]-	Val-1-13C
  42	肌酸 Creatine	y=0.0454x+0.0036	0.9851	0.005~5	0.0411	[M－H]-	Trp-d5
  43	焦谷氨酸 Pyroglutamic acid	y=0.0315x+0.0031	0.9952	0.01~50	0.0092	[M－H]-	leu-d3
  44	精氨酸 Arginine	y=0.0478x－0.0305	0.9984	0.01~100	0.0278	[M－H]-	Val-1-13C
  45	麦芽三塘 Maltotriose	y=0.0232x+0.0158	0.9981	0.005~100	0.0326	[M－H]-	Val-1-13C
  46	鸟嘌呤 Guanine	y=0.0324x+0.0006	0.9974	0.025~10	0.0059	[M－H]-	CA-d4
  47	尿苷 Uridine	y=0.1550x+0.1757	0.9857	0.005~50	0.0073	[M－H]-	CDCA-d4
  48	脯氨酸 Proline	y=0.0107x+0.0153	0.9907	0.01~100	0.1667	[M－H]-	Trp-d5
  49	乳清酸 Orotic acid	y=0.0102x+0.0008	0.9971	0.01~10	0.0263	[M－H]-	CA-d4
  50	缬氨酸 Valine	y=0.0512x+0.1020	0.9929	0.25~100	0.0214	[M－H]-	Val-1-13C

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