核酸适配体在多肽研究中的应用

引用本文: 覃诗雅, 陈南迪, 王青, 黄晋, 何晓晓, 刘剑波, 郭秋平, 羊小海, 王柯敏. 核酸适配体在多肽研究中的应用[J]. 分析化学, 2017, 45(12): 1795-1803. doi: 10.11895/j.issn.0253-3820.170272 shu

Citation: QIN Shi-Ya, CHEN Nan-Di, WANG Qing, HUANG Jin, HE Xiao-Xiao, LIU Jian-Bo, GUO Qiu-Ping, YANG Xiao-Hai, WANG Ke-Min. Application of Nucleic Acid Aptamers in Polypeptides Researches[J]. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2017, 45(12): 1795-1803. doi: 10.11895/j.issn.0253-3820.170272 shu

核酸适配体在多肽研究中的应用

湖南大学化学生物传感与计量学国家重点实验室, 化学化工学院, 生物纳米与分子工程湖南省重点实验室, 湖南 410082

通讯作者: 羊小海, E-mail:yangxiaohai@hnu.edu.cn; 王柯敏, E-mail:kmwang@hnu.edu.cn

基金项目:

本文系国家自然科学基金项目（Nos.21675047，21375034，21190040，21521063）资助

摘要: 多肽在生命体的生理过程中发挥着重要作用，其生理功能一直是生物学、药理学和医学等领域的重要研究内容。核酸适配体是经体外筛选获得的单链DNA或RNA，能与靶标高亲和力、高特异性地结合，有"化学抗体"或"化学家的抗体"之称。以多肽为靶标筛选获得的核酸适配体主要有两大用途：一是基于其识别功能，作为亲和试剂来建立分析检测方法或开展生物成像研究；二是基于它们的生物学活性，作为拮抗剂在活体水平影响靶标多肽的正常功能，阻碍下游信号通路，从而对疾病进行治疗。本文总结了近年来以多肽为靶标筛选的核酸适配体在体内及体外的用途，并探讨了其在筛选、表征及应用中存在的问题，并对其未来的发展趋势进行了展望。

关键词:

English

Application of Nucleic Acid Aptamers in Polypeptides Researches

State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics, College of Chemistry and Chemical Engineering, Key Laboratory for Bio-Nanotechnology and Molecular Engineering of Hunan Province, Hunan University, Changsha 410082, China

Corresponding author: YANG Xiao-Hai, yangxiaohai@hnu.edu.cn; WANG Ke-Min, kmwang@hnu.edu.cn

Received Date: 02 May 2017
Accepted Date: 03 September 2017
Available Online: 20 December 2017
Fund Project:

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 21675047, 21375034, 21190040, 21521063)

Abstract: Polypeptides play a vital role in physiological processes of life. The pharmacological and medical value of polypeptides has attracted the attention of researchers in recent years. Aptamers are short, single stranded DNA or RNA which developed by an in vitro process called systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX). Aptamers can bind targets with high affinity and specificity. Hence, aptamer is also called "chemical antibody" or "chemist's antibody". To date, there are two main application aspects for polypeptides-targeted aptamers. First, aptamer can be used as specific affinitive elements based on their ability of recognition, which would be applied to polypeptides detection or imaging. The other one is that aptamer can also be used as antagonists based on their ability of inhibiting, which can restrict the activity of polypeptides and block the downstream signaling pathways in vivo, thus can be used to treat the disease associated with polypeptides. In this review, we summarize the numbers of polypeptides-targeted aptamers and the related applications in vitro and in vivo. Current issues and development trends throughout the screening, characterizing and applying of polypeptides-targeted aptamers are also discussed.

Key words:

1. 引言

多肽是由氨基酸通过肽键聚合而成的生物分子。在人体中，多肽常作为神经递质、神经调节因子或激素参与细胞间信号传导，对维持正常生理功能起着关键作用^[1~3]。此外，一些多肽还与人体内各器官的功能密切相关，可作为生物标志物进行疾病诊断及病情监测^{[4, 5]}。随着对多肽作用模式了解的日益加深，人们对其在药理和医学上的应用产生了愈加浓厚的兴趣。然而，由于多肽的分子量一般较小，难以提供足够的免疫原性位点来产生不同抗原表位的抗体^[6]。因此，与蛋白质相比，在利用抗体建立多肽的分析检测方法时受到了一些限制。此外，抗体的免疫原性较强，将抗体作为拮抗剂用于多肽相关的免疫治疗易产生过敏反应，影响治疗效果^[7]。鉴于目前多肽研究面临的这些问题，亟需开发新的分子工具用于多肽的检测及其生物学功能的研究。

2. 多肽相关的核酸适配体

核酸适配体(Aptamer)是通过指数富集的配基系统进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)筛选到的单链脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)^{[8, 9]}。核酸适配体可折叠成特定的三级结构，通过氢键、静电作用、π-π堆积等作用力，与靶标高亲和力、高特异性地结合^[10]。这些靶标包括离子^{[11, 12]}、小分子^{[13, 14]}、肽^{[15, 16]}、蛋白质^[17~20]、病毒^[21]、细胞^[22~24]甚至组织^[25]。与抗体相比，核酸适配体具有多种优势，如：(1)由体外筛选获得，对于免疫原性低的靶标也能获得对应的核酸适配体；(2)可人工合成，性质稳定，便于储存和运输；(3)易于修饰，便于功能化；(4)分子量小，组织穿透力强等^[26]。目前，核酸适配体已发展成为新型分子工具，并应用于分析检测、疾病诊断、生物成像、靶向载药、新药研发等多个领域^[27~29]。表 1列出了文献报道的一些多肽的核酸适配体的序列及应用。

表 1

表 1 一些以多肽为靶标的核酸适配体

Table 1. Some polypeptides-targeted nucleic acid aptamers

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目标物(按类别) Category of target	核酸适配体的序列(由5′端到3′端) Sequence of aptamer (from 5′ to 3′)	应用 Application	文献 Ref.
Hormone
Insulin	IGA3: GGT GGT GGG GGG GGT GGT AGG GTG TCT TCT	B	[30]
glucagon	NOX-G15: L-GCG GGA AAT GGG AGG GCT AGG AAG GAA TCT GAG CGC	A	[31]
IGF-Ⅰ	IGF1-3F: ATA CGG GAG CCA ACA CCA GAT GCG AGG ACG GTG GGT GGG AGG GTG GAG GTC TCG AGA GCA GGT GTG ACG GAT	B	[32]
	IGF1-25R: ATC CGT CAC ACC TGC TCT GCA AGC ATT CAT ATT GGT TGG TGG AAG TGG GGG GGG TGG TGT TGG CTC CCG TAT	B	[32]
CGRP	STAR-F12: L-GGA CUG AUG GCG CGG UCC UAU UAC GCC GAA AGGGA GAG GGG AGA CAG G	A	[33]
BNP	8-12: TAA ACG CTC AAA GGA CAG AGG GTG CGT AGG AAG GGT ATT CGA CAG GAG GCT CAC A	B	[34]
	A10: GGC GAT TCG TGA TCT CTG CTC TCG GTT TCG CGT TCG TTC G	B	[35]
ProGRP_31－98	A18''': CCA GAT AGT CCC TGG	B	[36]
Ghrelin	NOX-B11: L-CGU GUG AGG CAA UAA AAC UUA AGU CCG AAG GUA ACC AAU CCU ACA CG	A	[37]
Amylin	NOX-A42: L-GGA CUG AUG GCG CGG UCC UAU UAC GCC GAU AGG GUG AGG GGA	A	[38]
Hepcidin	NOX-H94: L-GCG CCG UAU GGG AUU AAG UAA AUG AGG AGU UGG AGG AAG GGC GC	A	[39]
Vasopressin	L-TCA CGT GCA TGA TAG ACG GCG AAG CCG TCG AGT TGC TGT GTG CCG ATG CAC GTG A	A	[40]
	NOX-F37: L-GGG GUA GGG CUU GGA UGG GUA GUA CAC-PEG₁₈-GUG UGC GUG GU	A	[41]
GnRH	S42: L-GCG GCG GAG GGT GGG CTG GGG CTG GGC CGG GGG GCG TGC GTA AGC ACG TAG CCT CGC CGC	A	[42]
	NOX 1255: L-CCA AGC TTG CGT AAG CAG TCT CCT CTC AGG GGA GGT TGG GCG GTG CGT AAG CAC CGG TTT GCA GGG G	A, B	[43]
Neuropeptide
SubstanceP	B28: GGG AGC UCA GAA UAA ACG CUC AAC UUC CAA GGC AGU AAA CCC AAG GUC AAU AAU GAC CAA UGA GCC GCC GCU CCG GUA UCC GGC	——	[44]
	SUP-A-004: GGC GCA GGU GGG UAA AGG GGU GUG AUC GAG GGU CGA GAG GCG CC	A	[45]
β-Casomorphin-7	Seq6: ATA CGG GAG CCA ACA CCA AAG TAA GAT CAT CAC CCG GAC GCG GAC ATA ATA GGA GAG CAG GTG TGA CGG AT	B	[46]
Nociceptin	NOX 2149: L-GGA CCU CAC GAC CUC GUG AGA GGA GUU UUC UAA AGA ACU GGG GUA GUG CCA GUA GGG GUC C	A	[47]
NPY	DP3: CAG CAG GAG GGC CGG CGU UAG GGU UAG CGA GCC GAU UGA A	——	[48]
	Clone 4.31: AGC AGC ACA GAG GTC AGA TGC AAA CCA CAG CCT GAT GGT TAG CGT ATG TCA TTT ACG GAC CTA TGC GTG CTA CCG TGA A	——	[49]
Toxin
α-Bungarotoxin	Clone 24: GCG AGG TGT TCG AGA GTT AGG GGC GAC ATG ACC AAA CGT T	——	[50]
Others
Aβ40	β55: GGG AAU UCG AGC UCG GUA CCU UUA CGA AGG CCU GUC UUC GUU UGA CAG CGG CUU GUU GAC CCU CAC ACU UGU ACC UGC UGC CAA CUG CAG GCA UGC AAG CUU GG	I	[51]
	N2: UAG CGU AUG CCA CUC UCC UGG GAC CCC CCG CCG GAU GGC CAC AUC C	A, B	[52]
	T-SO508: GCC TGT GGT GTT GGG GCG GGT GCG	B	[53]
IGF-Ⅰ:胰岛素样生长因子-Ⅰ; CGRP:降钙素基因相关肽; BNP:脑钠肽; ProGRP_31-98:胃泌素释放肽前体(31-98); GnRH:促性腺激素释放素; NPY:神经肽Y; Aβ40: β-淀粉样肽(1-40); A:拮抗剂; B:生物传感; I:成像 IGF-Ⅰ: insulin-like growth factor-Ⅰ; CGRP: calcitonin gene-related peptide; BNP: brain natriuretic peptide; ProGRP_31-98: pro-gastrin-releasing peptide (31-98); GnRH: gonadotropin-releasing hormone; NPY: neuropeptide Y; Aβ40: amyloid beta (1-40); A: antagonist; B: biosensing; I: imaging.

3. 以多肽为靶标的核酸适配体的筛选及应用

3.1 激素肽

有机体需要高度复杂的化学信号传导系统来协调自身在各生理水平的活动。细胞间的生化通讯主要通过激素和神经递质实现^[54]。激素肽是激素中的一类，由下丘脑、垂体、甲状腺、胰腺、肠胃等器官分泌，主要通过细胞膜上的相关受体起作用^[55]。

3.1.1 胰岛素

胰岛素(Insulin)是经胰岛β细胞合成的多肽激素，与人体糖代谢密切相关^[56]，血液中胰岛素的浓度是Ⅰ型糖尿病的诊断标准^[57]。目前临床上检测胰岛素的方法主要是基于抗体的免疫法^[58~60]，对试剂储存及操作技能要求较高，因此开发新的胰岛素分析检测方法具有重要价值。

Yoshida等^[30]利用富鸟嘌呤(Guanine, G)文库筛选获得了胰岛素的核酸适配体IGA3。在游离状态下IGA3自身可形成G-四链体结构；而当IGA3与胰岛素结合后，会形成新的复合物，G-四链体被破坏。利用IGA3的这一特性，已开发了多种胰岛素检测方法(表 2)。这些基于核酸适配体的胰岛素检测方法虽然没有利用抗体，但都能获得满意的效果，体现了核酸适配体作为识别单元设计检测体系的能力。

表 2

表 2 一些基于核酸适配体的胰岛素检测体系

Table 2. Overview of aptamer-based insulin-sensing assays

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方法 Method	检测模式 Assay format	检出限 Detection limit (nmol/L)	文献 Ref.
Fluorescence	NIR (near-infrared) fluorescence	1.0×10^-3	[61]
	GO(graphene oxide) quenching	5	[62]
	Triple-helix molecular switches	9.97	[63]
Electrochemistry	Oxidation-reduction	1.0×10³	[64]
	Impedance	6.0×10^-6	[65]

3.1.2 脑钠肽

脑钠肽(Brain natriuretic peptide, BNP)是由心、脑分泌的多肽激素^[66]，对调节体内的钠平衡及血压至关重要，BNP水平已被证实是充血性心力衰竭的诊断指标^[67]。筛选BNP的核酸适配体可为发展快速、稳定的检测方法提供新的思路。

Lin等^[34]将BNP固定到琼脂糖微球表面，筛选获得了BNP的核酸适配体8-12。利用荧光标记的适配体8-12可对BNP进行快速、灵敏检测，检出限为1 nmol/L。Jang等^[68]将适配体8-12与金纳米立方体修饰的抗体结合，通过表面等离子体共振技术(Surface plasmon resonance, SPR)检测了BNP(图 1)。由于金纳米立方体的信号放大作用，该方法具有较宽的检测范围(1 amol/L~500 nmol/L)。

图 1

图 1. 核酸适配体及金纳米立方体修饰的抗体用于脑钠肽SPR传感器的构建^[68]。(A)利用金纳米立方体对抗体进行功能化的过程；(B)利用核酸适配体对SPR金膜进行功能化的过程；(C)金纳米立方体增强信号的夹心型SPR传感器

Figure 1. Construction of surface plasmon resonance (SPR) sensor for brain natriuretic peptide (BNP) based on aptamer and gold nanocube-antibody^[68]. (A) Antibody functionalization of gold nanocubes; (B) Aptamer probe functionalization of gold SPR chips; (C) Nanocube-enhanced sandwich SPR sensor

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此外，Wang等^[35]也筛选获得了BNP的核酸适配体(A8、A10、A11、A13、A14-1及A14-5)。其中，A10的K_d=(12 ± 1.5) nmol/L，对牛血清白蛋白及卵清蛋白均无响应，有望用于构建BNP的检测体系。

3.1.3 血管加压素

血管加压素(Vasopressin，AVP)是由下丘脑合成的一种神经激素^[69]，可调节肾脏对体液中水的重吸收。患有充血性心力衰竭^[70]、抗利尿激素分泌失调综合征^[71]或晚期肝硬化^[72]等病症血液中AVP的浓度均有显著提高。此外，在所有小细胞肺癌及乳腺癌中都有AVP及其受体的表达^[73]。总之，AVP的失调与多种重大疾病相关，筛选AVP的核酸适配体，不仅可以将其作为诊断试剂，还能作为拮抗剂用于疾病的治疗。

众所周知，生物体内有多种酶能够降解核酸，因此核酸适配体在体内的稳定性一直是研究者关注的热点，也一直限制了它的发展。为了克服这一难题，Williams等^[40]在筛选AVP的核酸适配体时，引入了“筛选-映像”的策略(图 2)，先用天然D型核酸组成的文库筛选出非天然D型AVP的核酸适配体，再将D型核酸适配体进行手性翻转，得到与天然L型AVP结合的L型核酸适配体。生物体内许多酶不识别非天然L型核酸适配体，减少了酶切造成的降解，大大提高了核酸适配体的稳定性。该AVP的核酸适配体对S1 nuclease及DNase Ⅰ均不敏感，在人血清中孵育7天也不会降解。同时，它还能抑制猪肾上皮细胞LLC-PK1中环腺苷酸(cAMP)的释放，有望作为拮抗剂用于AVP相关疾病的治疗。

图 2

图 2. “筛选-映像”策略用于筛选血管加压素的抗酶切核酸适配体^[40]

Figure 2. "Selection-reflection" strategy used to screen nuclease-insensitive aptamer for Vasopressi (AVP)^[40]

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Purschke等^[41]也借助镜像筛选的策略，获得了AVP的核酸适配体NOX-F37。NOX-F37经聚乙二醇(PEG)修饰后，具备更强的抗酶切能力。虽然NOX-F37不能抑制LLC-PK1细胞中cAMP的释放，但却可以影响A7r5平滑肌细胞中Ca²⁺的流通。此外，它还能抑制小鼠体内AVP的功能。小鼠经静脉注射NOX-F37后，其排尿量、尿液渗透压及Na⁺浓度都受到影响。因此NOX-F37有望用于AVP相关疾病的诊断与治疗。

3.1.4 促性腺激素释放素

促性腺激素释放素(Gonadotropin-releasing hormone, GnRH)由下丘脑分泌，是调控哺乳动物繁殖过程的重要激素^[74]。GnRH可触发级联激素反应，产生促性腺激素、黄体生成激素和促卵泡激素^[75]。因此，GnRH及其受体已经成为前列腺癌、乳腺癌和子宫内膜异位等性激素依赖疾病的治疗靶点^{[76, 77]}。虽然已有用于免疫治疗的疫苗作为GnRH的拮抗剂，但研究者仍希望找到合适的配体，仅与GnRH进行结合便可抑制下游级联反应，减少治疗的副作用^[78]。

Leva^[42]及Wlotzka^[43]于2002年分别筛选了GnRH的核酸适配体。后者筛选获得的核酸适配体NOX 1255不仅可以影响中华仓鼠卵巢细胞内GnRH的活性，还可抑制缺乏睾丸素的大鼠体内GnRH的功能，提高大鼠血清中促性腺激素的浓度。结果表明，NOX 1255的免疫原性几乎可以忽略。因此NOX 1255在开发以GnRH为靶点的新药方面有显著的潜在应用价值。

鉴于NOX 1255对GnRH的高亲和力及特异性，Richards等^[79]还利用NOX 1255富集尿液中的GnRH，用于后续色谱-质谱分析。因此，有望利用NOX 1255开发低成本的亲和试剂盒。

3.2 神经肽

神经肽是最大的一类细胞间信号分子，主要存在于中枢神经系统，调节生物体的繁殖、喂养、体重调节、疼痛、记忆、情绪、焦虑、昼夜节律等生理过程^[80]。1931年，Euler和Gaddum从兔组织提取物中分离获得P物质^[81]，这是第一个被鉴定为神经肽、而非激素肽的活性多肽。

3.2.1 P物质

P物质(Substance P)属于神经肽激动素家族^[82]，初级神经元的中枢端及外周端都可释放P物质。P物质不仅与痛觉、血压有一定关系，也参与控制呼吸、心跳等非随意活动^[83]。此外，还有研究认为P物质对血管的生成至关重要，可能与动脉粥样硬化、糖尿病性视网膜病、癌症等血管生成疾病相关^[84]。Nieuwlandt等^[44]于1995年首次筛选了P物质的核酸适配体。为了得到高亲和力的适配子序列，先进行第一次筛选，并以此次筛选获得的亲和序列A13的PCR双链产物为文库，再进行第二次富集。最后获得序列B28，亲和力比A13有明显提高。竞争结合实验证实，B28可区分正常的P物质及其反向氨基酸序列，体现出B28的高特异性。此外，Eulberg等^[45]利用自动化工作站也筛选获得了P物质的核酸适配体。在自动化筛选流程中，可通过软件系统精确控制96孔板中每一孔盖的开启关闭来避免样品间的交叉污染；同时将传统PCR反应改进为半定量PCR，控制反应进度，减少非特异性产物的产生，提高筛选精度。经过8轮筛选，获得了P物质的核酸适配体SUP-A-004。SUP-A-004能抑制P物质的生物活性，影响细胞内Ca²⁺的释放，有望作为拮抗剂用于P物质相关疾病的治疗。

3.2.2 神经肽Y

神经肽Y(Neuropeptide Y, NPY)是一种多肽神经递质，是人类进化过程中最保守的多肽之一^{[85, 86]}。NPY广泛分布于中枢及外周神经系统中^[87]，调节食物摄取、血管收缩^[88]、记忆储存^[89]、昼夜节律^[90]等生理过程。

Proske等^[48]将NPY固定在磁珠表面，筛选获得了NPY的核酸适配体DP3。在将NPY分解成不同片段考察它们与DP3结合情况时发现，DP3只与NPY(18-36)这部分序列结合。此外，NPY与DP3结合后不能再与其受体Y2相互作用，因而DP3极有可能模拟了Y2受体的功能。

Mendonsa等^[49]利用毛细管电泳辅助的筛选方法(CE-SELEX)也获得了NPY的核酸适配体。由于毛细管电泳的高效分离，该方法仅需4轮筛选便获得了NPY的核酸适配体，并可区分出NPY与其同源家族的多肽。这些核酸适配体都可为NPY的研究提供新的帮助。

胰多肽(Pancreatic polypeptide, PP)是经胰腺分泌的多肽激素，与NPY同属胰多肽家族，序列同源性高达50%以上^[91]。PP被认为是无功能性胰腺神经内分泌肿瘤的特异性标志物^{[92, 93]}，本课题组筛选获得了可同时与PP结合的一对高亲和力核酸适配体26_17及10_13，并将它们用于夹心型PP检测方法的设计(图 3)^[94]。

图 3

图 3. 基于动态光散射法的双核酸适配体夹心实验用于人胰多肽的检测^[94]

Figure 3. Sandwich-type assay for pancreatic polypeptide based on dual-aptamers and dynamic light scattering^[94]

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3.3 毒素

α-金环蛇毒素(α-Bungarotoxin)是中华金环蛇毒液中的重要组成部分^[95]。α-金环蛇毒素为碱性多肽，能与神经肌肉接头处的乙酰胆碱受体不可逆地结合，引起中毒者麻痹、呼吸衰竭并最终导致死亡^[96]。由于抗蛇毒血清的获得较为复杂且保存困难，研究者希望通过筛选蛇毒的核酸适配体来开发新的抗蛇毒药物。

Lauridsen等^[50]通过“一步法”获得了α-金环蛇毒素的核酸适配体。SPR考察结果表明，核酸适配体Clone 24与靶标的结合能力最强，有望用作α-金环蛇毒素活性的抑制剂。

此外，金环蛇毒液中另一个重要成分是β-金环蛇毒素^[97]，占蛇毒蛋白含量的20%以上^[98]，也属于神经毒素^[99]。Ye等^[100]将β-金环蛇毒素吸附在多孔板上，筛选获得了β-金环蛇毒素的核酸适配体βB-1，可区分银环蛇毒液与其它毒蛇毒液，有望作为特异性的β-金环蛇毒素拮抗剂用于抗蛇毒研究。

3.4 其它多肽

β-淀粉样肽(1-40)(Amyloid beta 1-40, Aβ40)是由淀粉样前体蛋白经酶切产生的多肽^[101]。Aβ可以自组装形成淀粉样纤维并沉积在大脑中形成斑块，引起突触功能障碍和神经元的丢失^[102]。Aβ40的聚集已被证实是阿尔兹海默症(Alzheimer′s disease, AD)的诱因之一，被认为是诊断和治疗AD的主要靶点^[103]。开发新的分子识别探针用于研究Aβ40，对AD的防治有着重要价值。至今已有很多研究者筛选出Aβ40核酸适配体，并对它们的功能进行深入研究。

Takahashi等^[52]将Aβ40固定在金纳米颗粒上，筛选出Aβ40的核酸适配体，并考察了它们对Aβ40纤维化的影响。如图 4所示，Aβ40分别与核酸适配体N2和E2孵育后，不再形成纤维状结块；而单独孵育时(核酸适配体不存在)，Aβ40会形成很明显的淀粉样纤维。以上结果表明，N2和E2可抑制Aβ40的纤维化，对AD的防治有潜在价值。

图 4

图 4. 核酸适配体对Aβ40纤维化过程的抑制^[52]。Aβ40分别与核酸适配体N2(A~C)、E2(D~F)孵育19 h及单独孵育(G~I)19 h后的透射电镜扫描结果

Figure 4. Inhibitory effects of aptamer on Aβ40 fibrosis^[52]. TEM images of Aβ40 after incubation with aptamers N2 (A-C), E2 (D-F) or without aptamer (G-I) for 19 h

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同时，Babu等^[104]还成功利用N2对Aβ40进行免标记荧光检测：三联吡啶钌可以嵌入游离态的N2增强其化学发光信号；而当N2与Aβ40结合后，三联吡啶钌不再能嵌入，化学发光信号减弱。同时，作者还利用原子力显微镜表征了Aβ40-N2复合物的形貌，未发现有纤维状寡聚体出现，再次证明N2可抑制Aβ40的纤维化。

此外，还筛选获得其它Aβ40核酸适配体(表 1)，并用于发展各种Aβ40检测方法^[105~107]，这些研究成果都能为AD的防治提供帮助。

4. 结论与展望

自1990年Ellington等^[108]和Tuerk等^[109]几乎同时在《Nature》和《Science》上分别发表了关于SELEX的研究论文以来，核酸适配体已逐渐被研究者所熟悉并在多个领域得到了应用。目前，尽管不少多肽的核酸适配体已经被筛选并得到应用，但将适配体作为多肽研究中的普适工具仍存在一定的困难。

首先，目前的筛选方法多为固定目标物法，需要将多肽通过化学修饰或者物理吸附的方式固定在固相基质上。虽然这种筛选方法更便于分离亲和序列，但最终获得的核酸适配体很有可能对游离状态的靶标识别不佳。其次，随着高通量测序技术的发展，SELEX富集文库的测序结果常包含十几万条序列。同时，由于一些多肽的分子量较低，传统的表征生物大分子相互作用的方法(如SPR、琼脂糖凝胶电泳迁移法等)难以快速有效地测定核酸序列与靶标之间的亲和性。另外，核酸适配体的稳定性仍是限制其在活体水平应用的重大障碍。前文提到的“筛选-映像”策略虽然能提高核酸的抗酶切能力，但需要先将多肽的氨基酸进行手性翻转，这对于二级结构较为复杂的多肽难以适用。

目前，虽然多肽的核酸适配体还未在临床上得到应用，但是核酸适配体已经展示出它们在传感器设计、生物成像及生物活性抑制等方面的突出优势。随着筛选策略、表征手段、修饰方法的进一步发展，相信将会获得更多高性能、多功能的核酸适配体，为维护人类健康做出贡献。

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图 1 核酸适配体及金纳米立方体修饰的抗体用于脑钠肽SPR传感器的构建^[68]。(A)利用金纳米立方体对抗体进行功能化的过程；(B)利用核酸适配体对SPR金膜进行功能化的过程；(C)金纳米立方体增强信号的夹心型SPR传感器

Figure 1 Construction of surface plasmon resonance (SPR) sensor for brain natriuretic peptide (BNP) based on aptamer and gold nanocube-antibody^[68]. (A) Antibody functionalization of gold nanocubes; (B) Aptamer probe functionalization of gold SPR chips; (C) Nanocube-enhanced sandwich SPR sensor

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图 2 “筛选-映像”策略用于筛选血管加压素的抗酶切核酸适配体^[40]

Figure 2 "Selection-reflection" strategy used to screen nuclease-insensitive aptamer for Vasopressi (AVP)^[40]

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图 3 基于动态光散射法的双核酸适配体夹心实验用于人胰多肽的检测^[94]

Figure 3 Sandwich-type assay for pancreatic polypeptide based on dual-aptamers and dynamic light scattering^[94]

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图 4 核酸适配体对Aβ40纤维化过程的抑制^[52]。Aβ40分别与核酸适配体N2(A~C)、E2(D~F)孵育19 h及单独孵育(G~I)19 h后的透射电镜扫描结果

Figure 4 Inhibitory effects of aptamer on Aβ40 fibrosis^[52]. TEM images of Aβ40 after incubation with aptamers N2 (A-C), E2 (D-F) or without aptamer (G-I) for 19 h

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表 1 一些以多肽为靶标的核酸适配体

Table 1. Some polypeptides-targeted nucleic acid aptamers

目标物(按类别) Category of target	核酸适配体的序列(由5′端到3′端) Sequence of aptamer (from 5′ to 3′)	应用 Application	文献 Ref.
Hormone
Insulin	IGA3: GGT GGT GGG GGG GGT GGT AGG GTG TCT TCT	B	[30]
glucagon	NOX-G15: L-GCG GGA AAT GGG AGG GCT AGG AAG GAA TCT GAG CGC	A	[31]
IGF-Ⅰ	IGF1-3F: ATA CGG GAG CCA ACA CCA GAT GCG AGG ACG GTG GGT GGG AGG GTG GAG GTC TCG AGA GCA GGT GTG ACG GAT	B	[32]
	IGF1-25R: ATC CGT CAC ACC TGC TCT GCA AGC ATT CAT ATT GGT TGG TGG AAG TGG GGG GGG TGG TGT TGG CTC CCG TAT	B	[32]
CGRP	STAR-F12: L-GGA CUG AUG GCG CGG UCC UAU UAC GCC GAA AGGGA GAG GGG AGA CAG G	A	[33]
BNP	8-12: TAA ACG CTC AAA GGA CAG AGG GTG CGT AGG AAG GGT ATT CGA CAG GAG GCT CAC A	B	[34]
	A10: GGC GAT TCG TGA TCT CTG CTC TCG GTT TCG CGT TCG TTC G	B	[35]
ProGRP_31－98	A18''': CCA GAT AGT CCC TGG	B	[36]
Ghrelin	NOX-B11: L-CGU GUG AGG CAA UAA AAC UUA AGU CCG AAG GUA ACC AAU CCU ACA CG	A	[37]
Amylin	NOX-A42: L-GGA CUG AUG GCG CGG UCC UAU UAC GCC GAU AGG GUG AGG GGA	A	[38]
Hepcidin	NOX-H94: L-GCG CCG UAU GGG AUU AAG UAA AUG AGG AGU UGG AGG AAG GGC GC	A	[39]
Vasopressin	L-TCA CGT GCA TGA TAG ACG GCG AAG CCG TCG AGT TGC TGT GTG CCG ATG CAC GTG A	A	[40]
	NOX-F37: L-GGG GUA GGG CUU GGA UGG GUA GUA CAC-PEG₁₈-GUG UGC GUG GU	A	[41]
GnRH	S42: L-GCG GCG GAG GGT GGG CTG GGG CTG GGC CGG GGG GCG TGC GTA AGC ACG TAG CCT CGC CGC	A	[42]
	NOX 1255: L-CCA AGC TTG CGT AAG CAG TCT CCT CTC AGG GGA GGT TGG GCG GTG CGT AAG CAC CGG TTT GCA GGG G	A, B	[43]
Neuropeptide
SubstanceP	B28: GGG AGC UCA GAA UAA ACG CUC AAC UUC CAA GGC AGU AAA CCC AAG GUC AAU AAU GAC CAA UGA GCC GCC GCU CCG GUA UCC GGC	——	[44]
	SUP-A-004: GGC GCA GGU GGG UAA AGG GGU GUG AUC GAG GGU CGA GAG GCG CC	A	[45]
β-Casomorphin-7	Seq6: ATA CGG GAG CCA ACA CCA AAG TAA GAT CAT CAC CCG GAC GCG GAC ATA ATA GGA GAG CAG GTG TGA CGG AT	B	[46]
Nociceptin	NOX 2149: L-GGA CCU CAC GAC CUC GUG AGA GGA GUU UUC UAA AGA ACU GGG GUA GUG CCA GUA GGG GUC C	A	[47]
NPY	DP3: CAG CAG GAG GGC CGG CGU UAG GGU UAG CGA GCC GAU UGA A	——	[48]
	Clone 4.31: AGC AGC ACA GAG GTC AGA TGC AAA CCA CAG CCT GAT GGT TAG CGT ATG TCA TTT ACG GAC CTA TGC GTG CTA CCG TGA A	——	[49]
Toxin
α-Bungarotoxin	Clone 24: GCG AGG TGT TCG AGA GTT AGG GGC GAC ATG ACC AAA CGT T	——	[50]
Others
Aβ40	β55: GGG AAU UCG AGC UCG GUA CCU UUA CGA AGG CCU GUC UUC GUU UGA CAG CGG CUU GUU GAC CCU CAC ACU UGU ACC UGC UGC CAA CUG CAG GCA UGC AAG CUU GG	I	[51]
	N2: UAG CGU AUG CCA CUC UCC UGG GAC CCC CCG CCG GAU GGC CAC AUC C	A, B	[52]
	T-SO508: GCC TGT GGT GTT GGG GCG GGT GCG	B	[53]
IGF-Ⅰ:胰岛素样生长因子-Ⅰ; CGRP:降钙素基因相关肽; BNP:脑钠肽; ProGRP_31-98:胃泌素释放肽前体(31-98); GnRH:促性腺激素释放素; NPY:神经肽Y; Aβ40: β-淀粉样肽(1-40); A:拮抗剂; B:生物传感; I:成像 IGF-Ⅰ: insulin-like growth factor-Ⅰ; CGRP: calcitonin gene-related peptide; BNP: brain natriuretic peptide; ProGRP_31-98: pro-gastrin-releasing peptide (31-98); GnRH: gonadotropin-releasing hormone; NPY: neuropeptide Y; Aβ40: amyloid beta (1-40); A: antagonist; B: biosensing; I: imaging.

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表 2 一些基于核酸适配体的胰岛素检测体系

Table 2. Overview of aptamer-based insulin-sensing assays

方法 Method	检测模式 Assay format	检出限 Detection limit (nmol/L)	文献 Ref.
Fluorescence	NIR (near-infrared) fluorescence	1.0×10^-3	[61]
	GO(graphene oxide) quenching	5	[62]
	Triple-helix molecular switches	9.97	[63]
Electrochemistry	Oxidation-reduction	1.0×10³	[64]
	Impedance	6.0×10^-6	[65]

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通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com

1.
沈阳化工大学材料科学与工程学院沈阳 110142