pH和氧化双响应性聚<i>β</i>硫酯化合物的制备及其聚集性质的研究

引用本文: 赵文静, 乔增莹, 段中余, 王浩. pH和氧化双响应性聚β硫酯化合物的制备及其聚集性质的研究[J]. 化学学报, 2016, 74(3): 234-240. doi: 10.6023/A15120787 shu

Citation: Zhao Wenjing, Qiao Zengying, Duan Zhongyu, Wang Hao. Synthesis and Self-assembly of pH and ROS Dual Responsive Poly(β-thioester)s[J]. Acta Chimica Sinica, 2016, 74(3): 234-240. doi: 10.6023/A15120787 shu

pH和氧化双响应性聚β硫酯化合物的制备及其聚集性质的研究

赵文静 ^a, ,
乔增莹 ^b, ,
段中余 ^{a,*,
,} ,
王浩 ^{b,*,
,}

a.
河北工业大学化工学院天津 300130
b.
国家纳米科学中心纳米科学卓越创新中心纳米生物效应与安全性重点实验室北京 100190

通讯作者: E-mail: zyduan@hebut.edu.cn Tel.: 010-82545759; E-mail: wanghao@nanoctr.cn

基金项目:
国家自然科学基金 21374026, 51373046, 51473045

和河北省自然科学基金 B2014202209

摘要: 以二丙烯酸二乙二醇酯(DEDA), 二硫苏糖醇(DTT), 丙烯酰氯(AC), 巯基聚乙二醇(PEG-SH, M_n=2000 Da)为原料, 通过迈克尔加成反应合成了pH和活性氧(ROS)双响应型的两亲性聚β硫酯化合物(D-D-P), 利用核磁共振(NMR)对聚合物结构进行了表征, 利用凝胶渗透色谱(GPC)表征了聚合物D-D-P分子量(M_n=50400). 利用透析法使D-D-P自组装成纳米粒子, 用纳米粒度分析仪(DLS)表征了粒径约280 nm, 用透射电子显微镜(TEM)表征了其形貌. 通过粒径变化测试和尼罗红(NR)荧光测试对纳米粒子在酸性(pH≈5)和氧化条件下(H₂O₂)的解散行为进行了研究, 验证了D-D-P的pH和ROS双响应性能. 通过紫外吸收测试对包裹抗癌药物阿霉素(DOX)的纳米粒子在酸性和氧化条件下的释放进行了研究, 并且在MCF-7细胞中对DOX的释放进行了进一步的验证.

关键词:

English

Synthesis and Self-assembly of pH and ROS Dual Responsive Poly(β-thioester)s

a.
School of Chemical Engineering, Hebei University of Technology, Tianjin 300130
b.
CAS Center for Excellence in Nanoscience, CAS Key Laboratory for Biological Effects of Nanomaterials and Nanosafety, National Center for Nanoscience and Technology (NCNST), Beijing 100190

Corresponding author: Duan Zhongyu, zyduan@hebut.edu.cn; Wang Hao, wanghao@nanoctr.cn

Received Date: 19 December 2015
Fund Project:
the National Natural Science Foundation of China

Hebei Provincial Natural Science Foundation

Abstract: The Michael addition reaction, which is a mild reaction between activated olefins and nucleophiles, has been widely used in synthesis of tailored macromolecular architectures. We designed a copolymer nanoparticle to obtain the ROS and pH dual responsive capability. We synthesized the amphiphilic poly(β-thioester)s copolymers (D-D-P) composed of di(ethylene glycol) diacrylate (DEDA), DL-dithiothreitol (DTT), acryloyl chloride (AC) and hydrophilic PEG-SH with average M_n=2000 g·mol^-1 via Michael addition reaction. The reactions are facile and controllable, and the structures of acquired copolymers are well characterized. The structures of the polymers were confirmed by ¹H NMR, and the number molecular weight and distribution of the copolymer D-D-P was measured by GPC (M_n=50400). D-D-P could self-assemble into nanoparticles with core-shell structures by dialysis method due to the composition of hydrophilic side chains and hydrophobic polymer backbones. After the preparation of ROS and pH dual responsive D-D-P nanoparticles in phosphate buffer solution, the morphology and size of D-D-P nanoparticles were observed by transmission electron microscopy (TEM) and dynamic light scattering (DLS) showed that the number size distribution of nanoparticles was around 280 nm. Nile Red (NR) is a unique neutral hydrophobic molecule, which shows very weak fluorescence in aqueous solution and can emit strong fluorescence in the hydrophobic environment. NR absorption and emission spectra are strongly dependent on environment polarity, which make it as a probe molecule that is widely used in the evaluation of microenvironment polarity. The disassembly behaviors of D-D-P nanoparticles were investigated by the change of the nanoparticle size and NR fluorescence spectra. The diameter of nanoparticle decreased under pH 5 and ROS environment conditions, and the NR fluorescence also became weak under pH 5 and ROS environment conditions, which could be attributed to the gradual dissociation of nanoparticles, proving the ROS and pH dual responsive properties of the poly(β-thioester)s. The release behaviors of the DOX encapsulated D-D-P nanoparticles in acidic and oxidative condition were studied by the UV absorption and were further proved in MCF-7 cells.

Key words:

1    引言

图图式1 pH和ROS双响应型的聚β硫酯(D-D-P)纳米粒子的药物(DOX)包载及释放过程

Figure 图式1. The DOX encapsulation and release of ROS and pH-sensitive poly(β-thioester)s (D-D-P) nanoparticles

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为了达到最佳的癌症治疗效果, 发展pH和ROS双重响应的聚合物纳米载体对于实现抗癌药物的精准可控释放尤为重要. 本文以二丙烯酸二乙二醇酯(DEDA)、二硫苏糖醇分子(DTT)、丙烯酰氯(AC)和巯基聚乙二醇(PEG-SH, M_n＝2000 Da)为原料, 利用迈克尔加成反应, 设计合成了一种聚β硫酯类聚合物, 其同时具有亲疏水链段, 所以在水相中可以自组装成纳米粒子, 聚β硫酯聚合物主链为疏水链段位于纳米粒子核心, 可以用来包裹疏水药物, 而侧链亲水性PEG组成纳米粒子的外壳. 由于硫醚键在ROS的条件下被氧化成亚砜键或砜键, 疏水链段转变为亲水链段, 使得纳米粒子膨胀, 解散, 以实现药物可控释放的目的^[19～22]. 另外, 本文合成的聚β硫酯聚合物还具有β-硫代丙酸酯基团, 在酸性条件下不稳定, 导致链段断裂, 使纳米粒子解散^[23]. 通过对合成的聚β硫酯聚合物结构及其形成的纳米粒子的粒径、ROS响应性质和pH响应性质等的表征, 验证其具备作为纳米药物载体的潜能. 所以, 本文制备的纳米粒子具有ROS和pH双响应性能, 有望在肿瘤微环境可以起到协同的作用, 实现药物的可控释放, 提高药物治疗癌症的效果(图式1) .

活性氧(ROS)在许多生理过程中起着关键性作用, 比如细胞信号和先天免疫. ROS的过度表达会破坏生物大分子, 引起疾病, 比如癌症. 由于肿瘤细胞线粒体部位ROS表达量相对正常细胞多, 所以氧化响应型的聚合物在生物医学具有潜在应用, 引起了人们极大的兴趣和广泛研究^[6～10]. 另外, 由于肿瘤微环境为酸性pH≈6.8, 并且肿瘤细胞溶酶体的pH大约为5～6, 而正常细胞微环境pH大约为7.4, pH响应型聚合物纳米载体在抗癌药物的可控释放方面受到越来越多的关注与研究^[11～18].

近年来, 生物可降解高分子嵌段共聚物作为载药纳米系统在控制释放领域被广泛研究, 以改善传统方法对癌症的治疗效果. 聚合物纳米药物载体可以克服抗肿瘤药物治疗多重耐药性和毒副作用等缺点^{[1a, 2]}. 可降解聚合物纳米负载药物具有化学结构多样性, 能够增强细胞内化, 长的循环寿命, 降解产物无毒副作用等优点, 所以在癌症治疗方面具有很大的潜能^[3～5]. 聚β硫酯类聚合物具有极低的细胞毒性, 并且可以被生物降解, 有助于药物在肿瘤部位可控释放, 提高药效.

2    结果与讨论

2.1    聚合物的核磁表征

图图式2 聚合物D-D-P的合成路线. (a)迈克尔加成反应, 三乙胺, DMSO, 50 ℃, 3 d. (b) 丙烯酰氯, 三乙胺, DMSO, 25 ℃, 1 d. (c) PEG2000-SH, 迈克尔加成反应, 三乙胺, DMSO, 50 ℃, 2 d

Figure 图式2. Synthetic route of the polymer D-D-P. (a) Michael-type addition, Et₃N, DMSO, 50 ℃, 3 d. (b) Acryloyl chloride, Et₃N, DMSO, 25 ℃, 1 d. (c) PEG2000-SH, Michael-type addition, Et₃N, DMSO, 50 ℃, 2 d

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以DEDA, DTT, AC, PEG-SH (M_n＝2000 Da)为原料, 通过迈克尔加成反应合成了pH和ROS双响应型的两亲性聚β硫酯化合物(D-D-P)(图式2) . 聚合物的结构均由¹H核磁图证实. 图 1为聚合物1的¹H核磁图, 从图中可以看出双键峰δ 5.8～6.3消失, 由此证明DEDA和DTT迈克尔加成反应成功. 图 2为聚合物2的¹H核磁图, 从图中可以看出双键峰δ 5.8～6.3出现, 由此证明AC修饰成功, 并且其分子量由GPC表征, M_n＝47300. 图 3为聚合物3 (D-D-P)的¹H核磁图, 从图中可以看出双键峰δ 5.8～6.3消失, 并且在δ 3.5处出现PEG

图3 聚合物D-D-P的¹H核磁图

Figure 3. ¹H NMR spectrum of the polymer D-D-P in d₆-DMSO

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图2 聚合物2的¹H核磁图

Figure 2. ¹H NMR spectrum of the polymer 2 in d₆-DMSO

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图1 聚合物1的¹H核磁图

Figure 1. ¹H NMR spectrum of the polymer 1 in d₆-DMSO

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2.2    聚合物纳米粒子粒径与形貌表征

图4 聚合物D-D-P纳米粒子在PB溶液中粒径表征和样品在不同浓度H₂O₂经过不同时间处理的DLS表征

Figure 4. Number size distribution of D-D-P nanoparticles in PB solution and incubation time-dependent change at different concentration of H₂O₂ measured by DLS

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图5 聚合物D-D-P纳米粒子TEM表征

Figure 5. TEM images of the D-D-P nanoparticles

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由于合成的聚β硫酯化合物具有两亲性能, 所以在水相环境中可以自组装成纳米粒子. 聚β硫酯化合物疏水嵌段位于纳米粒子核心, 亲水性强的PEG形成纳米粒子的外壳. 纳米粒子粒径由DLS进行表征, 如图 4a所示, 粒径大约为280 nm. 纳米粒子的形貌由TEM进行了表征, 如图 5所示, 纳米粒子形态为均一的球状结构.

2.3    聚合物纳米粒子pH和ROS双响应性质

2.4    细胞内DOX响应释放

由于肿瘤细胞线粒体部位ROS表达量相对正常细胞多, 所以氧化响应性的聚合物进入癌细胞之后会解散, 随着细胞的凋亡, ROS表达量会增大, 会促进氧化响应性聚合物的进一步解散, 此过程不断的循环, 有助于达到高效抗癌. 肿瘤微环境为酸性且肿瘤细胞溶酶体的pH大约为5～6, 所以具有氧化和pH双响应性的聚合物D-D-P纳米粒子载体在癌细胞中能够得到更好的解散. 为了研究DOX在MCF-7癌细胞内的释放过程及DOX在其细胞器中的分布, 我们用包裹DOX的D-D-P纳米粒子对MCF-7细胞进行不同时间(0.5 h, 1 h, 4 h, 9 h)的培养, 并且利用Lyso Tracker Green 对其溶酶体进行染色, 然后在单光子激光共聚焦成像仪(CLSM)进行观测. 如图 12所示, 培养0.5 h及1 h内, 包裹DOX的D-D-P纳米粒子通过内吞的作用进入细胞内, 位于溶酶体. 随着培养时间的增长, 被包裹的DOX逐渐释放, 并且随着时间的增长, 释放量增大, 并进入到细胞核中, 发挥肿瘤治疗的效果. 该实验证实了D-D-P纳米粒子能够包裹DOX并且在细胞中可控释放, 所以可以用来作为药物载体实现肿瘤治疗.

图12 利用CLSM观测包裹DOX的D-D-P纳米粒子在MCF-7细胞中DOX的释放过程

Figure 12. Confocal microsopy of living MCF-7 cells that were incubated with DOX encapsulated D-D-P nanoparticles

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2.3.1    聚合物纳米粒子粒径变化

pH响应性聚合物已经得到广泛的研究及应用^[24～28]. 由于聚合物D-D-P的主链段包含β-硫代丙酸酯键, 在酸性条件下, 链段断裂, 导致其形成的纳米粒子解散^[23], 粒径变小. 为了证实聚合物D-D-P自组装成的纳米粒子具有pH响应性能, 调节其pH至5, 在不同时间对其粒径DLS变化进行了跟踪测试. 如图 6所示, 纳米粒子粒径先膨胀然后减小, 由此证明其具有pH响应性能. 为了进一步研究双响应性能的协同作用, 对纳米粒子进行了双处理, 在pH 5和H₂O₂ 50 mmol•L^-1同时作用下, 对其在不同时间粒径变化也进行了跟踪测试. 如图 7所示, 纳米粒子的解散速度变快, 解离后粒径更小. 因此, 通过pH和氧化的双重控制可以调控纳米粒子的解离速度, 有望实现药物的双响应性可控释放.

图7 聚合物D-D-P纳米粒子在PB溶液中粒径表征和样品在50 mmol•L^-1 H₂O₂ 并且pH 5经过不同时间处理的DLS表征

Figure 7. Number size distribution of D-D-P nanoparticles in PB solution and incubation time-dependent change at 50 mmol•L^-1 H₂O₂ and pH 5 measured by DLS

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图6 聚合物D-D-P纳米粒子在PB溶液中粒径表征和样品在pH 5经过不同时间处理的DLS表征

Figure 6. Number size distribution of D-D-P nanoparticles in PB solution and incubation time-dependent change at pH 5 measured by DLS

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由于硫醚键被氧化, 疏水链段转变为亲水性能的性质^[22]已经得到广泛研究及证实, 氧化响应性能聚合物得以关注及发展. 为了证实聚合物D-D-P自组装成的纳米粒子具有氧化响应性能, 对其用不同浓度H₂O₂处理之后, 在不同时间通过DLS对其粒径变化进行了跟踪测试. 如图 4a, 4b所示, 纳米粒子粒径随着时间的增长

和H₂O₂浓度的增加而减小. 这是由于位于聚合物D-D-P自组装成的纳米粒子核心的疏水性链段, 在氧化条件下, 转变为亲水性, 导致纳米粒子解散, 粒径变小. 时间越长, H₂O₂浓度越大, 其粒径越小, 说明聚合物链逐渐被氧化, 导致纳米粒子逐渐解散, 证明了其具有氧化响应性.

2.3.2    聚合物纳米粒子的解散性能

图9 在pH 5下NR荧光探针随时间变化的发射光谱

Figure 9. The time dependent emission spectra of NR fluorescent probe at pH 5

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尼罗红(NR)作为一种独特的中性疏水探针分子, 在水溶液中荧光强度非常弱, 但是在疏水环境中具有很强的荧光, 这种性质使其作为探针分子得到广泛应用^[29]. 所以, 通过包载NR, 根据荧光强度变化, 可以跟踪纳米粒子解散过程, 模拟药物释放过程. 设定激发波长为545 nm, 发射谱记录波长范围为560～700 nm, 记录纳米粒子在不同浓度H₂O₂和pH 5条件下NR在不同时间的荧光强度. 如图 8所示, 在同一H₂O₂浓度下, 随着时间的增长, NR荧光强度逐渐减弱, 而且随着H₂O₂浓度从50 mmol/L增大到100 mmol/L, NR的荧光减弱程度增加, 但是H₂O₂浓度增大到一定程度(200 mmol/L)后, 荧光减弱程度与H₂O₂浓度100 mmol/L条件下基本一致. 如图 9所示, 在pH 5下, 随着时间的增长, NR荧光强度逐渐减弱. 证实了聚合物D-D-P纳米粒子在氧化及酸性条件下逐渐解散, 模型药物NR 被逐渐释放出来. 因此, 该纳米粒子具有氧化和pH双响应性, 有助于包载药物在肿瘤环境(pH 5～6并且ROS过量表达)下可控释放.

图8 在不同浓度H₂O₂下NR荧光探针随时间变化的发射光谱

Figure 8. The time dependent emission spectra of NR fluorescent probe at different concentration of H₂O₂

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2.3.3    DOX的包裹与释放

图10 在50 mmol/L H₂O₂下DOX随时间变化的释放曲线

Figure 10. The time dependent cumulative release profiles of DOX at 50 mmol/L H₂O₂

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DOX作为抗肿瘤药物, 对多种肿瘤均有作用, 通过负载于刺激响应性纳米粒子中进行释放已得到广泛的研究^{[30, 31]}. 所以具有氧化和pH双响应性的聚合物D-D-P纳米粒子载体可以包裹DOX, 使其在氧化或酸性条件下得到释放, 以达到抗癌效果. 将聚合物包裹DOX, 根据DOX吸收度校准曲线计算出, 药物包载量为9.8%, 包封率约为49%. 根据紫外吸收强度变化, 可以跟踪DOX的释放过程, 记录纳米粒子在50 mmol/L H₂O₂和pH 5条件下, 随着时间变化, DOX在485 nm处的吸收度. 如图 10所示, 包裹DOX的纳米粒子在72 h内几乎没有释放, 而在50 mmol/L H₂O₂浓度下, 随着时间的增长, DOX在1 h内发生了明显释放. 如图 11所示, 在pH 5下, 随着时间的增长, DOX的释放速率明显快于pH 7.4条件下. 以上实验结果证实了聚合物D-D-P纳米粒子在氧化及酸性条件下逐渐解散, 抗癌药物DOX能够被逐渐释放出来. 因此, 该纳米粒子有助于包载药物在肿瘤环境下可控释放.

图11 在pH 5下DOX随时间变化的释放效率

Figure 11. The time dependent cumulative release profiles of DOX at pH 5

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3    结论

本文应用迈克尔加成合成了两亲性聚β硫酯化合物, 通过透析法制备得到纳米粒子, 运用DLS测得纳米粒子粒径大约为280 nm. 纳米粒子具有pH和ROS双响应性能, 使得其可以作为药物载体, 使包载药物在肿瘤弱酸环境并且ROS过量表达下能够可控释放, 因此在纳米药物载体领域具有重要的潜在应用价值.

4    实验部分

4.1    聚β硫酯化合物的合成

称量DEDA (0.214 g, 1 mmol)和DTT (0.154 g, 1 mmol)于5 mL单口圆底烧瓶, 溶于2 mL DMSO中, 搅拌, 加入催化剂三乙胺(7 μL, 0.05 mmol), 通惰性气体N₂, 置换空气, 大约15 min, 避光搅拌, 在 50 ℃恒温油浴下反应3 d. 反应结束后, 转移至透析袋(2000 Da MWCO)中, 在去离子水中透析大约24 h, 将透析后的样品冷冻干燥2 d, 得白色胶状产物1.

称量2 (5 mg, 0.01 mmol)和PEG-SH (20.33 mg, 0.01 mmol)于5 mL单口圆底烧瓶, 溶于2 mL DMSO中, 搅拌, 加入催化剂三乙胺(5 μL, 0.036 mmol), 通惰性气体N₂, 置换空气, 大约15 min, 避光搅拌, 在 50 ℃恒温油浴下反应2 d. 反应结束后, 转移至透析袋(3500 Da MWCO)中, 在去离子水中透析大约24 h, 将透析后的样品冷冻干燥2 d, 得浅棕色疏松粉状最终产物3 (D-D-P).

称量1 (0.184 g, 0.5 mmol)于10 mL单口圆底烧瓶, 溶于2 mL DMSO中, 搅拌, 加入三乙胺(2.508 mL, 18 mmol), 搅拌均匀, 慢滴加AC (487 μL, 6 mmol), 在常温反应过夜. 反应结束后, 弃去不溶物, 将溶液部分转移至透析袋(2000 Da MWCO)中, 在去离子水中透析大约24 h, 将透析后的样品冷冻干燥2 d, 得浅棕色胶状产物2.

4.2    纳米粒子的制备

取聚合物样品0.6 mg D-D-P于10 mL白色血清玻璃瓶, 并溶于1 mL DMSO中, 搅拌均匀, 用注射泵缓慢滴加2 mL磷酸缓冲溶液(PB, 10 mmol•L^-1, pH 7.4) , 滴加速度设定为30 μL/min, 滴加完毕, 继续搅拌1 h. 将溶液转至透析袋(2000 Da MWCO)中, 在PB(10 mmol•L^-1, pH 7.4) 中透析6 h, 每2 h换一次透析液. 透析完毕, 得体积5 mL, 浓度0.12 mg/mL的聚合物纳米粒子溶液.

4.3    动态激光光散射仪分析(DLS)

取D-D-P纳米粒子溶液(0.5 mL, 0.12 mg/mL)于1 mL的石英池中, 在反射角173°, 温度 25 ℃的条件下, 在动态激光光散射仪中进行测试. 样品经过不同处理: pH 5、H₂O₂ 50 mmol•L^-1、H₂O₂ 100 mmol•L^-1、pH 5且H₂O₂ 50 mmol•L^-1, 用同样的方法, 在不同时间跟踪测试粒径变化.

4.4    透射电镜分析(TEM)

取D-D-P纳米粒子溶液(20 μL, 0.12 mg/mL)于含碳支持膜的铜网上, 1 min后用滤纸吸除多余的溶液, 滴加20 μL醋酸双氧铀进行染色, 1 min后用滤纸吸除多余的染色剂, 然后用20 μL超纯水洗后, 自然晾干, 制样结束后, 用透射电镜进行观察.

4.5    尼罗红(NR)荧光测试

将NR的乙醇溶液(10 μL, 1.0×10^-3mol/L)加入到5 mL聚合物纳米粒子溶液(0.12 mg/mL, 10 mmol/L pH 7.4 PB)中, 在25 ℃避光搅拌过夜. 将pH 5的醋酸缓冲溶液加入到该部分溶液中, 调节至相应的pH, 同样将不同量的H₂O₂加入到该部分溶液中, 调节至H₂O₂ 50 mmol/L、H₂O₂ 100 mmol/L, 常温下用荧光光谱仪记录在不同时间NR的发射谱, 激发波长为545 nm, 发射波长范围记录为560～700 nm.

4.6    DOX的包裹及释放测试

取聚合物样品0.6 mg D-D-P于10 mL白色血清玻璃瓶, 并溶于1 mL DMSO中, 搅拌均匀, 完全溶解后加入DOX (4 mg/mL, 30 μL)溶液, 用注射泵缓慢滴加2 mL磷酸缓冲溶液(PB, 10 mmol/L, pH 7.4) , 滴加速度设定为30 μL/min, 滴加完毕, 继续搅拌1 h. 将溶液转至透析袋(2000 Da MWCO)中, 在PB(10 mmol/L, pH 7.4) 中透析6 h, 每2 h换一次透析液. 透析完毕, 得体积5 mL, 浓度0.12 mg/mL的包裹DOX聚合物纳米粒子溶液. 将pH 5的醋酸缓冲溶液加入到该部分溶液中, 调节至相应的pH, 同样将H₂O₂加入到该部分溶液中, 调节至H₂O₂ 50 mmol/L, 常温下用紫外分光光度计记录在不同时间DOX在485 nm处的吸光度.

4.7    包裹DOX纳米粒子的细胞内过程

取包裹DOX的 D-D-P纳米粒子加入DMEM培养基中, 其中DMEM培养基中包括10%血清和1%的双抗, 在5% CO₂, 温度37 ℃环境下培养MCF-7细胞, 并且培养不同的时间(0.5 h, 1 h, 4 h, 9 h)之后, 用PBS洗3次, 加入溶酶体染色剂Lyso Tracker Green, 培养40 min, 用PBS洗3次, 加入DMEM培养基, 之后在CLSM下观测.
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图式1 pH和ROS双响应型的聚β硫酯(D-D-P)纳米粒子的药物(DOX)包载及释放过程

Scheme 1 The DOX encapsulation and release of ROS and pH-sensitive poly(β-thioester)s (D-D-P) nanoparticles

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图式2 聚合物D-D-P的合成路线. (a)迈克尔加成反应, 三乙胺, DMSO, 50 ℃, 3 d. (b) 丙烯酰氯, 三乙胺, DMSO, 25 ℃, 1 d. (c) PEG2000-SH, 迈克尔加成反应, 三乙胺, DMSO, 50 ℃, 2 d

Scheme 2 Synthetic route of the polymer D-D-P. (a) Michael-type addition, Et₃N, DMSO, 50 ℃, 3 d. (b) Acryloyl chloride, Et₃N, DMSO, 25 ℃, 1 d. (c) PEG2000-SH, Michael-type addition, Et₃N, DMSO, 50 ℃, 2 d

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图 1 聚合物1的¹H核磁图

Figure 1 ¹H NMR spectrum of the polymer 1 in d₆-DMSO

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图 2 聚合物2的¹H核磁图

Figure 2 ¹H NMR spectrum of the polymer 2 in d₆-DMSO

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图 3 聚合物D-D-P的¹H核磁图

Figure 3 ¹H NMR spectrum of the polymer D-D-P in d₆-DMSO

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图 4 聚合物D-D-P纳米粒子在PB溶液中粒径表征和样品在不同浓度H₂O₂经过不同时间处理的DLS表征

Figure 4 Number size distribution of D-D-P nanoparticles in PB solution and incubation time-dependent change at different concentration of H₂O₂ measured by DLS

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图 5 聚合物D-D-P纳米粒子TEM表征

Figure 5 TEM images of the D-D-P nanoparticles

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图 6 聚合物D-D-P纳米粒子在PB溶液中粒径表征和样品在pH 5经过不同时间处理的DLS表征

Figure 6 Number size distribution of D-D-P nanoparticles in PB solution and incubation time-dependent change at pH 5 measured by DLS

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图 7 聚合物D-D-P纳米粒子在PB溶液中粒径表征和样品在50 mmol•L^-1 H₂O₂ 并且pH 5经过不同时间处理的DLS表征

Figure 7 Number size distribution of D-D-P nanoparticles in PB solution and incubation time-dependent change at 50 mmol•L^-1 H₂O₂ and pH 5 measured by DLS

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图 8 在不同浓度H₂O₂下NR荧光探针随时间变化的发射光谱

Figure 8 The time dependent emission spectra of NR fluorescent probe at different concentration of H₂O₂

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图 9 在pH 5下NR荧光探针随时间变化的发射光谱

Figure 9 The time dependent emission spectra of NR fluorescent probe at pH 5

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图 10 在50 mmol/L H₂O₂下DOX随时间变化的释放曲线

Figure 10 The time dependent cumulative release profiles of DOX at 50 mmol/L H₂O₂

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图 11 在pH 5下DOX随时间变化的释放效率

Figure 11 The time dependent cumulative release profiles of DOX at pH 5

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图 12 利用CLSM观测包裹DOX的D-D-P纳米粒子在MCF-7细胞中DOX的释放过程

Figure 12 Confocal microsopy of living MCF-7 cells that were incubated with DOX encapsulated D-D-P nanoparticles

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