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• 咔咯是一种具有18-π电子共轭结构的大环化合物，可与金属离子形成稳定的高价态金属配合物^[1]。研究表明，咔咯及其金属配合物在抗肿瘤领域具有潜在应用前景^[2-3]。例如，5, 10, 15-三[4-(N-甲基-2吡啶基)-2, 3, 5, 6-四氟苯基]咔咯对活体内血管内皮生长因子和纤维母细胞生长因子活性能起抑制作用进而抑制肿瘤演化和转移^[4]；单羟基取代的咔咯衍生物作为光敏剂在光动力治疗鼻咽癌中已展现潜在应用价值^[5]；磺酸型镓咔咯与靶向乳腺癌细胞的蛋白质自组装形成的非共价化合物可应用于肿瘤组织检测和消除^[6]。此外，阳离子型水溶性咔咯还是一类新型G四链体稳定剂，有望通过抑制端粒酶表达进而阻碍肿瘤细胞增殖^[7-9]。吩噻嗪是一类很好的医药材料，其可以用于安眠镇静、镇痛、退热、抗菌和抗肿瘤^[10-11]。因此，咔咯与吩噻嗪共价相连形成的二元体化合物在生物医药领域的应用引起我们课题组的兴趣。我们之前的研究表明，吩噻嗪-咔咯二元体较之相应咔咯单体展现出更高的荧光量子产率和更有效的光核酸酶活性^[12]，吩噻嗪-咔咯镓(Ⅲ)配合物在光照下，能够导致DNA的光损伤^[13]，吩噻嗪-咔咯钴(Ⅲ)配合物在光照下能有效抑制人肺癌细胞(H460)、人宫颈癌细胞(HeLa)和人肺癌细胞(A549)增殖^[14]。可以看出，吩噻嗪的引入能够提高化合物的核酸酶活性及抗肿瘤性能。铁咔咯配合物由于独特的氧化还原特性，其在人工核酸酶^[15]、抗氧化^[16-18]和催化化学^[19-20]等领域均已展现出潜在应用价值。因此，本文合成了10-(4-吩噻嗪苯基)-5, 15-二(五氟苯基)铁咔咯配合物(2-Fe)。由于2-Fe显顺磁性，因此无法获得核磁信号。通过紫外-可见光谱，ESI-MS对其结构进行表征，并进一步研究了其对A549肿瘤细胞株的毒性及其作用机制，同时探讨了2-Fe与ct-DNA的体外相互作用为外部结合，为该化合物作为潜在抗肿瘤药物奠定实验基础。

  Scheme 1

  

  Scheme 1.  Synthesis of phenothiazine-corrole iron complex(2-Fe)

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  1.   实验部分

  1.1   试剂和仪器

  小牛胸腺DNA(ct-DNA)、吩噻嗪-10-碳酰氯(PTZ)、1, 8-二氮杂二环[5, 4, 0]十一碳-7-烯(DBU)均购自美国Sigma公司；A549肿瘤细胞株购自American Type Culture Collection公司；碘化吡啶(PI)和四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自美国Amresco公司；Annexin V-FITC Apoptosis Detection购自BD公司；Hoechst 33342购自上海江莱生物科技有限公司；线粒体膜电位检测试剂盒(含JC-1原液及JC-1缓冲液)购自上海前尘生物科技有限公司；pBR322 DNA购自大连宝生物工程有限公司；三羟甲基甲胺(Tris)、生物氯化钠(NaCl)、硼酸(H₃BO₃)、琼脂糖、溴酚蓝、溴化乙锭(EB)均购自上海生工生物工程公司并均为生物纯；其它试剂均为分析纯，实验用水为去离子水。

  Agilent1290/maXis impact型超高压液相色谱-高分辨质谱联用仪(德国Burker公司)；AVANCE Digital 400 MHz型核磁共振波谱仪(NMR，瑞士Bruker公司)；TE2000-E型倒置显微镜(日本尼康公司)；HFI 60W型水套式CO₂细胞培养箱；TE2000-E型荧光显微镜(日本尼康公司)；BECKMAN FC500型流式细胞仪(美国贝克曼公司)；Varioskan Flash型酶标仪(美国Thermo公司)；2450型紫外可见分光光度计(UV-Vis，日本岛津公司)；RF-5301PC型荧光分光光度计(日本岛津公司)；J-810型圆二色光谱仪(CD, 日本JASCO公司)；31-CN型凝胶电泳仪(北京六一仪器厂)；BIO-RAD Gel Dox XR+型凝胶自动成像分析系统(美国伯乐公司)。

  1.2   实验方法

  10-(4-羟基苯基)-5, 15-二(2, 3, 4, 5, 6-五氟苯基)咔咯(1)参考文献[5]方法合成。配合物1-Fe合成方法如下：称取50 mg化合物1溶解于50 mL N, N-二甲基甲酰胺(DMF)，再加入290 mg四水合氯化亚铁(FeCl₂·4H₂O)，N₂气保护下回流反应3.5 h。反应结束后用二氯甲烷(DCM)/水(H₂O)(200 mL，体积比1:1)萃取3次，收集有机相。柱层析分离，以EtOH/DCM(体积比1:30)为洗脱剂，收集黑色条带，旋干得产物1-Fe，产率83%。咔咯-吩噻嗪铁配合物(2-Fe)的合成方法如下：称取31 mg配合物1-Fe溶解于50 mL DCM中，再加入98 mg吩噻嗪(PTZ)，注射150 μmol/L 1, 8-二氮杂环[5, 4, 0]十一烯-7(DBU)作催化剂。室温下反应1.5 h后，DCM/H₂O(100 mL，1:1)萃取3次，收集有机相。柱层析分离，以EtOH/DCM(体积比1:50)为洗脱剂，收集黑色条带，旋干得产物2-Fe，产率88%。UV-Vis(CH₂Cl₂), λ_max/nm:363, 394, 509, 635;ESI-MS:C₅₀H₂₀F₁₀FeN₅NaO₂S计算值1023.0420, 实测值1023.0425[M+Na]⁺。

  1.3   细胞毒性实验

  化合物2-Fe对A549肿瘤细胞株生长抑制的活性采用MTT方法测定。首先选取生长对数期的测试细胞接种到96孔板内(5×10³ Cell/well)，37 ℃、5%的CO₂饱和湿度培养箱中孵育生长12 h，每组设5个复孔，重复3次。吸去上层清液，加入新的培养基，同时加入不同浓度的测试化合物，每孔总体积100 μL。在暗条件、光照及注射H₂O₂(20 μmol/L)下分别继续培养24 h。然后每孔加入100 μL的MTT(5 mg/mL)，4 h后弃去上层清液，每孔加入100 μL的DMSO，振荡使结晶完全溶解后，测定波长在570 nm下各孔的吸光度值，根据所测得的各细胞存活率，计算目标化合物对肿瘤的半数抑制浓度(IC₅₀)值。

  1.4   细胞核染色研究

  生长对数期的A549细胞首先接种在6孔板内(2×10⁵ Cel/well)，于37 ℃、5%的CO₂饱和溶液培养12 h后，加入2-Fe(12 μmol/L)和H₂O₂(20 μmol/L)继续培养24 h，没有任何处理的细胞作为对照测试。24 h后借助Hoechst 33342(5 μg/mL)染色A549细胞株^[21]，通过倒置荧光显微镜观察两组A549细胞核形态学变化。

  1.5   细胞周期检测

  收集对照组和处理组细胞，调整细胞浓度为1×10⁵~5×10⁵ Cell/well，于4 ℃，70%无水乙醇中孵育12 h。离心去除乙醇，PBS漂洗，加入0.5 mL PI染液，4 ℃避光孵育20 min，流式细胞仪检测。

  1.6   细胞凋亡率检测

  常规方法收集细胞，调整细胞浓度为5.0×10⁵细胞/样品，样品加入100 μL缓冲液和5 μL AnnexinV-FITC及5 μL PI，摇匀。避光孵育10~15 min，流式细胞仪检测。

  1.7   线粒体膜电势的变化

  生长对数期的A549细胞首先接种在6孔板内(2×10⁵/well)，37 ℃、5%的CO₂饱和溶液培养12 h后，加入2-Fe(20 μmol/L)和H₂O₂(20 μmol/L)，按照上述实验描述继续培养24 h；没有任何处理的细胞作为对照测试。24 h后首先用冰冷的PBS洗涤A549细胞3次，然后加JC-1避光37 ℃培养染色20 min。在用JC-1缓冲溶液洗涤3次后，通过倒置荧光显微镜观察两组A549细胞线粒体膜电势的变化。

  1.8   2-Fe与ct-DNA的结合模式实验方法

  荧光光谱、紫外光谱、圆二色光谱、粘度测试及ct-DNA储存等实验均在Tris-HCl缓冲溶液I(5 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl，pH=7.2)中进行。ct-DNA浓度通过测定其紫外吸收光谱来确定，ct-DNA在260 nm处的摩尔消光系数为6600 L/(mol·cm)^[22]。

  1.8.1   荧光光谱

  在EB-DNA(c(EB)=5.0×10^-6 mol/L，c(DNA)=3.0×10^-5 mol/L)体系溶液中，逐次加入3 μL浓度为1×10^-3 mol/L的2-Fe溶液，搅拌3 min使ct-DNA与配合物完全结合并分布均匀，然后测定EB-DNA在500~700 nm范围内的荧光光谱变化(λ_ex=370 nm，T=298 K)。

  1.8.2   紫外-可见光光谱

  以缓冲溶液I作为空白，配置浓度为1.0×10^-5 mol/L的2-Fe，逐次注射2 μL浓度到1.5×10^-3 mol/L的ct-DNA储备，使ct-DNA与2-Fe浓度的比值不断增加。测定前均匀搅拌4 min，使ct-DNA与2-Fe完全结合并分布均匀，检测2-Fe在300~800 nm范围内的紫外-可见光光谱变化。

  1.8.3   圆二色光谱

  在固定ct-DNA浓度为1.5×10^-4 mol/L的溶液中逐次加入配合物2-Fe，使2-Fe浓度依次为1.5×10^-5、3.0×10^-5和6.0×10^-5 mol/L。每次测定前搅拌4 min，使ct-DNA与2-Fe完全结合并分布均匀，然后在测定ct-DNA在225~600 nm范围内ct-DNA的圆二色光谱变化。

  1.8.4   粘度测试

  粘度测试采用乌氏粘度计，恒温槽维持溶液温度在(30±0.1) ℃中。固定ct-DNA浓度为1.0×10^-4 mol/L，逐渐加大2-Fe的浓度，分别测定不同2-Fe浓度下溶液流经毛细管所需的时间，按式(1)计算粘度(η)^[23]：

  $ \eta = \frac{{t - {t_0}}}{t} $

  (1)

  式中，t₀为缓冲溶液流经毛细管所需的时间(s)，t为含不同浓度配合物2-Fe的DNA溶液流经毛细管所需的时间(s)。以(η/η₀)^1/3对c(2-Fe)/c(DNA)的比值作图，η₀为DNA溶液的相对黏度。

  1.9   琼脂糖凝胶电泳

  向含有0.1 μg pBR322 DNA中加入不同浓度的2-Fe，同时加入过氧化氢(H₂O₂，20 mmol/L)作为氧化剂，再加入在Tris-HCl缓冲溶液Ⅱ(5 mmol/L Tris-HCl，18 mmol/L NaCl，2%DMF，pH=7.2)，使总体积为10 μL。避光反应30 min后，琼脂糖凝胶电泳2 h(77 V，30 mA)后，放入EB溶液中染色15 min，水冲洗后放入凝胶成像系统中成像。

  2.   结果与讨论

  2.1   细胞毒性

  采用MTT法对1-Fe和2-Fe的细胞毒性进行评估。如表 1所示，在黑暗、光照、20 μmol/L H₂O₂等条件下，2-Fe对A549细胞的毒性优于1-Fe，2-Fe对A549细胞株的IC₅₀值分别为(103±5.7)、(80±3.1)、(12±3.2) μmol/L。表明2-Fe自身对A549细胞株没有明显的暗毒性和光毒性，然而在少量H₂O₂存在下，2-Fe对A549肿瘤细胞株生长表现出明显抑制作用。研究表明，单独的H₂O₂在浓度低于100 μmol/L时，对细胞是没有毒性作用的^[24]。因此，推测在H₂O₂ 存在下，2-Fe可能通过催化H₂O₂分解产生活性氧物种进而杀死A549肿瘤细胞^[25]。

  表 1

  

  表 1  2-Fe对A549细胞的抑制率(IC₅₀/(μmol·L^-1))

  Table 1.  The inhibitory activity (IC₅₀/(μmol·L^-1)) of 2-Fe against A549 cells

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  Complex		A549
  	Dark	Light	H2O2
  1-Fe	112±6.1	78±2.9	18±5.9
  2-Fe	103±5.7	80±3.1	12±3.2

  2.2   细胞周期检测

  为初步研究在H₂O₂条件下，2-Fe对A549肿瘤细胞株生长抑制的作用机制，采用PI标记结合流式细胞术检测细胞周期变化。图 1所示，与空白对照相比，在2-Fe和H₂O₂共同作用下，G1期细胞比例减少，而S期和G2期细胞比例均有增加。表明2-Fe和H₂O₂共同作用于A549肿瘤细胞株后可以导致S期和G2期细胞阻滞。

  图 1

  

  图 1.  对照组(A)和H₂O₂+2-Fe(B)共同作用A549细胞24 h的细胞周期

  Figure 1.  Cell cycle distribution of A549 cells after treatment without(A)/with(B) 2-Fe(12 μmol/L)+H₂O₂(20 μmol/L) for 24 h

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  2.3   细胞凋亡率的测定

  Annexin V-FITC/PI双标记法能够定量分析细胞凋亡并可定量分析早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞、活细胞和坏死细胞。图 2显示，2-Fe和H₂O₂共同作用下，A549细胞凋亡率显著高于对照组凋亡率(63.76% vs 0.25%)。表明在H₂O₂存在下，2-Fe可以诱导A549细胞发生凋亡，主要为晚期凋亡。

  图 2

  

  图 2.  对照组(A)和H₂O₂+2-Fe(B)处理A549的细胞凋亡率

  Figure 2.  Control group(A) and 2-Fe(12 μmol/L) + H₂O₂(20 μmol/L)(B) induced apoptosis in A549 cells using annexinV-FITC/7ADD by flow cytometric

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  2.4   细胞核形态观察

  利用Hoechst-33342细胞核染色实验观察H₂O₂和2-Fe共同处理A549细胞24 h后的细胞核形态变化。图 3A显示空白对照组中的A549细胞呈现完整的细胞核形态。然而，处理组(图 3B)的A549细胞核皱缩，细胞核深染、胞质浓缩、染色质成团块状、细胞表面有“出芽”现象，清晰的凋亡小体两点也随处可见，这是当细胞发生凋亡时的细胞核特征^[26]。因此，可以进一步确定在H₂O₂存在下，2-Fe是通过诱导A549细胞凋亡途径而抑制其增殖。

  图 3

  

  图 3.  对照组(A)和H₂O₂+2-Fe(B)处理A549细胞24 h的荧光形貌

  Figure 3.  Fluorescence microscopic images at 24 h of Hoechst-33342-stained A549 cells after treatment without(A)/with(B) 2-Fe(12 μmol/L) in the presence of H₂O₂

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  2.5   线粒体膜电势检测

  线粒体在细胞凋亡中具有重要作用^[27-28]。线粒体膜电势下降是线粒体功能发生改变的早期指标，可作为凋亡的特征性标志^[29]。线粒体膜电势可以用探针JC-1进行监测，当细胞处于凋亡状态时，线粒体膜电势开始下降，JC-1从多聚体的红色变为单聚体的绿色。因此可以用荧光显微镜跟拍照片直接测试线粒体膜电势的变化。为探究在2-Fe和H₂O₂共同诱导A549细胞凋亡的早期事件，利用JC-1标记流式细胞仪检测线粒体膜电势变化。图 4显示，对照组，JC-1发出强烈红色荧光，表明线粒体膜电势处正常水平。随着2-Fe和H₂O₂的加入，JC-1发出绿色荧光，表明A549线粒体膜电势下降。

  图 4

  

  图 4.  在H₂O₂存在下，2-Fe对A549细胞株线粒体膜电势影响

  Figure 4.  Effect of 2-Fe(12 μmol/L) on MMP decrease in A549 cells in the absence(A) and presence(B) of H₂O₂(20 μmol/L)

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  2.6   2-Fe与DNA的相互作用

  2.6.1   荧光光谱

  2-Fe自身没有荧光，因此采用EB(溴化乙锭)作为荧光探针，间接探究2-Fe与DNA的相互作用。EB本身荧光很弱, 然而EB插入到DNA碱基对，形成的EB-DNA结合物具有很强荧光^[21]。如图 5所示，当以370 nm作为激发波长，EB-DNA结合物在610 nm处有1个很强的荧光特征峰。随着2-Fe的滴加，EB-DNA结合物荧光强度逐渐减小，表明2-Fe与DNA之间发生了相互作用。通常猝灭机理被认为有两种：动态猝灭和静态猝灭。动态猝灭是由于猝灭剂与处于激发态的荧光分子发生碰撞而导致荧光猝灭；静态猝灭是指猝灭剂与荧光分子在基态时形成了不发光的基态复合物而引起荧光猝灭^[30]。通过Stern-Volmer方程计算猝灭常数^[31]：

  图 5

  

  图 5.  2-Fe对EB-DNA溶液体系荧光猝灭图(A)和F₀/F对c(2-Fe)作图(B)

  Figure 5.  (A)Fluorescence quenching spectra of EB bound to ct-DNA by 2-Fe in Tris-HCl I(containing 1% DMF) and (B)plots of F₀/F vs c(2-Fe)

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  $ {I_0}/I = 1 + {K_{{\rm{SV}}}}c({\bf{2 - Fe}}) $

  (2)

  式中，I₀和I分别代表EB-DNA自身荧光强度以及与2-Fe结合时的荧光强度，c(2-Fe)为2-Fe的浓度。I₀/I与c(2-Fe)之间有很好的线性(图 5A)，表明猝灭机理只有一种。计算2-Fe对EB-DNA体系荧光猝灭常数K_SV值为2.57×10⁴ L/mol，远大于动态猝灭机理常数(2×10² L/mol)^[32]。因此，推测2-Fe对EB-DNA体系的荧光猝灭机理为静态猝灭。

  2.6.2   紫外可见光谱

  紫外可见光谱是检测配合物与DNA结合模式的常用技术。当卟啉类分子插入到DNA碱基对之间，卟啉Soret带会发生明显红移(≥15 nm)和减色效应(≥35%)；而发生外部结合时，Soret带出现相对较小程度红移(≤8 nm)和减色效应(≤8%)^[33]。如图 6所示，随着DNA浓度的逐渐增加，2-Fe最大吸收峰415 nm吸光度发生了很小幅度的下降(减色率4.4%)和微弱的红移(3 nm)。由此，初步推断2-Fe与DNA之间可能以外部模式相结合。为定量检测2-Fe与DNA之间结合强弱，采用式(3)计算结合常数^[34]：

  图 6

  

  图 6.  ct-DNA与2-Fe相互作用紫外光谱(A)和c(DNA)/|ε_a-ε_f|对[DNA]作图(B)

  Figure 6.  Absorption spectral changes(A) of 2-Fe(10 μmol/L) in Tris-HCl I(containing 1% DMF) upon the addition of ct-DNA(0~10 μmol/L) and Plots of c(DNA)/(ε_a-ε_f) vs c(DNA)(B)

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  $ \frac{{c({\rm{DNA}})}}{{{\varepsilon _{\rm{a}}} - {\varepsilon _{\rm{f}}}}} = \frac{{c({\rm{DNA}})}}{{{\varepsilon _{\rm{b}}} - {\varepsilon _{\rm{f}}}}} + \frac{1}{{{K_{\rm{b}}}\left( {{\varepsilon _{\rm{b}}} - {\varepsilon _{\rm{f}}}} \right)}} $

  (3)

  式中，ε_a为2-Fe与DNA结合时的摩尔消光系数，ε_f和ε_b分别为2-Fe未与DNA结合以及完全被DNA结合的摩尔消光系数。以c(DNA)/|ε_a-ε_f|对c(DNA)作图，拟合直线的斜率与截距的比值得2-Fe与DNA结合常数K_b为4.1×10⁵ L/mol。

  2.6.3   圆二色光谱

  ct-DNA自身在246 nm处有B型DNA螺旋引起的负的CD峰和在275 nm处有一个由于DNA碱基对堆积引起的正的CD峰^[35]。当小分子与DNA发生结合会引起正负CD峰强度甚至形状变化，通过CD光谱变化可分析其结合模式。通常静电或外部结合对DNA结构影响不大，正负CD峰强度变化也较微弱，而插入模式结合会导致两个正负峰吸收强度发生明显增加^[36]。此外，非手性卟啉类分子与DNA相结合，在Soret带可能产生诱导CD峰(ICD)。通常负ICD代表插入模式，正ICD或没有ICD代表外部结合，同时出现正负ICD两个峰为自堆积模式结合^[33]。由图 7可以看出，随着2-Fe逐渐加入，ct-DNA在246、275 nm处CD峰吸收强度减小，但幅度不大且峰形保持不变，并且在Soret带也没有观察到ICD峰。据此，可进一步推测2-Fe与DNA结合模式为外部结合。

  图 7

  

  图 7.  2-Fe与ct-DNA相互作用的圆二色光谱(T=298.15 K)

  Figure 7.  CD spectra of ct-DNA(150.0 μmol/L) in Tris-HCl I(containing 10% THF) in the presence of various concentrations of 2-Fe at 298.15 K(r=c(2-Fe)/c(DNA)=0, 0.1, 0.2, 0.4

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  2.6.4   粘度测试

  在缺乏晶体学、核磁、质谱等数据下，粘度测试被认为是最有效的检测DNA与配合物结合模式的手段。DNA粘度对其长度变化非常敏感，当小分子插入到DNA碱基对之间，双螺旋会伸长，进而导致粘度增加(如经典插入剂EB)；部分插入模式会引起DNA双螺旋结构扭曲，DNA粘度减小；外部或静电结合对DNA结构影响不大，粘度幅度变化很小^[37-39]。由图 8可以看出，随着2-Fe与DNA浓度比值增加，DNA相对粘度逐渐升高，但增加幅度不大，远小于经典插入剂EB所引起的DNA粘度增加幅度。结合以上光谱学实验数据，推断2-Fe很可能是通过外部模式与DNA相互作用。

  图 8

  

  图 8.  303 K时不同浓度2-Fe对ct-DNA相对粘度影响

  Figure 8.  Relative viscosities of ct-DNA in the presence of 2-Fe at 303 K

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  2.6.5   催化氧化断裂DNA

  图 9是H₂O₂作氧化剂下，2-Fe催化氧化断裂DNA的凝胶电泳图。在H₂O₂或2-Fe单独存在下，超螺旋质粒FormⅠ型DNA完整无缺(lane 2和lane 3)。然而在H₂O₂和2-Fe共同作用下，当2-Fe浓度达到1 μmol/L，就可以观察到部分FormⅠ型DNA被2-Fe催化氧化断裂为开环缺刻Form Ⅱ型DNA(lane 4)。随着2-Fe浓度逐渐升高，FormⅠ型DNA含量逐渐降低。2-Fe浓度达到5 μmol/L时，FormⅠ型DNA被2-Fe完全催化氧化断裂，并观察少量线型Form Ⅲ型DNA(lane 6)。进一步升高2-Fe浓度，Form Ⅱ型DNA逐渐被2-Fe催化氧化断裂为Form Ⅲ型DNA，最终泳道上只能检测到Form Ⅲ型DNA(lane 12)。实验结果表明，在H₂O₂存在下，2-Fe是一种高效人工核酸酶试剂。在同等条件下，其催化氧化DNA的活性明显优于磺酸化的咔咯铁配合物(Fe-SC)^[13]和水溶性羧酸铁咔咯配合物(Fe^Ⅲ-TCPC)^[15]，可能和吩噻嗪基团的引入有关^[12]。

  图 9

  

  图 9.  在H₂O₂存在下不同浓度的2-Fe催化氧化断裂pBR322 DNA电泳图

  Figure 9.  Agarose gel electrophoresis of pBR322DNA(0.1 μg in 10 μL) after 30 min incubation with various concentrations of 2-Fe in the presence of H₂O₂ at 298 K

  Lane 1:DNA; lane 2:DNA+2-Fe(30 μmol/L); lane 3:DNA+H₂O₂ (20 mmol/L); lane 4-11:DNA+H₂O₂(20 mmol/L)+1, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30 μmol/L 2-Fe, respectively

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  为初步探究在H₂O₂存在下2-Fe催化氧化断裂DNA机理，采用添加自由基捕获剂方法检测反应过程中涉及的活性氧物种。研究结果表明，加入DABCO^[40]、NaN₃^[41]、L-组氨酸^[42]等单线态氧(¹O₂)捕获剂能有效抑制2-Fe催化氧化断裂DNA(图 10 lane 5-7)。而加入DMSO^[43]、叔丁醇^[44]等羟基自由基捕获剂对2-Fe核酸酶活性没有影响(lane 8-9)。因此，推断2-Fe催化氧化断裂DNA过程中涉及的活性氧物种可能是单线态氧。

  图 10

  

  图 10.  不同自由基捕获剂对2-Fe催化氧化断裂DNA影响

  Figure 10.  Cleavage of supercoiled pBR 322 DNA by 2-Fe(30 μmol/L) incubation with H₂O₂ for 30 min in the absence and presence of different inhibitors

  Lane 1:DNA; lane 2:DNA+2-Fe; lane 3:DNA+H₂O₂; lane 4:DNA+H₂O₂+2-Fe; lane 5:DNA+2-Fe+H₂O₂+DABCO(10 mmol/L); lane 6:DNA+2-Fe+H₂O₂+NaN₃(10 mmol/L); lane 7:DNA+2-Fe+H₂O₂+L-histidine(50 mmol/L); lane 8:DNA+2-Fe+H₂O₂+DMSO(2 μL); lane 8:DNA+2-Fe+H₂O₂+tert-BuOH(2 μL), c(2-Fe)=30 μmol/L, c(H₂O₂)=20 mmol/L

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  3.   结论

  10-(4-吩噻嗪苯基)-5, 15-二(五氟苯基)铁咔咯配合物(2-Fe)能以外部模式与ct-DNA相结合。在H₂O₂存在下，2-Fe能有效催化氧化断裂pBR322 DNA，其反应过程中涉及的活性氧物种可能是¹O₂。同时在H₂O₂存在下，2-Fe能通过诱导细胞凋亡与周期阻滞的方式显著抑制肺癌A549肿瘤细胞的生长，具体作用机制有待进一步研究。

  
  
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  Scheme 1  Synthesis of phenothiazine-corrole iron complex(2-Fe)

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  图 1  对照组(A)和H₂O₂+2-Fe(B)共同作用A549细胞24 h的细胞周期

  Figure 1  Cell cycle distribution of A549 cells after treatment without(A)/with(B) 2-Fe(12 μmol/L)+H₂O₂(20 μmol/L) for 24 h

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  图 2  对照组(A)和H₂O₂+2-Fe(B)处理A549的细胞凋亡率

  Figure 2  Control group(A) and 2-Fe(12 μmol/L) + H₂O₂(20 μmol/L)(B) induced apoptosis in A549 cells using annexinV-FITC/7ADD by flow cytometric

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  图 3  对照组(A)和H₂O₂+2-Fe(B)处理A549细胞24 h的荧光形貌

  Figure 3  Fluorescence microscopic images at 24 h of Hoechst-33342-stained A549 cells after treatment without(A)/with(B) 2-Fe(12 μmol/L) in the presence of H₂O₂

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  图 4  在H₂O₂存在下，2-Fe对A549细胞株线粒体膜电势影响

  Figure 4  Effect of 2-Fe(12 μmol/L) on MMP decrease in A549 cells in the absence(A) and presence(B) of H₂O₂(20 μmol/L)

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  图 5  2-Fe对EB-DNA溶液体系荧光猝灭图(A)和F₀/F对c(2-Fe)作图(B)

  Figure 5  (A)Fluorescence quenching spectra of EB bound to ct-DNA by 2-Fe in Tris-HCl I(containing 1% DMF) and (B)plots of F₀/F vs c(2-Fe)

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  图 6  ct-DNA与2-Fe相互作用紫外光谱(A)和c(DNA)/|ε_a-ε_f|对[DNA]作图(B)

  Figure 6  Absorption spectral changes(A) of 2-Fe(10 μmol/L) in Tris-HCl I(containing 1% DMF) upon the addition of ct-DNA(0~10 μmol/L) and Plots of c(DNA)/(ε_a-ε_f) vs c(DNA)(B)

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  图 7  2-Fe与ct-DNA相互作用的圆二色光谱(T=298.15 K)

  Figure 7  CD spectra of ct-DNA(150.0 μmol/L) in Tris-HCl I(containing 10% THF) in the presence of various concentrations of 2-Fe at 298.15 K(r=c(2-Fe)/c(DNA)=0, 0.1, 0.2, 0.4

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  图 8  303 K时不同浓度2-Fe对ct-DNA相对粘度影响

  Figure 8  Relative viscosities of ct-DNA in the presence of 2-Fe at 303 K

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  图 9  在H₂O₂存在下不同浓度的2-Fe催化氧化断裂pBR322 DNA电泳图

  Figure 9  Agarose gel electrophoresis of pBR322DNA(0.1 μg in 10 μL) after 30 min incubation with various concentrations of 2-Fe in the presence of H₂O₂ at 298 K

  Lane 1:DNA; lane 2:DNA+2-Fe(30 μmol/L); lane 3:DNA+H₂O₂ (20 mmol/L); lane 4-11:DNA+H₂O₂(20 mmol/L)+1, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30 μmol/L 2-Fe, respectively

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  图 10  不同自由基捕获剂对2-Fe催化氧化断裂DNA影响

  Figure 10  Cleavage of supercoiled pBR 322 DNA by 2-Fe(30 μmol/L) incubation with H₂O₂ for 30 min in the absence and presence of different inhibitors

  Lane 1:DNA; lane 2:DNA+2-Fe; lane 3:DNA+H₂O₂; lane 4:DNA+H₂O₂+2-Fe; lane 5:DNA+2-Fe+H₂O₂+DABCO(10 mmol/L); lane 6:DNA+2-Fe+H₂O₂+NaN₃(10 mmol/L); lane 7:DNA+2-Fe+H₂O₂+L-histidine(50 mmol/L); lane 8:DNA+2-Fe+H₂O₂+DMSO(2 μL); lane 8:DNA+2-Fe+H₂O₂+tert-BuOH(2 μL), c(2-Fe)=30 μmol/L, c(H₂O₂)=20 mmol/L

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  表 1  2-Fe对A549细胞的抑制率(IC₅₀/(μmol·L^-1))

  Table 1.  The inhibitory activity (IC₅₀/(μmol·L^-1)) of 2-Fe against A549 cells

  Complex		A549
  	Dark	Light	H2O2
  1-Fe	112±6.1	78±2.9	18±5.9
  2-Fe	103±5.7	80±3.1	12±3.2

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