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• 琥珀酸脱氢酶抑制剂(SDHI)是农业上重要的商品化杀菌剂, 该类杀菌剂通过竞争结合辅酶Q的结合位点, 破坏三羧酸循环和线粒体电子传递过程, 从而对植物病原真菌产生抑制活性^[1-2].已有23种SDHI类杀菌剂陆续上市^[3], 包含多种结构类型, 如吡唑酰胺类、苯甲酰胺类、噻唑酰胺类、噻吩酰胺类和呋喃酰胺类等^[4-5].由于该类杀菌剂具有抑菌活性高、作用机制新颖和结构类型多的特点, 开发结构新颖SDHI杀菌剂已经成为研究的热点^[6-9].

  通过分析商品化SDHI类杀菌剂的结构, 发现其均包括羧酸、酰胺键和胺三个部分.羧酸母核部分多为烷基或卤代烷基取代的杂环电子等排体^[10-12], 酰胺键相对保守, 胺部分多为取代芳香胺.在商品化SDHI类抑制剂中, 吡唑甲酰胺类衍生物最为常见, 如吡噻菌胺(penthiopyrad)、呋吡菌胺(furametpyr)、氟唑菌酰羟胺(pydiflumetofen)、氟唑菌酰胺(fluxapyroxad)和氟唑菌苯胺(penflufen)等(图 1).虽然SDHI类杀菌剂活性较高, 但杀菌谱较窄, 且骨架结构变化小, 易产生交互抗性^[13-14].目前研究中, 大多采用单环羧酸母核或芳香胺替换和修饰的策略^[15-17], 鲜有羧酸母核骨架改动的报道.本工作围绕羧酸母核部分, 结合吡唑酰胺类和噻吩酰胺类的结构特点, 将噻吩环引入吡唑环和酰胺键之间, 以期发现骨架新颖的抑菌先导化合物(Scheme 1).前期研究表明, 在吡唑联杂环酰胺类衍生物的羧酸母核中引入卤素时, 抑菌活性提高^[18-19].因此, 本研究拟引入噻吩环的同时, 继续引入卤素原子, 并设计合成了3类吡唑联噻吩酰胺类衍生物24个, 所有新化合物经抑菌活性测试, 并经¹H NMR、¹³C NMR和HRMS鉴定结构.

  图 1

  

  图 1.  代表性的吡唑甲酰胺类杀菌剂

  Figure 1.  Representative pyrazole carboxamide fungicides

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  图式 1

  

  图式 1.  目标化合物设计策略

  Scheme 1.  Design strategy of the target compounds

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  1.   结果与讨论

  1.1   目标化合物的合成

  目标化合物的合成路线见Scheme 2, 以4-溴噻吩- 2-甲酸甲酯、1-甲基-1H-吡唑-4-硼酸频哪醇酯为起始原料, 以四(三苯基膦)钯为催化剂, 反应结束经后处理得黄色固体.上述固体溶于甲醇后加氢氧化钠溶液水解, 反应完成后, 用盐酸调节pH至3~4, 经抽滤得中间体2. 2与N-氯代丁二酰亚胺(NCS)或N-溴代丁二酰亚胺(NBS)反应生成中间体4和6^[18]. 2、4、6分别与草酰二氯在二氯甲烷(DCM)溶剂中反应制备酰氯, 然后在冰浴条件下缓慢滴加取代胺与三乙胺的混合物, 制得目标化合物3、5和7.

  图式 2

  

  图式 2.  目标化合物的合成路线

  Scheme 2.  Synthetic route of target compounds

  Reaction conditions: (a) (1) Pb(PPh₃), K₃PO₄•H₂O, DMF, 100 ℃; (2) NaOH, H₂O, MeOH, r.t.; (b) NBS, DCM; (c) NCS, DCM; (d) (1) (COCl)₂, DMF, r.t.; (2) amine, triethylamine, DCM, r.t.

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  1.2   结构解析

  1.2.1   ¹H NMR谱

  以化合物3a的¹H NMR谱为例, 分子结构式为C₁₅H₁₂BrN₃OS, 谱图中12个氢均得到归属.化学位移δ 3.87的质子信号为单峰, 归属于吡唑环N原子的甲基; 化学位移δ 7.71和7.55的质子信号为一组相互偶合的d峰, 偶合常数为8.9 Hz, 归属于取代胺部分苯环上的质子; 化学位移δ 8.18和7.84质子信号为一组相互远程偶合的d峰, 偶合常数为1.3 (1.4) Hz, 归属于羧酸部分吡唑环或噻吩环上的质子; 化学位移δ 8.03和7.77质子信号为另一组相互远程偶合的d峰, 偶合常数为0.8 (0.9) Hz, 归属于羧酸部分吡唑环或噻吩环上的质子; 化学位移δ 10.37的质子为单峰, 归属于酰胺上的质子.

  1.2.2   ¹³C NMR谱

  以化合物3a的¹³C NMR谱为例, 化学位移δ 160.0出现的峰为羰基碳的吸收峰; 在δ 115.6~139.9出现的峰为吡唑环、噻吩环和苯环上碳的吸收峰, 由于苯环的对称关系, 存在2个重叠碳.化学位移δ 128.0的峰有2个, 分别为δ 127.97, 127.96, 归属于芳环碳的吸收峰; 化学位移δ 38.8出现的峰为吡唑环上1号位氮原子相连甲基碳的吸收峰.

  1.3   目标化合物7i的晶体结构

  将7i溶解于乙醇, 缓慢挥发后形成规则的无色透明晶体, 通过X射线单晶衍射确认了其空间结构, 如图 2所示(晶体结构数据存于剑桥晶体数据库, CCDC: 1969118). X射线单晶衍射分析结果表明化合物7i分子式为C₁₆H₁₁ClF₃N₃O₂S•H₂O, 分子量M_r=419.80, 三斜晶系, 晶胞参数: a=0.68374(3) nm, b=1.10226(5) nm, c=1.20905(5) nm; α=85.081(2)°, β=89.599(2)°, γ=86.169(2)°, V=0.90583(7) nm³; D_x=1.539 g/cm³; Z=2; F(000)=428.0; μ=0.378 mm^-1.晶体结构修正后的一致性因子R=0.0419, wR=0.1232.

  图 2

  

  图 2.  通过X射线衍射测定的7i的晶体结构

  Figure 2.  Crystal structure for 7i by X-ray diffraction determination

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  1.4   抑菌活性测试及构效关系分析

  测试目标化合物对水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、马铃薯早疫病菌(Alternaria solani)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、水稻恶苗病菌(Fusarium moniliforme)和草莓灰霉病菌(Botrytis cinerea)的抑制作用, 普筛抑菌活性结果见表 1.由表 1可知, 在50 μg/mL的浓度下, 化合物3c、3f、5b、7c、7h和7j对水稻纹枯病菌有较好的抑制活性, 但低于对照药噻呋酰胺和啶酰菌胺. 5b、7c、7h和7j对小麦赤霉病菌有较高活性, 活性接近阳性对照药噻呋酰胺和啶酰菌胺.对于马铃薯早疫病菌, 3f和7j的抑制活性高于阳性对照噻呋酰胺, 但低于对照药啶酰菌胺. 3c和3d对草莓灰霉病菌抑制活性较高, 均接近阳性对照药噻呋酰胺和啶酰菌胺. 5b、7h和7j的活性均高于对照药噻呋酰胺和啶酰菌胺的活性.总体上, 化合物7c、7h和7j对多种植物病原真菌表现出较高的抑制活性, 是值得深入研究的SDHI类先导化合物.

  表 1

  

  表 1  目标化合物(50 μg/mL)对6种植物病原菌的抑制率(%)^a

  Table 1.  Inhibition rate (%) of target compounds (50 μg/mL) against 6 phytopathogenic fungi

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  Compd.	水稻纹枯病菌	小麦赤霉病菌	马铃薯早疫病菌	油菜菌核病菌	水稻恶苗病菌	草莓灰霉病菌
  3a	69.3	58.3	43.2	26.7	26.8	61.4
  3b	76.2	47.6	45.1	34.3	35.8	51.5
  3c	78.3	66.2	75.6	55.9	60.8	81.4
  3d	74.0	46.1	57.2	76.0	51.4	82.5
  3e	44.3	65.6	22.1	39.6	19.1	62.9
  3f	81.5	71.3	82.4	40.4	19.1	53.1
  5a	56.2	45.5	42.1	30.9	12.8	64.3
  5b	82.3	82.1	58.7	27.3	11.5	87.1
  5c	19.0	22.3	18.7	16.6	16.8	57.3
  5d	35.1	42.5	37.4	30.9	18.6	34.4
  7a	47.8	54.6	59.6	33.7	4.0	59.6
  7b	71.2	55.9	38.8	38.1	14.6	75.5
  7c	92.7	80.6	63.4	57.8	14.2	75.9
  7d	40.3	20.6	27.2	21.8	28.0	67.9
  7e	35.3	19.3	19.1	17.4	9.7	56.7
  7f	52.2	39.0	35.4	8.3	15.5	66.1
  7g	49.8	39.6	38.4	28.7	14.6	28.6
  7h	88.6	79.5	76.9	65.7	54.2	94.8
  7i	21.2	30.3	60.8	13.0	40.8	66.1
  7j	83.2	88.7	81.6	41.1	41.3	87.2
  7k	48.2	33.1	52.3	15.7	21.7	79.5
  7l	15.3	38.3	32.8	28.7	31.0	45.6
  7m	32.1	45.2	25.8	15.8	9.3	70.8
  7n	45.6	61.2	76.3	44.0	9.8	59.5
  噻呋酰胺b	96.5	97.1	61.4	50.9	15.2	85.3
  啶酰菌胺b	96.2	90.8	92.5	55.1	30.1	82.1
  a Average of three replicates. b Used as a positive control

  对普筛活性较高的化合物进行了EC₅₀测定, 结果列于表 2.化合物7c、7h对水稻纹枯病菌的EC₅₀值分别为11.6和34.2 μmol/L, 对水稻纹枯病菌有较强的抑制活性.化合物3f、5b和7c对马铃薯早疫病菌的EC₅₀值均小于的阳性对照药噻呋酰胺的EC₅₀值(52.9 μmol/L).化合物3f、7c和7j对小麦赤霉病菌的EC₅₀值分别为44.7、43.2和28.9 μmol/L.化合物7h对草莓灰霉病菌的EC₅₀值为21.3 μmol/L, 接近阳性对照噻呋酰胺(19.7 μmol/L)的抑制活性.

  表 2

  

  表 2  目标化合物对4种植物病原菌的测定结果

  Table 2.  Results of target compounds against 4 phytopathogenic fungi

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  Compd.	病菌	EC50a/(μmol•L-1)
  3f	水稻纹枯病菌	77.9±7.9
  5b	水稻纹枯病菌	42.9±4.1
  7c	水稻纹枯病菌	11.6±0.6
  7h	水稻纹枯病菌	34.2±3.3
  7j	水稻纹枯病菌	73.1±12.9
  3c	马铃薯早疫病菌	88.8±7.2
  3f	马铃薯早疫病菌	49.5±2.8
  5b	马铃薯早疫病菌	43.0±3.1
  7c	马铃薯早疫病菌	50.8±1.6
  7h	马铃薯早疫病菌	66.3±3.2
  7j	马铃薯早疫病菌	87.1±8.4
  7n	马铃薯早疫病菌	87.8±6.7
  3f	小麦赤霉病菌	44.7±3.9
  5b	小麦赤霉病菌	54.7±5.8
  7c	小麦赤霉病菌	43.2±1.6
  7h	小麦赤霉病菌	102.6±10.2
  7j	小麦赤霉病菌	28.9±1.3
  3c	草莓灰霉病菌	43.5±1.6
  3d	草莓灰霉病菌	71.3±5.3
  5b	草莓灰霉病菌	38.0±2.4
  7c	草莓灰霉病菌	67.8±0.9
  7h	草莓灰霉病菌	21.3±1.8
  7j	草莓灰霉病菌	36.6±0.9
  7k	草莓灰霉病菌	66.1±6.9
  噻呋酰胺b	水稻纹枯病菌	0.5±0.2
  噻呋酰胺b	马铃薯早疫病菌	52.9±1.3
  噻呋酰胺b	小麦赤霉病菌	2.7±0.4
  噻呋酰胺b	草莓灰霉病菌	19.7±0.1
  a Average of three replicates. b Used as a positive control.

  研究结构与活性的关系发现, 噻吩环上引入氯原子或溴原子有利于提高化合物对于小麦赤霉病和水稻纹枯病的活性, 推测由于卤素的电负性, 诱导效应导致相连噻吩环电子云密度降低.当胺基与苯环间插入亚甲基或亚乙基时, 胺基团氮原子的孤对电子不参与苯环共轭, 对氟苯乙胺较强的碱性和氟原子的特性使7c抑菌活性明显提高.从3f、7j对小麦赤霉病菌的抑菌活性看出, 卤素取代明显优于甲基和甲氧基.当胺部分取代基有强吸电子基团时, 对病原真菌的抑制活性显著下降, 如目标化合物7g的胺部分取代基为硝基, 对6种真菌抑制活性最高不足50%.这些结果表明目标化合物的抑菌活性是由多种因素的共同作用.

  1.5   分子对接研究

  为解释配体化合物与琥珀酸脱氢酶受体的结合模式, 将最高活性的目标化合物7c对接到琥珀酸脱氢酶的活性位点.对接结果如图 3所示, 目标化合物7c的吡唑联噻吩羧酸母核插入到疏水性口袋, 酰胺键在辅酶Q结合位点与关键氨基酸残基D链58Try形成氢键, 取代胺部分的苯环与B链173Trp形成π-π键.较强氢键的相互作用增加了化合物和受体蛋白的结合力, 从而增强了化合物的抑制活性.

  图 3

  

  图 3.  化合物7c的结合模式

  Figure 3.  Docking mode of compounds 7c

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  2.   结论

  基于骨架跃迁策略, 设计并合成了3个系列24个结构新颖吡唑联噻吩甲酰胺类衍生物, 普筛抑菌活性数据表明, 部分目标化合物对水稻纹枯病菌、小麦赤霉病菌、马铃薯早疫病菌和草莓灰霉病菌四种植物病原真菌的抑制活性较强.化合物7c对水稻纹枯病的EC₅₀为11.6 μmol/L, 化合物7j对小麦赤霉病菌的EC₅₀为28.9 μmol/L, 化合物3f对马铃薯早疫病菌的EC₅₀为43.0 μmol/L, 高于阳性对照噻呋酰胺的抑制活性, 化合物7h对草莓灰霉病菌的EC₅₀为21.3 μmol/L, 接近阳性对照噻呋酰胺的抑制活性.分子对接表明, 在结合位点附近, 目标化合物的酰胺键与的琥珀酸脱氢酶关键氨基酸残基可形成氢键, 从而增强竞争结合力, 产生较强抑菌活性.因此, 具有新颖骨架结构化合物7c、7j、7h可作为SDHI类杀菌先导化合物进一步研究.

  3.   实验部分

  3.1   仪器与试剂

  AVANCE Ⅲ 400MHz核磁共振波谱仪(以TMS为内标, DMSO-d₆为溶剂, 瑞士布鲁克公司); Agilent 6530 Q-TOF LC/MS液相/质谱仪; Agilent 6545 Q-TOF LC/MS液相/质谱仪; APEXII单晶X射线衍射仪(瑞士布鲁克公司); 易测YRT-3型熔点仪; 柱层析硅胶和G254薄层色谱硅胶(青岛海洋化工厂).试剂和溶剂均为商品化化学纯或分析纯级别.

  3.2   实验方法

  3.2.1   中间体的合成

  在250 mL的三口瓶中加入原料4-溴噻吩-2-甲酸甲酯(0.10 mol), 1-甲基-1H-吡唑-4-硼酸频哪醇酯(0.11 mol), 四(三苯基膦)钯(0.01 mol), 磷酸三钾(三水合物)(0.10 mol)和150 mL N, N-二甲基甲酰胺(DMF), 在100 ℃、氮气保护条件下, 机械搅拌回流6 h, 冷却后用饱和食盐水洗涤(100 mL×3), 乙酸乙酯萃取分液, 有机相用无水硫酸钠干燥, 减压蒸馏后得到黄色固体.

  将上述黄色固体(0.10 mol), 甲醇(25 mL), 质量分数为10% NaOH溶液(50 mL), 加入250 mL的三口瓶中, 在常温条件下机械搅拌4 h后, 减压蒸馏除去甲醇, 乙酸乙酯(25 mL×3)洗涤, 分液后取水相, 滴加质量分数为10%的HCl溶液调节pH至3~4, 析出白色沉淀, 抽滤, 滤饼减压干燥后得到的白色固体即为中间体2.

  在250 mL的三口瓶中加入2 (0.10 mol)、N-溴代丁二酰亚胺(N-氯代丁二酰亚胺)(0.11 mol)和100 mL干燥的二氯甲烷, 在室温、氮气保护的条件下, 机械搅拌2 h, 减压蒸馏.加入少量乙酸乙酯(25 mL×3)洗涤以除去有机杂质, 抽滤, 滤饼减压干燥得中间体4和6.

  4-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)噻吩-2-甲酸(2):白色固体, 收率74%. m.p. 195~197 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.11 (s, 1H), 7.93 (d, J=1.6 Hz, 1H), 7.84 (d, J=1.5 Hz, 1H), 7.83 (s, 1H), 3.84 (s, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 163.0, 136.5, 135.1, 134.4, 131.6, 128.3, 125.0, 117.0, 38.7; HRMS calcd for C₉H₇N₂O₂S [M-H]^- 207.0234, found 207.0234.

  5-溴-4-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)噻吩-2-甲酸(4):白色固体, 收率82%. m.p. 179~182 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.30 (s, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.85 (s, 1H), 3.88 (s, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 161.9, 137.4, 134.9, 134.2, 133.3, 129.3, 114.9, 111.9, 38.8; HRMS calcd for C₉H₆BrN₂O₂S [M-H]^- 284.9339, found 284.9341.

  5-氯-4-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)噻吩-2-甲酸(6):白色固体, 收率85%. m.p. 163~167 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.30 (s, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.93 (s, 1H), 3.88 (s, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 162.0, 137.4, 132.6, 132.0, 131.7, 129.4, 126.4, 114.1, 38.8; HRMS calcd for C₉H₆ClN₂O₂S [M-H]^- 240.9844, found 240.9846.

  3.2.2   目标化合物3a~3f、5a~5d和7a~7n的合成

  向25 mL单口瓶中加入中间体2 (1.0 mmol), 1滴DMF和10 mL干燥二氯甲烷, 用恒压滴液漏斗缓慢滴加草酰氯(2.0 mmol), 滴加完毕, 室温氮气保护条件下, 磁子搅拌2 h后, 减压蒸馏, 得到淡黄色固体.

  将上述淡黄色固体及15 mL二氯甲烷加入到单口瓶中, 冰水浴条件下用恒压滴液漏斗缓慢滴加胺(2.0 mmol)和三乙胺(2.0 mmol).滴加完毕后, 氮气保护条件下磁子搅拌0.5 h, 升至室温.保温2 h后滴加质量分数为10%的HCl溶液, 调节pH至3~4, 饱和食盐水洗涤(10 mL×3), 二氯甲烷分液萃取, 减压蒸馏后硅胶柱层析纯化[石油醚/乙酸乙酯, V:V=3:1).

  N-(4-溴苯基)-4-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)噻吩-2-甲酰胺(3a):白色固体, 收率79.2%. m.p. 182~183 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.37 (s, 1H), 8.18 (d, J=1.4 Hz, 1H), 8.03 (d, J=0.8 Hz, 1H), 7.84 (d, J=1.3 Hz, 1H), 7.77 (d, J=0.9 Hz, 1H), 7.71 (d, J=8.9 Hz, 2H), 7.55 (d, J=8.9 Hz, 2H), 3.87 (s, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 160.0, 139.9, 138.2, 136.3, 134.2, 131.7, 128.0, 128.0, 124.0, 122.2, 117.3, 115.6, 38.8; HRMS calcd for C₁₅H₁₁BrN₃OS [M-H]^- 359.9811, found 359.9816.

  4-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-N-(对甲苯基)噻吩-2-甲酰胺(3b):淡黄色固体, 收率72.6%. m.p. 164~165 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.18 (s, 1H), 8.17 (d, J=1.3 Hz, 1H), 8.02 (d, J=0.7 Hz, 1H), 7.80 (d, J=1.3 Hz, 1H), 7.77 (d, J=0.8 Hz, 1H), 7.61 (d, J=8.4 Hz, 2H), 7.17 (d, J=8.3 Hz, 2H), 3.87 (s, 3H), 2.28 (s, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 159.7, 140.4, 136.3, 136.3, 134.1, 132.9, 129.2, 127.9, 127.5, 123.5, 120.4, 117.4, 38.8, 20.6; HRMS calcd for C₁₆H₁₄N₃OS [M-H]^- 296.0863, found 296.0864.

  N-(4-(叔丁基)苄基)-4-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)噻吩- 2-甲酰胺(3c):淡黄色液体, 收率82.9%. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.97 (t, J=5.9 Hz, 1H), 8.00 (d, J=1.5 Hz, 1H), 7.96 (d, J=0.8 Hz, 1H), 7.72 (d, J=1.4 Hz, 1H), 7.70 (d, J=0.8 Hz, 1H), 7.35 (d, J=8.3 Hz, 2H), 7.25 (d, J=8.3 Hz, 2H), 4.41 (d, J=5.9 Hz, 2H), 3.85 (s, 3H), 1.26 (s, 9H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 161.4, 149.8, 140.5, 136.8, 136.6, 134.4, 128.2, 127.7, 127.3, 125.6, 123.1, 117.8, 42.8, 39.1, 34.6, 31.6; HRMS calcd for C₂₀H₂₂N₃OS [M-H]^- 352.1489, found 352.1492.

  N-甲基-4-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-N-苯基噻吩-2-甲酰胺(3d):淡黄色液体, 收率87.2%. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 7.80 (s, 1H), 7.57 (d, J=1.5 Hz, 1H), 7.51~7.40 (m, 4H), 7.39~7.31 (m, 2H), 6.85 (d, J=1.5 Hz, 1H), 3.79 (s, 3H), 3.34 (s, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 161.5, 143.9, 138.0, 136.1, 132.8, 130.4, 129.9, 128.3, 128.2, 127.7, 123.4, 117.0, 38.7, 38.7; HRMS calcd for C₁₆H₁₄N₃OS [M-H]^- 296.0863, found 296.0866.

  N-(4-氟苯基乙基)-4-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)噻吩-2-甲酰胺(3e):淡黄色液体, 收率79.3%. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.56 (t, J=5.7 Hz, 1H), 7.96 (s, 1H), 7.89 (d, J=1.4 Hz, 1H), 7.73~7.68 (m, 2H), 7.32~7.24 (m, 2H), 7.16~7.07 (m, 2H), 3.86 (s, 3H), 3.49~3.41 (m, 2H), 2.83 (t, J=7.3 Hz, 2H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 161.6 (d, J=242.1 Hz), 161.1, 140.3, 136.2, 135.6 (d, J=3.1 Hz), 133.9, 130.6 (d, J=7.9 Hz), 127.8, 126.7, 122.6, 117.4, 115.1 (d, J=21.0 Hz), 40.8, 38.7, 34.3; HRMS calcd for C₁₇H₁₅FN₃OS [M-H]^- 328.0925, found 328.0931.

  N-(4-氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)噻吩-2-甲酰胺(3f):白色固体, 收率82.5%. m.p. 172~173 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.40 (s, 1H), 8.19 (d, J=1.4 Hz, 1H), 8.05 (d, J=0.7 Hz, 1H), 7.86 (d, J=1.3 Hz, 1H), 7.82~7.76 (m, 3H), 7.44 (d, J=8.9 Hz, 2H), 3.89 (s, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 160.0, 139.9, 137.8, 136.3, 134.2, 128.8, 128.0, 127.9, 127.5, 124.0, 121.9, 117.3, 38.8; HRMS calcd for C₁₅H₁₁ClN₃OS [M-H]^- 316.0317, found 316.0320.

  5-溴-N-甲基-4-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-N-苯基噻吩- 2-甲酰胺(5a):淡黄色固体, 收率69.3%. m.p. 95~96 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.00 (s, 1H), 7.50 (s, 1H), 7.48~7.41 (m, 3H), 7.37 (d, J=7.5 Hz, 2H), 6.72 (s, 1H), 3.78 (s, 3H), 3.28 (s, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 160.2, 143.1, 137.6, 136.9, 132.5, 132.4, 130.1, 128.9, 128.8, 128.5, 114.8, 111.3, 38.8, 38.6; HRMS calcd for C₁₆H₁₃BrN₃OS [M-H]^- 373.9968, found 373.9969.

  5-溴-4-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-N-(4-氟苯乙基)噻吩- 2-甲酰胺(5b):淡黄色液体, 收率78.5%. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.64 (t, J=5.6 Hz, 1H), 8.18 (s, 1H), 7.84 (s, 1H), 7.80 (s, 1H), 7.31~7.23 (m, 2H), 7.17~7.07 (m, 2H), 3.90 (s, 3H), 3.53~3.40 (m, 2H), 2.82 (t, J=7.3 Hz, 2H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 160.7 (d, J=242.2 Hz), 159.8, 140.2, 137.1, 135.5 (d, J=3.1 Hz), 133.7, 130.6 (d, J=8.0 Hz), 128.9, 128.4, 115.3, 115.1 (d, J=21.0 Hz), 110.1, 40.9, 38.8, 34.2; HRMS calcd for C₁₇H₁₄BrFN₃OS [M-H]^- 406.0031, found 406.0035.

  5-溴-4-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-N-(对甲苯基)噻吩-2-甲酰胺(5c):白色固体, 收率82.1%. m.p. 210~211 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆)δ: 10.22 (s, 1H), 8.24 (s, 1H), 8.12 (s, 1H), 7.87 (d, J=0.8 Hz, 1H), 7.58 (d, J=8.5 Hz, 2H), 7.17 (d, J=8.2 Hz, 2H), 3.92 (s, 3H), 2.28 (s, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 158.7, 140.4, 137.2, 135.9, 133.9, 133.2, 129.3, 129.3, 128.9, 120.4, 115.2, 111.1, 38.9, 20.6; HRMS calcd for C₁₆H₁₃BrN₃OS [M-H]^- 373.9968, found 373.9962.

  5-溴-N-(4-(叔丁基)苄基)-4-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)噻吩-2-甲酰胺(5d):淡黄色液体, 收率78.5%. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 9.03 (t, J=5.8 Hz, 1H), 8.19 (s, 1H), 7.95 (s, 1H), 7.80 (s, 1H), 7.36 (d, J=8.4 Hz, 2H), 7.24 (d, J=8.4 Hz, 2H), 4.40 (d, J=5.8 Hz, 2H), 3.90 (s, 3H), 1.26 (s, 9H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 160.1, 149.5, 140.1, 137.1, 136.1, 133.8, 128.8, 128.6, 127.4, 125.2, 115.3, 110.2, 42.4, 38.8, 34.3, 31.3; HRMS calcd for C₂₀H₂₁BrN₃OS [M-H]^- 430.0594, found 430.0598.

  5-氯-N-甲基-4-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-N-苯基噻吩- 2-甲酰胺(7a):淡黄色固体, 收率79.7%. m.p. 105~106 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.06 (s, 1H), 7.55 (s, 1H), 7.52 (d, J=7.2 Hz, 3H), 7.46~7.41 (m, 2H), 6.84 (s, 1H), 3.84 (s, 3H), 3.35 (s, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 160.5, 143.5, 137.2, 135.1, 132.0, 130.5, 130.3, 129.3, 128.9, 126.1, 114.4, 39.2, 39.1; HRMS calcd for C₁₆H₁₃ClN₃OS [M-H]^- 330.0473, found 330.0481.

  N-(4-(叔丁基)苄基)-5-氯-4-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)噻吩-2-甲酰胺(7b):淡黄色液体, 收率78.5%. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 9.03 (t, J=5.9 Hz, 1H), 8.19 (s, 1H), 7.94 (s, 1H), 7.80 (s, 1H), 7.36 (d, J=8.4 Hz, 2H), 7.24 (d, J=8.4 Hz, 2H), 4.40 (d, J=5.8 Hz, 2H), 3.90 (s, 3H), 1.26 (s, 9H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 160.1, 149.5, 140.1, 137.1, 136.1, 133.8, 128.8, 128.6, 127.4, 125.2, 115.3, 110.2, 42.4, 38.8, 34.3, 31.3; HRMS calcd for C₂₀H₂₁ClN₃OS [M-H]^- 388.1245, found 388.1249.

  5-氯-N-(4-氟苯乙基)-4-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)噻吩- 2-甲酰胺(7c):淡黄色液体, 收率69.2%. ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 8.66 (t, J=5.6 Hz, 1H), 8.18 (s, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.79 (d, J=0.8 Hz, 1H), 7.31~7.23 (m, 2H), 7.15~7.07 (m, 2H), 3.90 (s, 3H), 3.49~3.41 (m, 2H), 2.82 (t, J=7.3 Hz, 2H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 161.4 (d, J=241.4 Hz), 160.5, 137.7, 137.4, 135.9 (d, J=3.2 Hz), 131.5, 131.0 (d, J=8.0 Hz), 129.4, 128.0, 125.1, 115.5 (d, J=20.8 Hz), 114.8, 41.3, 39.2, 34.6; HRMS calcd for C₁₇H₁₄ClFN₃OS [M-H]^- 362.0536, found 362.0534.

  5-氯-N-(3-甲氧基苯基)-4-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)噻吩-2-甲酰胺(7d):黄色固体, 收率81.3%. m.p. 159~160 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.27 (s, 1H), 8.24 (s, 1H), 8.20 (s, 1H), 7.86 (s, 1H), 7.38 (s, 1H), 7.31~7.25 (m, 2H), 6.75~6.68 (m, 1H), 3.92 (s, 3H), 3.76 (s, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 160.0, 159.3, 140.0, 137.7, 137.5, 131.8, 130.1, 129.5, 129.1, 126.2, 114.8, 112.9, 110.1, 106.4, 55.6, 39.3; HRMS calcd for C₁₆H₁₃ClN₃O₂S [M-H]^- 346.0423, found 346.0422.

  5-氯-N-(2, 4-二氟苯基)-4-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)噻吩-2-甲酰胺(7e):白色固体, 收率65.5%. m.p. 192~193 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.29 (s, 1H), 8.26 (s, 1H), 8.22 (s, 1H), 7.87 (s, 1H), 7.68~7.56 (m, 1H), 7.45~7.36 (m, 1H), 7.22~7.12 (m, 1H), 3.94 (s, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 160.0 (d, J=243.2 Hz), 159.6, 156.4 (d, J=262.8 Hz), 137.5, 136.5, 131.8, 129.8, 129.5, 128.8 (d, J=7.3 Hz), 126.4, 121.8 (dd, J=12.6, 3.5 Hz), 111.9 (dd, J=22.2, 3.5 Hz), 114.7, 105.1 (d, J=24.7 Hz), 39.3; HRMS calcd for C₁₅H₉Cl- F₂N₃OS [M-H]^- 352.0128, found 352.0132.

  5-氯-N-(4-甲氧基苯基)-4-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)噻吩-2-甲酰胺(7f):浅棕色固体, 收率85.9%. m.p. 180~182 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.24 (s, 1H), 8.26 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 7.88 (s, 1H), 7.63 (d, J=9.0 Hz, 2H), 6.98 (d, J=9.1 Hz, 2H), 3.95 (s, 3H), 3.78 (s, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 158.9, 156.3, 138.0, 137.5, 131.8, 131.7, 129.4, 128.8, 125.8, 122.4, 114.8, 114.4, 55.7, 39.2; HRMS calcd for C₁₆H₁₃ClN₃O₂S [M-H]^- 346.0426, found 346.0429.

  5-氯-4-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-N-(3-硝基苯基)噻吩- 2-甲酰胺(7g):黄色固体, 收率41.3%. m.p. 210~211 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.74 (s, 1H), 8.67 (t, J=2.2 Hz, 1H), 8.25 (s, 1H), 8.23 (s, 1H), 8.17~ 8.13 (m, 1H), 8.00~7.95 (m, 1H), 7.86 (d, J=0.8 Hz, 1H), 7.68 (t, J=8.2 Hz, 1H), 3.92 (s, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 159.3, 148.0, 139.7, 137.1, 136.4, 131.5, 130.4, 129.4, 129.1, 126.5, 126.1, 118.6, 114.4, 114.2, 38.9; HRMS calcd for C₁₅H₁₀ClN₄O₃S [M-H]^- 361.0168, found 361.0174.

  5-氯-N-(4-氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)噻吩-2-甲酰胺(7h):白色固体, 收率78.4%. m.p. 197~198 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.43 (s, 1H), 8.24 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 7.86 (s, 1H), 7.74 (d, J=8.9 Hz, 2H), 7.43 (d, J=8.9 Hz, 2H), 3.92 (s, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 158.9, 137.4, 137.1, 137.0, 131.4, 129.1, 129.0, 128.8, 127.8, 126.0, 121.9, 114.3, 38.9; HRMS calcd for C₁₅H₁₀Cl₂N₃OS [M-H]^- 349.9927, found 349.9953.

  5-氯-4-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-N-(4-(三氟甲氧基)苯基)噻吩-2-甲酰胺(7i):白色固体, 收率68.3%. m.p. 155~157 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.49 (s, 1H), 8.24 (s, 1H), 8.19 (s, 1H), 7.86 (s, 1H), 7.82 (d, J=9.1 Hz, 2H), 7.39 (d, J=8.5 Hz, 2H), 3.92 (s, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 159.0, 144.2 (d, J=2.0 Hz) 137.7, 137.1, 136.9, 131.4, 129.1, 129.0, 126.1, 121.8, 121.7, 120.2 (d, J=255.7 Hz), 114.3, 38.9; HRMS calcd for C₁₆H₁₀ClF₃N₃O₂S [M-H]^- 400.0140, found 400.0142.

  5-氯-N-(2-氟苯基)-4-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)噻吩-2-甲酰胺(7j):白色固体, 收率62.7%. m.p. 172~173 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.25 (s, 1H), 8.23 (s, 2H), 7.86 (s, 1H), 7.61 (t, J=7.7 Hz, 1H), 7.37~7.18 (m, 3H), 3.92 (s, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 159.1, 155.6 (d, J=247.1 Hz), 137.1, 136.3, 131.4, 129.2 (d, J=29.8 Hz), 127.3 (d, J=7.7 Hz), 127.0 (d, J=1.6 Hz), 125.9, 125.0, 124.8, 124.6 (d, J=3.7 Hz), 116.1 (d, J=19.8 Hz), 114.4, 38.9; HRMS calcd for C₁₅H₁₀ClFN₃OS [M-H]^- 334.0223, found 334.0227.

  N-(4-溴-2-甲基苯基)-5-氯-4-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)噻吩-2-甲酰胺(7k):淡黄色固体, 收率72.4%. m.p. 156~158 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.04 (s, 1H), 8.23 (s, 1H), 8.16 (s, 1H), 7.85 (s, 1H), 7.52 (d, J=2.2 Hz, 1H), 7.42 (dd, J=8.5, 2.3 Hz, 1H), 7.29 (d, J=8.5 Hz, 1H), 3.92 (s, 3H), 2.24 (s, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 159.0, 137.1, 136.7, 136.6, 135.0, 133.0, 131.4, 129.1, 129.1, 128.9, 128.5, 125.6, 118.8, 114.3, 38.9, 17.7; HRMS calcd for C₁₆H₁₂BrClN₃OSNa [M+ Na]⁺ 431.9540, found 431.9543.

  5-氯-4-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-N-(对甲苯基)噻吩-2-甲酰胺(7l):白色固体, 收率83.5%. m.p. 182~184 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.23 (s, 1H), 8.23 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 7.85 (s, 1H), 7.58 (d, J=8.4 Hz, 2H), 7.17 (d, J=8.2 Hz, 2H), 3.92 (s, 3H), 2.28 (s, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 158.7, 137.5, 137.1, 135.9, 133.2, 131.3, 129.3, 129.1, 128.6, 125.6, 120.4, 114.4, 38.9, 20.6; HRMS calcd for C₁₆H₁₃ClN₃OS [M-H]^- 330.0473, found 330.0478.

  N-(4-溴苯基)-5-氯-4-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)噻吩-2-甲酰胺(7m):淡黄色固体, 收率77.6%. m.p. 192~193 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.43 (s, 1H), 8.24 (s, 1H), 8.19 (s, 1H), 7.86 (s, 1H), 7.69 (d, J=8.9 Hz, 2H), 7.56 (d, J=8.9 Hz, 2H), 3.92 (s, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 158.9, 137.9, 137.1, 137.0, 131.8, 131.4, 129.1, 129.0, 126.0, 122.2, 115.9, 114.3, 38.9; HRMS calcd for C₁₅H₁₀BrClN₃OS [M-H]^- 393.9422, found 393.9433.

  5-氯-4-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-N-(2-(三氟甲氧基)苯基)噻吩-2-甲酰胺(7n):白色固体, 收率64.6%. m.p. 192~194 ℃; ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ: 10.33 (s, 1H), 8.23 (s, 2H), 7.85 (s, 1H), 7.62 (dd, J=7.8, 1.9 Hz, 1H), 7.52~7.35 (m, 3H), 3.92 (s, 3H); ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d₆) δ: 159.2, 142.6 (d, J=1.6 Hz), 137.1, 136.2, 131.4, 129.8, 129.3, 129.1, 128.3, 127.9, 127.6, 121.7, 120.2 (d, J=257.4 Hz), 114.3, 38.9; HRMS calcd for C₁₆H₁₀ClF₃N₃O₂S [M-H]^- 400.0140, found 400.0147.

  3.3   目标化合物抑菌活性

  使用菌丝体生长抑制方法测试了目标化合物对6种真菌的抑菌活性^[20].水稻纹枯病菌、小麦赤霉病菌、马铃薯早疫病菌、油菜菌核病菌、水稻恶苗病菌和草莓灰霉病菌由浙江大学农药与环境毒理研究所提供.用分析天平称取一定质量的目标化合物, 溶解于含有质量分数为1%的吐温-80乳化剂的DMF中, 用灭菌的蒸馏水稀释备用, 将稀释液加入马铃薯琼脂糖(PDA)培养基中, 使目标化合物浓度为50 μg/mL, 将不含目标化合物的稀释液加入PDA培养基作为空白对照, 含SDHI类杀菌剂噻呋酰胺和啶酰菌胺稀释液的PDA培养基作为阳性对照.在PDA培养2 d的真菌菌落边缘取直径5 mm的新鲜菌碟, 接种上述三种PDA培养基上, 在25 ℃下培养72 h后测量真菌群落直径, 设三个重复, 抑菌效果取平均值.

  药效计算公式:抑制率(%)=(对照组直径-处理菌落直径)/(对照组直径-菌饼直径)×100%

  对普筛效果较好的部分目标化合物, 使用菌丝体生长抑制方法^[21], 对水稻纹枯病菌、马铃薯早疫病菌、小麦赤霉病菌和草莓灰霉病菌进行抑菌活性测定.目标化合物浓度梯度设置为100、50、25、12.5和6.25 μg/mL, SDHI类阳性对照药噻呋酰胺对水稻纹枯病的抑制活性较高, 故设浓度梯度为1、0.5、0.25、0.125、0.0625 μg/mL, 每个浓度三次重复, 48 h后统计菌落直径.使用IBM SPSS Statistics 20.0软件计算半最大效应浓度(EC₅₀).

  3.4   分子对接研究

  为研究目标化合物抑制作用方式, 进行了分子对接研究, 方法参考刘幸海等^{[7, 22]}的研究工作, 将活性最强的目标化合物7c对接到SDH酶的活性口袋.在Protein Data Bank数据库下载琥珀酸脱氢酶的结构(PDB代码: 2FBW)^[23], 使用软件Discovery Studio 2.5绘制目标化合物分子结构, 并进行能量最小化优化.对受体蛋白进行预处理去除受体蛋白的水分子, 定义对接位点, 然后执行对接程序^[6], 根据人工视觉和对接构象分布挑选最佳构象.

  辅助材料(Supporting Information)  化合物2、4、6、3a~3f、5a~5d和7a~7n的¹H NMR和¹³C NMR谱图.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.

  
  
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  图 1  代表性的吡唑甲酰胺类杀菌剂

  Figure 1  Representative pyrazole carboxamide fungicides

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  图式 1  目标化合物设计策略

  Scheme 1  Design strategy of the target compounds

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  图式 2  目标化合物的合成路线

  Scheme 2  Synthetic route of target compounds

  Reaction conditions: (a) (1) Pb(PPh₃), K₃PO₄•H₂O, DMF, 100 ℃; (2) NaOH, H₂O, MeOH, r.t.; (b) NBS, DCM; (c) NCS, DCM; (d) (1) (COCl)₂, DMF, r.t.; (2) amine, triethylamine, DCM, r.t.

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  图 2  通过X射线衍射测定的7i的晶体结构

  Figure 2  Crystal structure for 7i by X-ray diffraction determination

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  图 3  化合物7c的结合模式

  Figure 3  Docking mode of compounds 7c

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  表 1  目标化合物(50 μg/mL)对6种植物病原菌的抑制率(%)^a

  Table 1.  Inhibition rate (%) of target compounds (50 μg/mL) against 6 phytopathogenic fungi

  Compd.	水稻纹枯病菌	小麦赤霉病菌	马铃薯早疫病菌	油菜菌核病菌	水稻恶苗病菌	草莓灰霉病菌
  3a	69.3	58.3	43.2	26.7	26.8	61.4
  3b	76.2	47.6	45.1	34.3	35.8	51.5
  3c	78.3	66.2	75.6	55.9	60.8	81.4
  3d	74.0	46.1	57.2	76.0	51.4	82.5
  3e	44.3	65.6	22.1	39.6	19.1	62.9
  3f	81.5	71.3	82.4	40.4	19.1	53.1
  5a	56.2	45.5	42.1	30.9	12.8	64.3
  5b	82.3	82.1	58.7	27.3	11.5	87.1
  5c	19.0	22.3	18.7	16.6	16.8	57.3
  5d	35.1	42.5	37.4	30.9	18.6	34.4
  7a	47.8	54.6	59.6	33.7	4.0	59.6
  7b	71.2	55.9	38.8	38.1	14.6	75.5
  7c	92.7	80.6	63.4	57.8	14.2	75.9
  7d	40.3	20.6	27.2	21.8	28.0	67.9
  7e	35.3	19.3	19.1	17.4	9.7	56.7
  7f	52.2	39.0	35.4	8.3	15.5	66.1
  7g	49.8	39.6	38.4	28.7	14.6	28.6
  7h	88.6	79.5	76.9	65.7	54.2	94.8
  7i	21.2	30.3	60.8	13.0	40.8	66.1
  7j	83.2	88.7	81.6	41.1	41.3	87.2
  7k	48.2	33.1	52.3	15.7	21.7	79.5
  7l	15.3	38.3	32.8	28.7	31.0	45.6
  7m	32.1	45.2	25.8	15.8	9.3	70.8
  7n	45.6	61.2	76.3	44.0	9.8	59.5
  噻呋酰胺b	96.5	97.1	61.4	50.9	15.2	85.3
  啶酰菌胺b	96.2	90.8	92.5	55.1	30.1	82.1
  a Average of three replicates. b Used as a positive control

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  表 2  目标化合物对4种植物病原菌的测定结果

  Table 2.  Results of target compounds against 4 phytopathogenic fungi

  Compd.	病菌	EC50a/(μmol•L-1)
  3f	水稻纹枯病菌	77.9±7.9
  5b	水稻纹枯病菌	42.9±4.1
  7c	水稻纹枯病菌	11.6±0.6
  7h	水稻纹枯病菌	34.2±3.3
  7j	水稻纹枯病菌	73.1±12.9
  3c	马铃薯早疫病菌	88.8±7.2
  3f	马铃薯早疫病菌	49.5±2.8
  5b	马铃薯早疫病菌	43.0±3.1
  7c	马铃薯早疫病菌	50.8±1.6
  7h	马铃薯早疫病菌	66.3±3.2
  7j	马铃薯早疫病菌	87.1±8.4
  7n	马铃薯早疫病菌	87.8±6.7
  3f	小麦赤霉病菌	44.7±3.9
  5b	小麦赤霉病菌	54.7±5.8
  7c	小麦赤霉病菌	43.2±1.6
  7h	小麦赤霉病菌	102.6±10.2
  7j	小麦赤霉病菌	28.9±1.3
  3c	草莓灰霉病菌	43.5±1.6
  3d	草莓灰霉病菌	71.3±5.3
  5b	草莓灰霉病菌	38.0±2.4
  7c	草莓灰霉病菌	67.8±0.9
  7h	草莓灰霉病菌	21.3±1.8
  7j	草莓灰霉病菌	36.6±0.9
  7k	草莓灰霉病菌	66.1±6.9
  噻呋酰胺b	水稻纹枯病菌	0.5±0.2
  噻呋酰胺b	马铃薯早疫病菌	52.9±1.3
  噻呋酰胺b	小麦赤霉病菌	2.7±0.4
  噻呋酰胺b	草莓灰霉病菌	19.7±0.1
  a Average of three replicates. b Used as a positive control.

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