铜是一种普遍存在于自然界的金属元素, 也是人体及动植物必需的微量元素之一, 对生命体的新陈代谢具有重要的调节作用[1].铜在细胞中的含量仅次于锌和铁, 主要以金属酶的形式参与生命体系中的电子传递及氧化还原等过程.铜还广泛应用于冶金、染料、信息工程和医药生物等领域, 铜金属和铜盐的大量使用, 导致过量的铜元素排放到环境中, 对生态环境和人类健康带来了巨大的危害.人体血液中铜离子的正常含量为100~150 μg/L (15.7~23.6 μmol/L)[2], 铜的摄入过量或缺乏均会引起人体中铜的代谢平衡紊乱, 从而导致各种疾病, 如阿尔茨海默症、帕金森病、Menkes综合症、Wilson病、Prion病和家族遗传性脊侧索硬化等[3].由于铜离子对环境和生命活动影响巨大, 对铜离子的检测, 尤其是跟踪其在生命活动中的过程具有重要意义.
传统检测微量铜离子的方法大多需要贵重仪器和专业的技术人员, 很多方法无法在无创的情况下对生物体系进行检测, 且无法实时检测生物体系中铜离子浓度的变化.由于荧光探针技术具有操作简单、灵敏度高、可实现无创和实时原位检测等优点, 其逐渐成为目前最为方便快捷的检测方法[4].特别是近红外荧光探针(发射波长＞600 nm), 具有组织穿透能力深、光损伤小及活体组织的背景干扰少的优点, 非常适合用于化学生物学研究[5].
荧光探针技术可用于金属离子的实时原位检测, 近些年文献报道了许多铜离子荧光探针, 它们具有高灵敏度和选择性.但是由于铜的顺磁性, 很多探针对铜离子表现出荧光淬灭, 无法用于活体检测, 且大部分探针处于短波长区, 很难穿透活体组织, 生物体中的自发荧光对检测也产生了严重的干扰, 使它们在应用中受到了限制[6].同时, 其他一些铜离子荧光探针也因一些缺点难以应用, 如响应慢、pH值范围窄、在含水介质中荧光较弱和细胞毒性较大等[7], 因此亟待开发更加优良的可用于活体检测的铜离子探针.
黄酮是一类普遍存在于植物中的重要天然产物, 具有多种生理活性[8].一些黄酮由于毒性低, 荧光性质优良, 可用于生物体的检测[9].我们前期工作发现, N, N-二甲氨基黄酮在紫外灯下发出较强的荧光, 可用作荧光基团[10].但是由于其最大发射波长为565 nm, 无法穿透生物组织而用于活体检测.因此, 本工作尝试在黄酮母核上再增加一个苯环, 以2-[6-(N, N-二甲胺基)萘基]-7-羟基-4H-色酮为荧光报告基团, 希望能够将发射波长红移.同时以2-吡啶甲酸酯为识别基团, 设计合成了一种新的铜离子荧光探针.该探针具有合成条件温和、后处理简单及近红外区发射等优势, 并且对铜离子具有较高的灵敏性和选择性.
黄酮的合成方法有很多, 其中查尔酮路线比较简单.该路线以2, 4-二羟基苯乙酮为起始原料, 在碱性条件下与芳香醛缩合, 然后关环生成黄酮.然而在第一步, 2, 4-二羟基苯乙酮与6-二甲氨基-2-萘醛在氢氧化钠或氢氧化钾溶液催化反应时, 产率较低, 副产物较多, 难以提纯分离, 因此改进了合成路线, 产率较高, 提纯方便.该路线以2-氯-1-(2, 4-二羟基苯基)乙酮为起始原料, 与6-二甲氨基-2-萘醛在氢氧化钠的催化下直接生成黄酮5, 然后与2-吡啶甲酸在4-二甲氨基吡啶(DMAP)/N, N-二异丙基碳二亚胺(DIC)的联合催化下, 室温反应生成探针分子6.其结构经过1H NMR、13C NMR、MS和元素分析确证.其中使用的原料6-二甲氨基-2-萘醛价格十分昂贵, 因此我们参考文献[11], 以6-甲氧基萘甲醛为起始原料进行合成(Scheme 1).
Reagents and conditions: (a) HMPA, benzene, n-BuLi, hexane, r.t.; (b) NaOH aq. (w＝10%), r.t., EtOH; (c) DIC/DMAP, CH2Cl2, r.t.
中间体5和探针分子6的最大紫外吸收波长不同, 分别为452和478 nm, 为了考察激发波长对探针分子荧光的影响, 选取这两个波长为激发波长.此外, 由于中间体5中含有羟基, 对环境pH比较敏感, 因此也需要考察pH对中间体5的荧光影响, 以确定适应pH范围. 图 1a和1b分别为452和478 nm激发下, 不同pH对中间体5和探针分子6荧光强度的影响.从图 1中可以看出, 不同的激发波长下, 两图趋势基本相同, 表明激发波长变化对荧光趋势影响不大.当452 nm为激发波长时, 中间体5和探针分子6的荧光强度差别更大, 因此后续测试以452 nm为激发波长.另外, 中间体5在pH 4~9范围内荧光强度变化比较明显, 其在pH＜7时荧光强度较弱, 而在pH＞7时荧光强度明显增强, 这是由于中间体5的羟基在碱性条件下成盐, 羟基由供电子基团变为吸电子基团, 形成“推-拉”效应, 荧光强度增强.在酸性条件下, “推-拉”结构被破坏, 荧光强度较弱.而探针分子6在pH 4~9范围内荧光强度变化不大且均比较微弱, 表明探针6具有较好的稳定性.在pH＝7.4时荧光强度差别比较明显, 因此后续测试均在pH＝7.4的乙腈/ Tris-HCl (V:V＝2:3)溶液中进行.
将探针分子6配制成二甲基亚砜(DMSO)工作液, 测试时用缓冲溶液稀释.向探针6 (10 μmol/L)加入Cu2+ (20 μmol/L)后, 荧光强度随着时间的推移而显著增强, 在150 s左右荧光强度(655 nm)达到最强, 表明该探针对Cu2+的响应较为迅速.探针6加入Cu2+前后的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱如图 2所示.
由图 2a可看出, 探针分子6的最大紫外吸收峰在478 nm, 溶液为橙色; 加入Cu2+后, 最大紫外吸收发生明显蓝移, 为452 nm, 并且肉眼可见溶液的颜色变为淡黄色.由图 2b可看出, 探针分子6的最大发射峰在700 nm, 但强度较弱; 在加入Cu2+后, 最大发射峰为655 nm, 发生明显蓝移且荧光强度明显增强, 同时, 在紫外灯照射下(365 nm), 肉眼可见溶液颜色由紫色变为红色, 表明探针6对Cu2+有荧光响应.
选择性是评价探针性能的一个重要指标, 通常检测体系中多含有其他金属离子, 会干扰对目标离子的识别.因此, 考察了探针分子6对其他金属的响应.向探针分子6 (10 μmol/L)的缓冲体系中分别加入不同的金属离子(20 μmol/L), 混合均匀, 并静置15 min后, 记录体系的光谱数据. 图 3a和3b分别为加入不同金属离子的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱.
紫外-可见光谱显示, 探针6在加入Cu2+后, 最大吸收峰蓝移, 而加入其它金属离子后未见明显变化.荧光光谱显示, 加入Cu2+后, 最大发射峰由700 nm蓝移到655 nm, 体系荧光强度显著增强.而加入其它金属离子后, 荧光强度没有明显变化.结果表明, 探针6能够特异性识别Cu2+.此外, 测试了探针在其他金属离子存在下对Cu2+的荧光响应情况.先在探针6 (10 μmol/L)的缓冲体系中分别加入K+、Na+、Fe2+等金属离子(20 μmol/L), 混合均匀、静置15 min后测其荧光光谱.再分别加入Cu2+后记录荧光, 结果如图 4.从图中可以发现, 在其他金属离子的共存的情况下, 探针对Cu2+仍具有良好的荧光响应.上述结果表明探针6对Cu2+具有较高的选择性, 可以在多种金属离子共存的条件下检测Cu2+.
探针灵敏性可以通过检测限来评价, 因此进行了荧光滴定实验.在探针6 (10 μmol/L)的缓冲体系中加入不同浓度的Cu2+ (0~20 μmol/L). 15 min后测其荧光数据, 以Cu2+浓度为横坐标, 荧光强度为纵坐标作图(图 5).从图可知, 随着Cu2+浓度的增加, 荧光强度逐渐增加, 呈现良好的线性关系.根据检测限(LOD)计算公式: LOD＝3×SD/K (3为设定的置信参数, SD为未加Cu2+时荧光变化的标准偏差, K为线性关系斜率), 利用Origin软件拟合实验数据, 计算得到检测限为3.2×10－8 mol/L.
荧光探针的设计可利用可断裂活性键或利用保护-去保护反应, 这种设计思路是基于金属离子催化特殊化学键(如酯键、酰胺键等)的水解断裂, 同时伴随着光谱的变化[12].有文献报道, Cu2+能够促进2-吡啶甲酸酯的水解[13], 为了证实探针6在Cu2+的催化下水解生成前体5, 我们采用核磁和质谱进行了确证.通过核磁共振图谱(图 6)可以发现, 探针6中加入Cu2+后的1H NMR与中间体5的1H NMR谱图基本一致, 质谱也得到了相同的分子离子峰.同时, 从紫外和荧光光谱图可以看到, 探针6在加入Cu2+后与中间体5的最大吸收峰和最大发射峰基本相同(图 7).因此可以确定, 探针6在Cu2+的存在下催化酯键水解, 生成了中间体5导致荧光增强, 催化机理如Scheme 2所示.
采用噻唑蓝(MTT)法测试了中间体5和探针6对Hela细胞(人宫颈癌细胞)生存率的影响, 测试浓度为1、5、10、50和100 μmol/L, 结果见图 8.由图可见, 探针6在低浓度时(1、5和10 μmol/L)细胞生存率均大于80%.在较高浓度时(50和100 μmol/L), 细胞存活率均大于60%, 分别为79.3%和66.7%.而中间体5的细胞毒性随着浓度增加变化更小, 在100 μmol/L浓度下, 细胞生存率仍超过80%.这些结果表明中间体5和探针6对Hela细胞的毒性不大, 因此在检测浓度下不会对细胞的生存造成影响.
为了测试探针的生物应用价值, 用探针6对Hela细胞中铜离子进行了荧光成像(图 9).将Hela细胞在37 ℃下与探针6 (10 μmol/L)孵育30 min, 并用磷酸缓冲液(PBS)洗涤3次, 然后通过激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)拍照, 照片显示细胞内无明显荧光信号.然后加入CuSO4 (50 μmol/L)孵育30 min, 用PBS洗涤3次后, 再次用CLSM拍照, 可观察到细胞内红色荧光信号明显增强.通过明场图与荧光的叠加图(图 9, 右下)可以确定染色区域是在细胞内, 同时可以说明探针6可以透过细胞膜.图中显示红色主要富集在细胞质中, 表明该探针可以用于活细胞的细胞质中铜离子荧光成像.
(a) without Cu2+, (b) after addition of Cu2+, (c) bright field (d) merge
以2-[6-(N, N-二甲胺基)萘基]-7-羟基-4H-色酮为荧光报告基团, 2-吡啶甲酸酯为识别基团, 设计合成了一种可识别铜离子的近红外荧光探针.该探针可特异性识别Cu2+, 且不受其他金属离子的干扰, 具有较高的灵敏性.机制研究表明, 该探针经Cu2+催化水解可生成强荧光的黄酮中间体.并且该探针可用于活细胞中Cu2+的荧光成像, 在生物和环境监测方面具有潜在的应用价值.
Bruker AV-300型核磁共振仪(德国Bruker公司); AmaZon SL型液相色谱-质谱联用仪(德国Bruker公司); Q Exactive Plus高分辨质谱仪(美国Thermo公司); X-6型显微熔点仪(中国精科公司, 温度计未校正); WFH- 204B型手提紫外灯(中国沪粤明公司); UV-2600型紫外-可见分光光度计(日本岛津公司); Cary Eclipse荧光光谱仪(美国Agilent公司).
6-甲氧基-2-萘醛(AR)、2-吡啶甲酸(AR), 上海阿拉丁试剂有限公司; 正丁基锂(己烷溶液, 1.6 mol/L)、六甲基磷酰三胺(HMPA)、N, N-二异丙基碳二亚胺(DIC, AR)、4-二甲氨基吡啶(DMAP, AR), 北京百灵威科技有限公司; 氢氧化钠、乙醇、甲醇和二氯甲烷等试剂均为国产市售分析纯, 未经进一步处理.
将二甲胺的四氢呋喃(THF)溶液(2 mmol/L, 8 mL)加入到干燥的苯和HMPA(体积比1:1)的混合溶液中(10 mL).在氮气保护下, 冰盐浴冷却条件下加入10 mL的n-BuLi (1.6 mol/L的己烷溶液, 16.0 mmol). 15 min后加入6-甲氧基-2萘醛(372 mg, 2.0 mmol)的THF溶液.混合物室温搅拌14 h, 反应结束后, 倒入冷的PBS中, 乙醚萃取, 有机层用MgSO4干燥, 过滤, 蒸除溶剂, 剩余物用柱层析分离[V(石油醚):V(乙酸乙酯)＝10:1]得320 mg黄色固体3[11], 产率60%. m.p. 111~113 ℃; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 10.01 (s, 1H), 8.14 (s, 1H), 7.84 (s, 1H), 7.81 (s, 1H), 7.66 (d, J＝8.7 Hz, 1H), 7.18 (d, J＝9.0 Hz, 1H), 6.88 (s, 1H), 3.12 (s, 6H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ: 191.90, 150.75, 138.77, 134.91, 130.84, 126.91, 125.15, 123.60, 116.33, 105.53, 40.46; MS (ESI) m/z: 200.12 [M+H]+.
将2-氯-1-(2, 4-二羟基苯基)乙酮(47 mg, 0.25 mmol)与萘醛3 (74 mg, 0.375 mmol)加入到30 mL无水乙醇中, 在搅拌下缓慢加入的NaOH溶液(w＝10%) 10 mL, 室温下反应24 h, 反应完毕, 用的稀盐酸(w＝10%)调节pH＝7, 继续搅拌4 h, 减压过滤, 粗产物经乙醇重结晶得77 mg红色固体5, 产率93%. m.p. 266~268 ℃; 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 11.20 (s, 1H), 8.25 (s, 1H), 7.96 (d, J＝8.7 Hz, 1H), 7.81 (d, J＝9.3 Hz, 1H), 7.72 (d, J＝8.7 Hz, 1H), 7.63 (d, J＝8.4 Hz, 1H), 7.25 (d, J＝9.0 Hz, 1H), 6.94 (s, 1H), 6.87 (s, 1H), 6.86 (d, J＝1.8 Hz, 1H), 6.73 (d, J＝8.4 Hz, 1H), 3.05 (s, 6H); 13C NMR (75 MHz, DMSO-d6) δ: 181.18, 167.57, 166.23, 149.54, 146.48, 135.25, 131.99, 129.68, 127.77, 126.53, 125.81, 125.67, 125.17, 116.49, 113.19, 112.95, 111.87, 105.17, 98.67, 40.07; MS (ESI－) m/z: 330.1 [M－H]－; HRMS (ESI) calcd for C21H17NO3Na [M+Na]+ 354.11006, found 354.10971.
将中间体5 (0.066 g, 0.2 mmol)、2-吡啶甲酸(0.030 g, 0.24 mmol)、4-二甲氨基吡啶(0.007 g, 0.06 mmol)和二氯甲烷(20 mL)加入到50 mL圆底烧瓶中, 在搅拌下加入DIC (0.030 g, 0.24 mmol), 室温反应24 h.反应完毕, 减压浓缩, 残余物通过柱层析分离[V(二氯甲烷):V(甲醇)＝100:1], 再用无水乙醇重结晶, 得45 mg 2-[6-(二甲胺基)萘基-2-基]-4-氧代-4H-苯并吡喃-7-基吡啶甲酸酯(6), 红色固体, 产率52%. m.p. 201~203 ℃; 1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 8.81 (d, J＝4.8 Hz, 1H), 8.24 (d, J＝7.8 Hz, 1H), 8.09 (s, 1H), 7.91~7.85 (m, 2H), 7.81 (d, J＝8.4 Hz, 1H), 7.69 (d, J＝9.0 Hz, 1H), 7.59 (d, J＝8.7 Hz, 1H), 7.55~7.50 (m, 1H), 7.30 (d, J＝1.8 Hz, 1H), 7.09~7.04 (m, 2H), 6.97 (s, 1H), 6.80 (s, 1H), 3.02 (s, 6H); 13C NMR (75 MHz, CDCl3) δ: 183.14, 166.38, 163.25, 157.25, 150.41, 146.97, 146.71, 137.49, 135.98, 133.04, 130.18, 128.48, 127.94, 126.87, 126.26, 125.59, 120.29, 117.56, 116.39, 115.29, 107.12, 40.69; MS (ESI) m/z: 437.06 [M+H]+. Anal. calcd for C27H20N2O4: C 74.30, H 4.62, N 6.42; found C 74.54, H 4.49, N 6.67.
向一系列测试管中, 加入适量探针6储备液(DMSO溶解, 10 mmol/L)和一定体积的金属离子储备液(双蒸水溶解, 10 mmol/L), 用pH＝7.4的乙腈/Tris-HCl (V:V＝2:3)缓冲溶液稀释, 终浓度分别为10和20 μmol/L, 摇匀后放置15 min, 取5 mL样品液置于比色皿中(石英比色皿厚度为1 cm), 记录紫外-可见吸收光谱和荧光光谱.荧光光谱以λex＝452 nm为激发波长, 扫描波长范围为550~850 nm, 狭缝宽度为5 nm.
采用噻唑蓝(MTT)法测试化合物对细胞存活率的影响.取对数生长周期的Hela细胞, 调整细胞数为5×103个/mL加入到96孔板中, 随后在培养板中加入不同浓度的化合物, 每个浓度4个复孔, 在CO2体积分数为5%的恒温箱中于37 ℃培养48 h.然后, 每孔加入50 μL MTT溶液(1 mg/mL), 继续孵育4 h.除去上清液后, 加入100 μL的DMSO, 在室温下溶解晶体产物15 min.用酶标仪测量在570 nm的吸光度.由公式抑制率＝(A对照－A样品)/(A对照－A空白)×100%来计算不同浓度的抑制率, 实验重复三次, 取平均值.
取繁殖期人宫颈癌(Hela)细胞, 在加入100 U/mL青霉素, 100 mg/mL链霉素和体积分数为10%的胎牛血清的DMEM培养液, 在CO2体积分数为5%的恒温箱中于37 ℃培养.将细胞以1×105个/mL的密度接种在直径为30 mm玻璃底培养皿中, 采用激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)进行成像.首先将Hela细胞用10 μmol/L的探针6在37 ℃下孵育30 min, 并用PBS洗涤3次, 然后通过CLSM成像并拍照.然后将细胞与CuSO4 (50 μmol/L)在37 ℃下孵育30 min, 并用PBS洗涤3次, 然后通过CLSM成像并拍照, 激发波长为488 nm.
辅助材料(Supporting Information)中间体及目标化合物的1H NMR和13C NMR图谱以及化合物谱图及探针6对铜离子的时间响应曲线.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.
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图式 1 探针6的合成路线
Scheme 1 Synthetic route of the probe 6
Reagents and conditions: (a) HMPA, benzene, n-BuLi, hexane, r.t.; (b) NaOH aq. (w＝10%), r.t., EtOH; (c) DIC/DMAP, CH2Cl2, r.t.
图 1 激发波长(a) 452和(b) 478 nm下pH对探针分子6 (10 μmol/L)和中间体5 (10 μmol/L)荧光强度的影响
Figure 1 Effects of pH value on the fluorescence intensity of probe 6 (10 μmol/L) and intermediate 5 (10 μmol/L) at excitation wavelength of (a) 452 and (b) 478 nm
图 2 探针6 (10 μmol/L)和加入Cu2+ (20 μmol/L)后探针6的紫外-可见吸收光谱(a)和荧光光谱(b)
Figure 2 UV-Vis absorption (a) and fluorescence intensity (b) spectra of probe 6 (10 μmol/L) in the absence and prescence of Cu2+ (20 μmol/L)
图 3 不同金属离子(20 μmol/L)存在下探针6 (10 μmol/L)的紫外-可见吸收光谱(a)和荧光光谱(b)
Figure 3 UV-Vis absorption (a) and fluorescence intensity (b) spectra of probe 6 (10 μmol/L) in the presence of different metal ions (20 μmol/L)
图 4 不同金属离子(20 μmol/L)对探针6 (10 μmol/L)荧光识别Cu2+的影响
Figure 4 Effects of addition of various metal ions (20 μmol/L) on the Cu2+ fluorescent recognition of probe 6 (10 μmol/L)
图 6 探针6、中间体5及探针6加入Cu2+的核磁共振氢谱图
Figure 6 1H NMR spectra of probe 6, intermediate 5 and probe 6 with Cu2+
图 7 中间体5 (10 μmol/L)和探针6 (10 μmol/L)加入Cu2+ (20 μmol/L)后的紫外-可见吸收光谱(a)和荧光光谱(b)
Figure 7 UV-Vis (a) and fluorescence spectrum (b) of the intermediate 5 (10 μmol/L)and probe 6 (10 μmol/L) with Cu2+ (20 μmol/L)
图 8 不同浓度的中间体5和探针6对Hela细胞的毒性测试
Figure 8 Cytotoxicity of intermediate 5 and probe 6 with different concentrations in Hela cells
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