English

• 活性氧(ROS)是一类高活性物质, 它们普遍存在于生物体中, 在各种生理和病理过程中扮演着至关重要的角色^[1]. ROS主要包括以下几种:过氧化氢(H₂O₂)、单线态氧(¹O₂)、羟基自由基(•OH)、超氧阴离子(•O₂^-)、过氧化亚硝酰(ONOO^-)以及次氯酸(HOCl/ClO^-)^[2].过氧化氢(H₂O₂)是活性氧中的强氧化剂, 也是氧代谢的产物之一.研究表明, 过氧化氢在体内以信号分子的角色在多种信号传递过程中起着关键作用, 在氧化应激过程中同样起到重要作用^[3].越来越多的研究发现, 异常的细胞会产生过量的过氧化氢, 而过量表达的过氧化氢会引起多种疾病, 例如糖尿病^[4]、阿尔兹海默症^[5]和癌症^[6]等, 因此, 快速、准确地检测活细胞中的H₂O₂在疾病诊断和预防方面具有重要意义.

  传统的检测H₂O₂的方法大都是侵入性检测, 会破坏细胞和组织, 并且需要复杂的制备过程和操作过程, 这些缺陷限制了其广泛应用.而荧光成像技术由于灵敏性高、选择性高、时空分辨率高和生物相容性较好, 具有实时监测和无创检测等优点, 在多种活性分子和离子检测方面得到了大量应用研究^[7-12].近年来, 研究者们成功开发了一系列检测H₂O₂的有机小分子荧光探针, 初步实现了细胞和活体内H₂O₂的实时监测, 建立了高灵敏度、高选择性和实时成像的新方法^[13-17].但是已报道的荧光探针都具有一定的局限性, 比如检测限(DL)较高(DL＞100 nmol/L)、量子产率很低(0.02~0.04)、反应时间较长(t＞1 h)等; 另外, 基于荧光强度变化的荧光探针的生物学应用很容易受到激发/发射效率、探针的生物分布及其局部微环境变化等的干扰.以上条件都限制了探针在H₂O₂检测上的应用, 因此, 为了实现对活细胞中H₂O₂更快速、高效、灵敏的检测, 比率型荧光探针的开发得到了广泛关注^[18-22].比率型荧光探针依赖于分析物引起的两个或更多个发射波段强度的变化提供内置校正, 排除了背景荧光和外界干扰源的影响, 提供了准确定量的分析.目前, 比率型荧光探针已经成功实现了在各种离子、生物分子以及细胞凋亡等方面的监测应用^[22-25].

  本工作组设计并合成了一种新型的有机小分子比率型荧光探针HDP-1, 用于特异性检测活细胞中外源和内源性H₂O₂ (Scheme 1), 以1, 8-萘内酰亚胺为原料合成的阳离子化合物1-乙基-2-甲基苯并[cd]吲哚-1-氯化物作为探针骨架, 对羟基苯甲醛作为连接基团, 芳香基硼酸酯作为H₂O₂的特异性识别基团. 4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯与对羟基苯甲醛以醚键的形式连接形成中间体, 中间体再与1-乙基-2-甲基苯并[cd]吲哚-1-氯化物经过脱水缩合反应合成探针HDP-1.加入H₂O₂后硼酸酯基发生裂解, 形成酚羟基化合物HDP-OH (Scheme 2), 使荧光发射波长蓝移(从618 nm到485 nm).该探针实现了对H₂O₂快速、灵敏地特异性检测, 检测限为67 nmol/L, 荧光量子产率约为0.056.探针HDP-1还表现出较低的细胞毒性, 并且能够成像活细胞中的外源和内源性H₂O₂.

  图式 1

  

  图式 1.  探针HDP-1的合成路线

  Scheme 1.  Synthesis of probe HDP-1

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  图式 2

  

  图式 2.  HDP-1与H₂O₂反应的响应机制

  Scheme 2.  Proposed reaction mechanisms of HDP-1 toward H₂O₂

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  1.   结果与讨论

  1.1   探针HDP-1的设计与合成

  参考文献合成了1-乙基-2-甲基苯并[cd]吲哚-1-氯化物^[26-27].如Scheme 1所示, 以对羟基苯甲醛和4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯为原料, 通过取代反应合成中间HDP-1-M, HDP-1-M与已合成的1-乙基-2-甲基苯并[cd]吲哚-1-氯化物通过脱水缩合反应生成探针HDP-1. 1-乙基-2-甲基苯并[cd]吲哚-1-氯化物和HDP-1的结构都经过¹H NMR, ¹³C NMR, 质谱(MS)或高分辨质谱(HRMS)确证.

  1.2   探针HDP-1的光谱性质

  为了研究探针HDP-1与H₂O₂响应的光学性质, 将HDP-1 (10 μmol/L)与H₂O₂在PBS(磷酸盐缓冲液)溶液[10%二甲基亚砜(DMSO), 10 mmol/L, pH＝7.4]中37 ℃孵育0.5 h, 检测溶液的紫外可见光吸收光谱和荧光发射光谱.如图 1a所示, 反应前探针HDP-1在500 nm附近有一个较高的吸收峰, 随着H₂O₂浓度的升高, 500 nm处的吸收峰明显降低, 并在620 nm处出现一个新的最大吸收峰, 且随着H₂O₂浓度的增加而增强.随后检测了探针HDP-1与H₂O₂反应前后的荧光光谱变化, 发现当激发波长为420 nm时, 未添加H₂O₂的HDP-1在618 nm处有较强的荧光发射, 而在485 nm处只有微弱的荧光.随着H₂O₂浓度不断增加(0~500 μmol/L), 618 nm处的荧光逐渐减弱, 485 nm处的荧光强度逐渐增强, 荧光发射表现出较大的蓝移(133 nm), 使溶液从红色变成蓝色(图 1b), 这表明探针HDP-1有望用于H₂O₂的比率检测.荧光发射比率(I₄₈₅/I₆₁₈)从0.15增加到12.02, 增强了约80倍(图 1c).发射比率(I₄₈₅/I₆₁₈)在0~200 μmol/L浓度范围内表现出较好的线性相关性(R²＝0.9928)(图 1d), 经计算得出检测限低至67 nmol/L(辅助材料中表S1).以上结果表明, HDP-1对生物体系内的H₂O₂的响应具有较高的灵敏度, 能够检测低浓度的H₂O₂.

  图 1

  

  图 1.  在PBS溶液(10% DMSO, 10 mmol/L, pH＝7.4)中, (a)探针HDP-1 (10 μmol/L)与不同浓度的H₂O₂ (0~500 μmol/L)在37 ℃反应0.5 h后的紫外-可见光吸收光谱, (b)探针HDP-1 (10 μmol/L)与不同浓度的H₂O₂ (0~500 μmol/L)在反应0.5 h后的荧光发射光谱, (c)和(b)中的荧光发射比率I₄₈₅/I₆₁₈, (d) I₄₈₅/I₆₁₈与H₂O₂浓度(0~200 μmol/L)的线性相关性(λ_ex＝420 nm)

  Figure 1.  (a) Absorption spectra of probe HDP-1 (10 μmol/L) in the absence/presence of H₂O₂ (0~500 μmol/L) in PBS buffer (pH＝7.4, 10 mmol/L, 10% DMSO), (b) fluorescence spectra of probe HDP-1 (10 μmol/L) in response to H₂O₂ (0~500 μmol/L) in PBS buffer (pH＝7.4, 10 mmol/L, 10% DMSO), (c) the ratio of fluorescence intensity (I₄₈₅/I₆₁₈) of probe HDP-1 (10 μmol/L) with the addition H₂O₂ (0~500 μmol/L) in PBS buffer (pH＝7.4, 10 mmol/L, 10% DMSO), and (d) the linear relationship between I₄₈₅/I₆₁₈ and the concentration of H₂O₂ (0~200 μmol/L) (λ_ex＝420 nm)

  Insert: the color changes of the systems after adding H₂O₂ (500 μmol/L) to the probe HDP-1 (10 μmol/L) under visible light. "—" represents HDP-1 (10 μmol/L) without H₂O₂; "+" represents HDP-1 (10 μmol/L) with H₂O₂ (500 μmol/L)

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  1.3   动力学响应

  考察了HDP-1对H₂O₂的时间响应.如图 2a所示, 在PBS溶液(10% DMSO, 10 mmol/L, pH＝7.4)中, HDP-1在0~60 min内荧光发射比(I₄₈₅/I₆₁₈)都没有明显的变化, 表明了探针HDP-1的稳定性.随着H₂O₂浓度升高, 探针HDP-1在485 nm处的荧光强度逐渐增强, 618 nm处的荧光强度逐渐减弱, HDP-1的发射比I₄₈₅/I₆₁₈在30 min左右趋于稳定(图 2a), 并且表现出良好的线性相关(R²＝0.9981)(图 2b).从上述分析中可以看出, 探针HDP-1可以达到快速响应H₂O₂的目的.

  图 2

  

  图 2.  (a) HDP-1 (10 μmol/L)与H₂O₂ (200 μmol/L)在PBS缓冲液(pH＝7.4, 10 mmol/L, 10% DMSO)中反应后和仅存在HDP-1 (10 μmol/L)的荧光发射比I₄₈₅/I₆₁₈随反应时间的变化, 以及(b) I₄₈₅/I₆₁₈与反应时间(0~30 min)的线性关系(λ_ex＝420 nm)

  Figure 2.  (a) Time-dependent fluorescence intensity ratio (I₄₈₅/I₆₁₈) of HDP-1 (10 μmol/L) in the absence/presence of H₂O₂ (200 μmol/L) in PBS buffer (pH＝7.4, 10 mmol/L, 10% DMSO), and (b) the linear relationship between I₄₈₅/I₆₁₈ and the reaction time with H₂O₂ (0~30 min) (λ_ex＝420 nm)

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  1.4   pH响应

  为了研究pH对探针HDP-1与H₂O₂荧光响应的影响, 在pH 1~14范围内检测了HDP-1对H₂O₂的荧光变化.未添加H₂O₂, HDP-1的荧光发射比I₄₈₅/I₆₁₈都很低(低于0.2), 并且在整个pH范围内没有明显的变化, 表明HDP-1在不同pH下都是比较稳定的.与H₂O₂ (200 μmol/L)反应后, HDP-1在pH 6~8范围内表现出非常显著的比率响应, 并且在pH＝8时达到最大值, 因此HDP-1可以用于检测生理条件下的H₂O₂.

  1.5   选择性研究

  具有较好的选择性是荧光探针必不可少的性能之一.因此, 为了评价HDP-1对H₂O₂的选择性, 检测了探针HDP-1加入不同分析物(H₂O₂、ClO^-、•OH、•O₂^-、^•O^tBu、TBHP、CN^-、CN^-、Cu²⁺、Na⁺、Zn²⁺、Cys、Hcy、GSH)后的荧光光谱响应.如图 3所示, 加入其他分析物后, 探针HDP-1的荧光发射比I₄₈₅/I₆₁₈与对照组相比没有显著变化, 而与H₂O₂ (200 μmol/L)反应后, HDP-1的荧光发射比I₄₈₅/I₆₁₈显著高于对照组和其他分析物组.另外, 在存在上述干扰分析物的情况下, 在HDP-1溶液中加入H₂O₂ (200 μmol/L)进行竞争性实验.结果表明, 干扰物的存在并不会影响探针HDP-1对H₂O₂的荧光响应能力.这一结果证明了探针HDP-1对H₂O₂具有较好的选择性, 并且其性能不易被其他活性物质干扰.

  图 3

  

  图 3.  HDP-1 (10 μmol/L)对不同检测物的荧光响应(I₄₈₅/I₆₁₈)

  Figure 3.  Fluorescence intensity ratio (I₄₈₅/I₆₁₈) of HDP-1 (10 μmol/L) to different detection substances

  (1) Blank, (2) H₂O₂ (200 μmol/L), (3) Cu²⁺ (1 mmol/L), (4) Na⁺(1 mmol/L), (5) Zn²⁺ (1 mmol/L), (6) ClO^- (500 μmol/L), (7) •OH (500 μmol/L), (8) •O₂^- (500 μmol/L), (9) •O^tBu (500 μmol/L), (10) TBHP (500 μmol/L), (11) CN^- (500 μmol/L), (12) HSO₃^- (500 μmol/L), (13) Cys (1 mmol/L), (14) Hcy (1 mmol/L), (15) GSH (1 mmol/L). λ_ex＝420 nm

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  1.6   HDP-1的量子产率(φ_u)

  为了检测加入H₂O₂ (200 μmol/L)后HDP-1的相对荧光量子产率, 选择了香豆素153为参比标准(在乙醇中φ_s=0.38).分别测得香豆素153和待测样品的吸光度(A＜0.05)和荧光光谱, 获得相关数据, 通过计算得出待测样品的量子产率φ_u=0.056.

  1.7   HDP-1的反应机理

  为了探究HDP-1与H₂O₂的响应机制, 对HDP-1与H₂O₂反应后的产物的光谱性质和质谱进行了分析.实验发现, HDP-1与H₂O₂反应后, 在620 nm处有一个最大吸收峰.另外, 在420 nm激发下, 反应体系在485 nm附近也表现出了极强的荧光发射.这与HDP-OH的光谱性质相似.根据以上现象提出了HDP-1与H₂O₂的响应机制猜想(Scheme 2). HDP-1与H₂O₂反应后, 芳香基硼酸酯基团裂解, 探针发生连续的氧化反应和消除反应, 形成了酚羟基化合物HDP-OH, 其分子内电荷转移(ICT)发生改变, π-电子共轭体系也降低, 从而使发射波长从618 nm蓝移到485 nm, 蓝移程度较大(133 nm).通过HDP-1与H₂O₂反应体系中分离的产物的质谱分析, 也印证了这一猜想(HRMS calcd for C₂₁H₁₈NO⁺ 300.1383, found 300.1383).

  1.8   HDP-1在HeLa细胞中的荧光成像

  在荧光成像实验前评价了探针的细胞毒性.结果表明, 探针对人宫颈癌HeLa细胞、人乳腺癌MCF-7细胞和人皮肤成纤维细胞HSF在较高浓度下(0~25 μmol/L)都没有表现出显著的细胞毒性, 这为HDP-1在活细胞中的荧光成像提供了有力的支持.随后采用荧光显微镜探究了探针HDP-1在HeLa细胞中对外源和内源H₂O₂的成像功能.如图 4所示, 在对照组中, 仅用探针HDP-1 (10 μmol/L)与HeLa细胞共培养, 在红色荧光通道(570~625 nm)有较强的荧光发射, 而在绿色荧光通道(497~557 nm)只有很弱的荧光, 几乎观察不到.实验组1用脂多糖(LPS, 10 μg/mL)预处理0.5 h后, 再用HDP-1 (10 μmol/L)与HeLa细胞共培养0.5 h.此时发现红色荧光通道的荧光信号明显减弱, 绿色荧光通道的荧光信号显著增强.实验组2预先采用H₂O₂ (100 μmol/L)处理0.5 h, 再加入HDP-1 (10 μmol/L)与HeLa细胞共培养0.5 h.与实验组1相似的是, 绿色荧光通道的荧光信号能观察到显著的增强, 红色荧光通道的荧光信号则大幅度减弱, 几乎观察不到.研究结果表明, 探针HDP-1具有检测活细胞中外源和内源H₂O₂的潜力.

  图 4

  

  图 4.  不同预处理条件下HDP-1 (10 μmol/L)在HeLa细胞中的共聚焦成像

  Figure 4.  Confocal images of HDP-1 (10 μmol/L) in HeLa cells under different pretreatment conditions

  (a~d) Cells were co-cultured with probe HDP-1 (10 μmol/L), (e~h) cells were co-cultured with probe HDP-1 (10 μmol/L) for 30 min after pre-treatment with LPS (10 μg/mL), and (i~l) cells co-cultured with probe HDP-1 (10 μmol/L) for 30 min after pre-treatment with H₂O₂ (100 μmol/L). Green channel: λ_em=497~557 nm. Red channel: λ_em=570~625 nm.λ_ex=420 nm. Scale bar: 10 μm

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  2.   结论

  综上所述, 设计了一种基于ICT效应的新型的比率型荧光探针HDP-1, 用于H₂O₂特异性检测.该探针以硼酸酯基为H₂O₂识别基团, 能实现对H₂O₂灵敏、快速的特异性识别, 并且伴有肉眼可见的红色到蓝色的颜色变化.荧光发射波长蓝移达到133 nm, 荧光发射比(I₄₈₅/ I₆₁₈)增强达80倍, 检测限低至67 nmol/L.此外, 荧光成像研究表明, 探针HDP-1可以有效地实现活细胞中的内源和外源H₂O₂的低毒性成像.因此, 探针HDP-1在活细胞中H₂O₂的检测具有潜在的应用前景.

  3.   实验部分

  3.1   仪器与试剂

  所有的化学试剂和生物试剂均为市售化学纯或分析纯产品, 除特别说明外, 均不需要进一步处理即可直接使用.基本必需培养基(MEM)和磷酸盐缓冲溶液(PBS)购自KeyGen Biotech(南京, 中国), 胎牛血清(FBS)购自Gibco (Grand Island, NY, USA).采用Quattro micro三重四极杆质谱仪(中科牛津, 武汉, 中国)分析质谱, Agilent 1100 LC/DAD/MSD液质联用仪(Agilent, 美国)进行高分辨质谱(HRMS)分析. ¹H NMR和¹³C NMR在Qone-WNMR-I-AS400核磁共振波谱仪(中科牛津, 武汉, 中国)上进行.使用UV3600 UV-VIS-NIR紫外分光光度计(岛津, 日本)记录吸收光谱.在FluoroMax-4荧光光谱仪(HORIBA, 美国)上收集发射光谱.细胞活力测定在多功能酶标仪(Thermo Fisher, MA, USA)上进行.细胞荧光图像在FV1000激光共聚焦显微镜(Olympus, 日本)上获得.

  3.2   1-乙基-2-甲基苯并[cd]吲哚-1-氯化物的合成

  1, 8-萘内酰胺(8.03 g, 47.4 mmol)溶于100 mL N, N-二甲基甲酰胺(DMF), 在冰浴条件下缓慢加入氢化钠(3.528 g, 150 mmol).体系冷却至室温后逐滴加入碘乙烷(7.403 g, 50 mmol), 室温下搅拌0.5 h.硅胶柱层析分离后, 旋干液体得到7.762 g 1-乙基苯并[cd]吲哚- 2(1H)-酮(黄色固体, 收率83%), 直接用于下一步反应.

  将1-乙基苯并[cd]吲哚-2(1H)-酮(1.972 g, 10 mmol)和甲基氯化镁(15 mL, 45 mmol)溶于无水四氢呋喃(THF) (40 mL)中, 在氮气保护下, 60 ℃加热回流至反应完全.将反应液冷却到室温, 加入少量水猝灭, 然后用NaOH溶液(1 mol/L)将反应液的pH调至碱性, 用乙酸乙酯萃取(30 mL乙酸乙酯萃取3次); 向所得有机相中加入少量HCl溶液(1 mol/L), 将pH调至酸性, 用少量水萃取(20 mL水萃取2次), 取水相; 在水相中加入150 mL丙酮并搅拌, 固体析出后进行抽滤, 并用丙酮淋洗固体; 40 ℃烘干, 得到1.753 g 1-乙基-2-甲基苯并[cd]吲哚-1-氯化物^[28-30], 收率76%. m.p. 159~160 ℃; ¹H NMR (400 MHz, MeOD) δ: 8.93 (d, J＝7.3 Hz, 1H), 8.79 (d, J＝8.1 Hz, 1H), 8.47 (d, J＝6.3 Hz, 1H), 8.46 (d, J＝7.1 Hz, 1H), 8.23~8.16 (m, 1H), 8.07~8.02 (m, 1H), 4.83~4.79 (m, 2H), 3.36~3.34 (m, 3H), 1.72 (t, J＝7.4 Hz, 3H); ¹³C NMR (100 MHz, D₂O) δ: 170.7 (s), 138.3 (s), 137.3 (s), 134.3 (s), 130.8 (s), 130.5 (s), 129.4 (s), 128.1 (s), 127.7 (s), 121.4 (s), 120.4 (s), 42.3 (s), 14.5 (s), 12.2 (s); MS [ES-API] m/z: 196.1 [M]⁺.

  3.3   探针HDP-1的合成

  将对羟基苯甲醛(0.122 g, 1 mmol)和Na₂CO₃ (0.138 g, 1 mmol)溶于15 mL无水乙腈中, 在60 ℃下搅拌10 min.然后加入4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯(0.328 g, 1.1 mmol)和碘化钾(0.086 g, 0.5 mmol), 在氮气保护下60 ℃搅拌6 h至反应完全.抽滤后加入乙酸乙酯萃取(30 mL乙酸乙酯萃取3次)并取有机相, 浓缩萃取液, 用硅胶柱层析分离纯化[V(石油醚):V(乙酸乙酯)＝6:1]得到0.315 g中间体HDP-1-M, 收率93.2%. ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 9.91 (s, 1H), 7.87 (d, J＝4.2 Hz, 2H), 7.85 (d, J＝5.0 Hz, 2H), 7.45 (d, J＝8.1 Hz, 2H), 7.09 (d, J＝8.7 Hz, 2H), 5.20 (s, 2H), 1.37 (s, 12H). HRMS calcd for C₂₀H₂₃BO₄ 338.1689, found 339.1690.

  将HDP-1-M (0.236 g, 0.7 mmol)和1-乙基-2-甲基苯并[cd]吲哚-1-氯化物(0.116 g, 0.5 mmol)溶于乙醇/乙腈(V:V＝9:1)的混合溶液中, 室温下氮气保护避光搅拌至反应完全.将混合液抽滤, 加入适量石油醚(20 mL乙醚(析出固体, 抽滤得到0.211 g产物HDP-1, 收率76.7%. m.p. 209~210 ℃; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ: 9.55 (s, 1H), 8.81 (d, J＝8.3 Hz, 1H), 8.31 (s, 2H), 8.23 (d, J＝7.2 Hz, 1H), 8.14 (s, 1H), 8.00 (d, J＝7.7 Hz, 1H), 7.88~7.82 (m, 4H), 7.65 (t, J＝7.6 Hz, 1H), 7.33 (d, J＝8.0 Hz, 2H), 6.68 (d, J＝7.3 Hz, 2H), 4.77 (s, 2H), 3.74 (q, J＝7.0 Hz, 2H), 1.57 (s, 3H), 1.37 (s, 12H); ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ: 163.1 (s), 161.9 (s), 155.0 (s), 138.8 (s), 136.2 (s), 135.4 (s), 135.1 (s), 134.3 (s), 131.6 (s), 129.3 (s), 129.0 (s), 128.5 (s), 127.6 (s), 126.4 (s), 123.7 (s), 115.4 (s), 112.7 (s), 83.9 (s), 69.8 (s), 24.9 (s), 15.7 (s). HRMS calcd for C₃₄H₄₅BNO₃ 516.2704, found 516.2704.

  3.4   HDP-1的光谱性质和荧光响应研究

  在DMSO-PBS (V:V＝1:9, 10 mmol/L, pH＝7.4)中, HDP-1 (10 μmol/L)和不同浓度的H₂O₂ (0~500 μmol/L)溶液在37 ℃孵育30 min, 然后检测其紫外-可见光吸收光谱和荧光光谱.在探针HDP-1对H₂O₂的选择性研究中, 其他ROS参照文献[31]方法制得母液.将HDP-1 (10 μmol/L)与H₂O₂ (200 μmol/L)、其他活性氧和活性离子(500 μmol/L)、部分金属离子(1 mmol/L)、氨基酸(1 mmol/L)在DMSO-PBS (V:V＝1:9, 10 mmol/L, pH＝7.4)中37 ℃孵育30 min, 然后记录它们的荧光光谱.

  在探针HDP-1对H₂O₂的时间响应研究中, 分别记录HDP-1 (10 μmol/L)与/不与H₂O₂ (500 μmol/L)孵育的不同时间点(0, 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60 min)的荧光光谱.在探针HDP-1的pH响应研究中, HDP-1 (10 μmol/L)和H₂O₂ (500 μmol/L)在不同pH (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14)的DMSO-PBS (V:V＝1:9, 10 mmol/L)中37 ℃孵育30 min, 记录其荧光光谱.所有荧光光谱都在λ_ex＝420 nm下收集溶液在430~800 nm的荧光发射, 激发和发射狭缝宽度都为5 nm. HDP-1在DMSO中制得1 mmol/L母液再稀释使用.

  3.5   检测限

  对探针HDP-1 (10 μmol/L)(空白组)在420 nm激发下的荧光强度进行3次测定, 获得空白组在618 nm处荧光强度的标准偏差.根据荧光响应中HDP-1 (10 μmol/L)与H₂O₂ (0~200 μmol/L)的线性相关计算检测限(DL).计算公式如下^[32]:

  $ {\rm{DL}} = 3\sigma /k $

  其中σ是空白测量的标准偏差, k是HDP-1 (10 μmol/L)与H₂O₂ (0~200 μmol/L)反应后485与618 nm处荧光强度的比值I₄₈₅/I₆₁₈与不同H₂O₂浓度之间的斜率.

  3.6   量子产率(φ_u)

  以香豆素-153为参比标准, 用以下公式测定量子产率^[33]:

  $ {\varphi _{\rm{u}}} = {\varphi _{\rm{s}}} \cdot \left( {{I_{\rm{u}}}/{I_{\rm{s}}}} \right) \cdot \left( {{\rm{O}}{{\rm{D}}_{\rm{s}}}/{\rm{O}}{{\rm{D}}_{\rm{u}}}} \right) \cdot {\left( {{N_{\rm{u}}}/{N_{\rm{s}}}} \right)^2} $

  其中φ表示量子产率, I表示积分荧光强度, OD表示λ_ex处的吸光度, N表示溶液折射率, s和u分别表示参比品和待测样品.

  3.7   HDP-1对H₂O₂的响应机制

  探针HDP-1 (10 μmol/L)与H₂O₂ (500 μmol/L)在DMSO-PBS (V:V＝1:9, 10 mmol/L, pH＝7.4)中37 ℃孵育30 min, 然后加入少量乙酸乙酯(15 mL乙酸乙酯)萃取3次, 收集有机相, 旋转蒸发除去有机溶剂后, 对产物进行光学性质分析和质谱表征.

  3.8   细胞培养和MTT分析

  HeLa细胞(人宫颈癌细胞)、MCF-7(人乳腺癌细胞), HSF(人皮肤成纤维细胞)均购自KeyGen Biotech(南京, 中国).细胞培养在添加了体积分数为10%胎牛血清、80 U/mL青霉素和0.08 mg/mL链霉素的MEM中, 在体积分数为5% CO₂培养箱中37 ℃培养24 h.

  采用噻唑蓝(MTT)法测定HDP-1对以上三种活细胞的细胞毒性.噻唑蓝购自Solarbio(北京, 中国). HeLa细胞、MCF-7细胞和HSF细胞分别接种在96孔板中, 每孔密度1×10⁴, 在5% CO₂培养箱中37 ℃培养过夜.将不同浓度的HDP-1 (0, 0.25, 0.5, 1, 2.5, 5, 10, 25, 50, 100 μmol/L)加入到细胞中继续培养24 h, 然后将噻唑蓝(20 μmol/L, 5 mg/mL)加入培养基继续孵育4 h.小心地去除培养基, 每孔加入150 μL二甲基亚砜并摇10 min以完全溶解, 最后用多功能酶标仪(Thermo Fisher, MA, USA)测定490 nm处的吸光值, 计算细胞存活率.

  3.9   成像实验

  荧光成像实验前一天, 在共聚焦培养皿中培养HeLa细胞, 共设置三组.对照组只用HDP-1 (10 μmol/L)处理细胞.实验组1用脂多糖(LPS, 10 μg/mL)预处理0.5 h后, 再与HDP-1 (10 μmol/L)共培养0.5 h.实验组2用H₂O₂ (100 μmol/L)预处理0.5 h, 再与HDP-1 (10 μmol/L)共培养0.5 h.采用激光共聚焦显微镜进行细胞成像观察.

  辅助材料(Supporting Information)中间体和终产物的相关表征谱图, 实验方法以及部分荧光谱图和细胞实验数据.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.

  
  
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  图式 1  探针HDP-1的合成路线

  Scheme 1  Synthesis of probe HDP-1

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  图式 2  HDP-1与H₂O₂反应的响应机制

  Scheme 2  Proposed reaction mechanisms of HDP-1 toward H₂O₂

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  图 1  在PBS溶液(10% DMSO, 10 mmol/L, pH＝7.4)中, (a)探针HDP-1 (10 μmol/L)与不同浓度的H₂O₂ (0~500 μmol/L)在37 ℃反应0.5 h后的紫外-可见光吸收光谱, (b)探针HDP-1 (10 μmol/L)与不同浓度的H₂O₂ (0~500 μmol/L)在反应0.5 h后的荧光发射光谱, (c)和(b)中的荧光发射比率I₄₈₅/I₆₁₈, (d) I₄₈₅/I₆₁₈与H₂O₂浓度(0~200 μmol/L)的线性相关性(λ_ex＝420 nm)

  Figure 1  (a) Absorption spectra of probe HDP-1 (10 μmol/L) in the absence/presence of H₂O₂ (0~500 μmol/L) in PBS buffer (pH＝7.4, 10 mmol/L, 10% DMSO), (b) fluorescence spectra of probe HDP-1 (10 μmol/L) in response to H₂O₂ (0~500 μmol/L) in PBS buffer (pH＝7.4, 10 mmol/L, 10% DMSO), (c) the ratio of fluorescence intensity (I₄₈₅/I₆₁₈) of probe HDP-1 (10 μmol/L) with the addition H₂O₂ (0~500 μmol/L) in PBS buffer (pH＝7.4, 10 mmol/L, 10% DMSO), and (d) the linear relationship between I₄₈₅/I₆₁₈ and the concentration of H₂O₂ (0~200 μmol/L) (λ_ex＝420 nm)

  Insert: the color changes of the systems after adding H₂O₂ (500 μmol/L) to the probe HDP-1 (10 μmol/L) under visible light. "—" represents HDP-1 (10 μmol/L) without H₂O₂; "+" represents HDP-1 (10 μmol/L) with H₂O₂ (500 μmol/L)

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  图 2  (a) HDP-1 (10 μmol/L)与H₂O₂ (200 μmol/L)在PBS缓冲液(pH＝7.4, 10 mmol/L, 10% DMSO)中反应后和仅存在HDP-1 (10 μmol/L)的荧光发射比I₄₈₅/I₆₁₈随反应时间的变化, 以及(b) I₄₈₅/I₆₁₈与反应时间(0~30 min)的线性关系(λ_ex＝420 nm)

  Figure 2  (a) Time-dependent fluorescence intensity ratio (I₄₈₅/I₆₁₈) of HDP-1 (10 μmol/L) in the absence/presence of H₂O₂ (200 μmol/L) in PBS buffer (pH＝7.4, 10 mmol/L, 10% DMSO), and (b) the linear relationship between I₄₈₅/I₆₁₈ and the reaction time with H₂O₂ (0~30 min) (λ_ex＝420 nm)

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  图 3  HDP-1 (10 μmol/L)对不同检测物的荧光响应(I₄₈₅/I₆₁₈)

  Figure 3  Fluorescence intensity ratio (I₄₈₅/I₆₁₈) of HDP-1 (10 μmol/L) to different detection substances

  (1) Blank, (2) H₂O₂ (200 μmol/L), (3) Cu²⁺ (1 mmol/L), (4) Na⁺(1 mmol/L), (5) Zn²⁺ (1 mmol/L), (6) ClO^- (500 μmol/L), (7) •OH (500 μmol/L), (8) •O₂^- (500 μmol/L), (9) •O^tBu (500 μmol/L), (10) TBHP (500 μmol/L), (11) CN^- (500 μmol/L), (12) HSO₃^- (500 μmol/L), (13) Cys (1 mmol/L), (14) Hcy (1 mmol/L), (15) GSH (1 mmol/L). λ_ex＝420 nm

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  图 4  不同预处理条件下HDP-1 (10 μmol/L)在HeLa细胞中的共聚焦成像

  Figure 4  Confocal images of HDP-1 (10 μmol/L) in HeLa cells under different pretreatment conditions

  (a~d) Cells were co-cultured with probe HDP-1 (10 μmol/L), (e~h) cells were co-cultured with probe HDP-1 (10 μmol/L) for 30 min after pre-treatment with LPS (10 μg/mL), and (i~l) cells co-cultured with probe HDP-1 (10 μmol/L) for 30 min after pre-treatment with H₂O₂ (100 μmol/L). Green channel: λ_em=497~557 nm. Red channel: λ_em=570~625 nm.λ_ex=420 nm. Scale bar: 10 μm

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