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• 海洋青霉菌是海洋新天然产物的主要来源之一, 2010.1~2013.2报道的895个海洋微生物新天然产物中, 14%来源于海洋青霉菌^[1].其中营养相对丰富的海底沉积物, 是海洋青霉菌的主要栖息地.据统计, 1991~2014.08报道了390个海洋青霉菌来源的新天然产物, 其中约41%产自海底沉积物来源的青霉菌^[2].南海位于西太平洋海域, 北部有珠江、红河、湄公河、湄南河等注入, 海底沉积物营养成分复杂, 形成了高度多样化的微生物生态系统^[3], 其中的微生物可能是活性物质的主要生产者.为此, 我们对采自南海68 m深的海底沉积物进行了菌株分离, 获得一株青霉菌OUCMDZ-4920, 该青霉菌的小试发酵产物对白色念珠菌表现出了较强的抑菌活性(浓度为1 mg/mL时的抑菌圈直径达2.3 cm), 同时对人乳腺癌细胞株MCF-7具有细胞毒活性(浓度为0.1 mg/mL时的抑制率达60.0%), 高效液相色谱(HPLC)在t_R＝14.5~15.5 min显示了霉酚酸类化合物的特征吸收(λ_max 216, 249 304 nm).于是对该菌株的发酵条件进行摸索, 发现在寡营养胁迫条件下的代谢产物更加丰富, 进而采用寡营养条件对该菌株进行规模化发酵.运用各种色谱手段, 从其规模化发酵产物的乙酸乙酯提取物中分离获得了11个化合物.通过波谱分析、比旋光([α]_D)、电子圆二色谱(ECD)、化学沟通、手性拆分和Mosher反应, 鉴定其结构分别为(－)-brevicolide A (1a)即7-羟基-6-[(S)-2-羟基-2-((R)-2-甲基-5-氧亚基-2-四氢呋喃基)乙基]-5-甲氧基-4-甲基异苯并呋喃-1(3H)-酮、(+)-brevicolide A (1b)即7-羟基-6-[(R)-2-羟基-2-((S)-2-甲基-5-氧亚基-2-四氢呋喃基)乙基]-5-甲氧基-4-甲基异苯并呋喃-1(3H)-酮、(－)-brevicolide B (2a)即7-羟基-6-[(S)-2-羟基-2-((S)-2-甲基-5-氧亚基-2-四氢呋喃基)乙基]-5-甲氧基-4-甲基异苯并呋喃-1(3H)-酮、(+)-brevicolide B (2b)即7-羟基-6-[(R)-2-羟基-2-((R)-2-甲基-5-氧亚基-2-四氢呋喃基)乙基]-5-甲氧基-4-甲基异苯并呋喃-1(3H)-酮、霉酚酸(3)、3-羟基霉酚酸(4)^[4]、(S)-2-甲基-4-[5-羟基-7-甲氧基-4-甲基-1-氧亚基-6-(1, 3-二氢异苯并呋喃基)]丁酸(5)^[5]、norpestaphthalides A (6)和B (7)^[6]、5, 7-二甲氧基-4-甲基异苯并呋喃-1(3H)-酮(8)^[5]、6, 8-二羟基-3-羟甲基-1H-异苯并吡喃-1-酮(9)^[7]、brevianamides A (10)^{[8, 9]}和E (11)^{[10, 11]}.化合物3可抑制白色念珠菌的生长、最小抑菌浓度(MIC)为4.7 μmol• L^－1(阳性药酮康唑MIC 1.5 μmol•L^－1); 化合物3还表现出肿瘤细胞毒活性, 对P388, KB, HT29, MCF-7和A549的IC₅₀分别0.4, 5.29, 5.47, 0.99和0.86 μmol•L^－1.

  1   结果与讨论

  1.1   菌株鉴定结果

  菌株OUCMDZ-4920的18S rRNA基因的聚合酶链式反应(PCR)扩增序列的长度为1278 bp, 与EzTaxon-e数据库中的菌株Penicillium brevicompactum PenC(序列号FJ717699.1) 的18S rRNA基因序列同源性为100%, 亲缘关系最近, 在系统发育树上处于同一分支.故将菌株OUCMDZ-4920 (GenBank登录号KY448996) 初步鉴定为短密青霉菌(Penicillium brevicompactum).进一步观察其形态特征, 在麦芽汁琼脂培养基, 菌落仅少量生长, 质地绒状; 产孢结构大量形成, 孢子面青灰色; 菌落背面浅褐色, 无水溶性色素, 与Penicillium brevicompactum的形态特征相一致, 故鉴定OUCMDZ-4920为短密青霉菌(Penicillium brevicompactum).

  1.2   化合物的结构鉴定

  化合物1为白色无定型粉末, 高分辨质谱(HRESIMS)在m/z 337.1287给出准分子离子峰[M+H]⁺, 相应于分子式C₁₇H₂₀O₇ (calcd for C₁₇H₂₁O₇ 337.1282), 不饱和度为8.红外光谱提示分子中存在酯羰基(1759, 1735 cm^－1)、苯环(1621, 1456 cm^－1)及羟基(3430 cm^－1)等结构片段, 紫外光谱在λ_max 220, 248, 300 nm处的吸收带表明结构中含有苯并呋喃酮色团, 与霉酚酸(mycophenolic acid, 3)的紫外吸收相似^[12]. ¹H NMR, ¹³C NMR(表 1)结合DEPT谱表明分子中含有6个芳香季碳(δ_C 146.4, 115.8, 163.0, 120.5, 153.8, 107.0)、1个共轭酯羰基(δ_C 169.7)、1个连氧亚甲基(δ_C/H 68.4/5.24)、1个甲氧基(δ_C/H 60.7/3.74)、1个甲基(δ_C/H 11.1/2.09) 及一个酚羟基(δ_H 9.58) 信号(表 1), 这些信号与霉酚酸3中的苯并呋喃酮母核部分完全对应, 且HMBC谱图解析给出了H-3 (δ_H 5.24) 与C-1 (δ_C 169.7), C-3a (δ_C 146.4), C-4 (δ_C 115.8), C-7a (δ_C 107.0) 的相关信号, H-8 (δ_H 2.09) 与C-3a (δ_C 146.4), C-4 (δ_C 115.8), C-5 (δ_C 163.0) 的相关信号, H-9 (δ_H 3.74) 与C-3a (δ_C 146.4) 的相关信号, 以及H-1'与C-5 (δ_C 163.0), C-6 (δ_C 120.5) 和C-7 (δ_C 153.8) 的相关信号(图 1), 进一步证明化合物1与霉酚酸具有相同的苯并呋喃酮母核.但化合物1的¹H NMR, ¹³C NMR及DEPT谱还存在1个酯羰基(δ_C 176.6)、1个连氧季碳(δ_C 88.2)、1个连氧次甲基(δ_C/H 74.1/3.82)、3个亚甲基(δ_C/H 26.2/2.77, 2.71, 28.1/2.36, 1.87, 28.9/2.60, 2.55) 和1个醇羟基(δ_H 5.77) 信号.与霉酚酸3相比, 少了C-2'与C-3'位的双键及羧基活泼氢信号、多了两个饱和连氧碳及一个醇羟基信号, 且羧基碳向低场位移, 表明霉酚酸中的Δ^2'-双键被双羟基化且其中之一与羧基形成了五元内酯或六元内酯. HMBC谱给出了3'-CH₃ (δ_H 1.40) 与C-2' (δ_C 74.1)、C-3' (δ_C 88.2) 以及C-4' (δ_C 28.1) 的相关信号, H-1' (δ_H 2.77/2.71) 与C-2' (δ_C 74.1), C-5 (δ_C 163.0), C-6 (δ_C 120.5) 以及C-7 (δ_C 153.8) 的相关信号, H-4' (δ_H 2.36/1.87) 与C-3' (δ_C 88.2), C-5' (δ_C 28.9) 以及C-6' (δ_C 176.6) 的相关信号, 但没有H-2' (δ_H 3.82) 与羰基碳(δ_C 176.6) 的相关信号(图 1), 且醇羟基(δ_H 5.77) 信号裂分为d峰(J＝4.1 Hz), 表明侧链含五元内酯环; 另外, 较高波数(1759 cm^－1)的酯羰基红外振动吸收频率, 也表明是五元内酯(六元内酯的酯羰基红外振动吸收频率小于1750 cm^－1).

  表 1  化合物1和 2的¹H NMR (500 MHz)和¹³C NMR (125 MHz)数据(DMSO-d₆, TMS) Table 1.  ¹H NMR (500 MHz) and ¹³C NMR (125 MHz) data of compound 1 and 2 (DMSO-d₆, TMS)

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  Position	1		2
  	δC	δH (J in Hz)	δC	δH (J in Hz)
  1	169.7 (C)		169.8 (C)
  3	68.4 (CH2)	5.24 (s)	68.4 (CH2)	5.23 (s)
  3a	146.4 (C)		146.3 (C)
  4	115.8 (C)		115.9 (C)
  5	163.0 (C)		163.0 (C)
  6	120.5 (C)		120.7 (C)
  7	153.8 (C)		153.7 (C)
  7-OH		9.58 (s)		9.60 (s)
  7a	107.0 (C)		107.1 (C)
  8	11.1 (CH3)	2.09 (s)	11.1 (CH3)	2.09 (s)
  9	60.7 (CH3)	3.74 (s)	60.7 (CH3)	3.74 (s)
  1'	26.2 (CH2)	2.77 (dd, 13.7, 1.3), 2.70 (dd, 13.5, 9.9)	26.0 (CH2)	2.78 (dd, 13.8, 2.1), 2.71 (dd, 13.8, 9.9)
  2'	74.1 (CH)	3.82 (ddd, 9.7, 4.1, 1.3)	75.2 (CH)	3.77 (dd, 9.6, 2.1)
  2'-OH		5.77 (d, 4.1)		5.74 (br s)
  3'	88.2 (C)		88.3 (C)
  4'	28.1 (CH2)	2.36 (ddd, 12.6, 10.2, 7.5), 1.87 (ddd, 12.6, 10.4, 6.3)	30.0 (CH2)	2.25 (ddd, 13.5, 10.3, 7.4), 1.93 (ddd, 13.5, 10.5, 5.9)
  5'	28.9 (CH2)	2.62 (ddd, 17.6, 10.4, 7.5), 2.55 (ddd, 17.6, 10.2, 6.4)	29.0 (CH2)	2.63 (ddd, 17.7, 10.4, 7.4), 2.54 (ddd, 17.6, 10.3, 6.1)
  6'	176.6 (C)		176.8 (C)
  3'-Me	22.2 (CH3)	1.40 (s)	21.9 (CH3)	1.40 (s)

  图1 化合物1和2的¹H-¹H COSY和主要的HMBC的相关 Figure1. ¹H-¹H COSY and key HMBC correlations of compounds 1 and 2

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  化合物2为白色无定型粉末, HRESIMS在m/z 337.1276给出准分子离子峰[M+H]⁺, 对应于分子式C₁₇H₂₀O₇ (calcd for C₁₇H₂₁O₇ 337.1282), 为1的同分异构体.化合物2的UV, IR, NMR (表 1)以及二维NMR的偶合模式(图 1)与化合物1的几乎相同, 差别在于C-2'和C-4'位的化学位移向高场位移δ 1~2, 推测它们是C-3′的差向异构体.为了确定C-2'与C-3'位的相对构型, 我们分别用间氯过氧化苯甲酸(mCPBA)和K₂OsO₄•2H₂O进行了霉酚酸的双羟化-内酯化反应.结果表明, 化合物1和2的NMR数据分别与mCPBA(反式双羟化)和K₂OsO₄•2H₂O(顺式双羟化)的氧化产物相同(Scheme 1), 由于霉酚酸中的Δ^2'-双键为E-型, 故化合物1和2的相对构型分别为赤式和苏式.天然来源的化合物1和2与化学合成的1和2的旋光均为零, 表明它们为外消旋体, 我们将其命名为brevicolides A (1)和B (2).

  图式 1 化学转化霉酚酸为化合物1和2 Scheme1. Chemical transformation of mycophenolic acid to compounds 1 and 2

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  于是我们对化合物1和2进行了HPLC手性拆分, 但无论更换流动相还是手性色谱柱, 化合物1和2拖尾严重, 无法完全分离.考虑到有可能是C-7位裸露酚羟基的影响, 故我们先对化合物1和2的酚羟基甲基化(Scheme 2), 分别得到7-O-methyl的衍生物12和13, 再对其手性拆分[Chiralpac IC column, 5 μm, 4.6 nm×250 mm, 1 mL/min, V(乙醇):V(己烷)＝3:7]时得到了较好的分离, 分别获得化合物(－)-7-O-methylbrevicolide A (12a)和(+)-7-O-methylbrevicolide A (12b)[比旋光值为[α]_D¹⁶－14.0 (c 0.17, MeOH)和+11.6 (c 0.26, MeOH)]以及(－)-7-O-methylbrevicolide B (13a)和(+)-7-O-methylbrevicolide B (13b)[比旋光值为[α]_D¹⁶－36.3 (c 0.2, MeOH)和+44.5 (c 0.2, MeOH)] (Scheme 2).为了确定化合物的绝对构型, 分别采用(S)-与(R)-2-甲氧基-2-苯基三氟乙酰氯(MTPA chloride)对其进行酯化反应, 得到了相应的(R)-与(S)-Mosher酯12aa和12ab, 12ba和12bb, 13aa和13ab, 13ba和13bb.继而计算12ab与12aa, 12bb与12ba、13ab与13aa, 13bb与13ba两两之间每组氢信号的化学位移差值Δδ(图 2), 确定了化合物12a和12b的绝对构型分别为(2'S, 3'R)和(2'R, 3'S), 13a和13b的绝对构型分别为(2'S, 3'S)和(2'R, 3'R).进而确定了1a和1b以及2a和2b的绝对构型分别为(2'S, 3'R)和(2'R, 3'S)以及(2'S, 3'S)和(2'R, 3'R), 即(－)-brevicolide A (1a), (+)-brevicolide A (1b), (－)-brevicolide B (2a)和(+)-brevicolide B (2b)的结构分别确定为7-羟基-6-[(S)-2-羟基-2-((R)-2-甲基-5-氧亚基-2-四氢呋喃基)乙基]-5-甲氧基-4-甲基异苯并呋喃-1(3H)-酮、7-羟基-6-[(R)-2-羟基-2-((S)-2-甲基-5-氧亚基-2-四氢呋喃基)乙基]-5-甲氧基-4-甲基异苯并呋喃-1(3H)-酮、7-羟基-6-[(S)-2-羟基-2-((S)-2-甲基-5-氧亚基-2-四氢呋喃基)乙基]-5-甲氧基-4-甲基异苯并呋喃-1(3H)-酮、7-羟基-6-[(R)-2-羟基-2-((R)-2-甲基-5-氧亚基-2-四氢呋喃基)乙基]-5-甲氧基-4-甲基异苯并呋喃-1(3H)-酮.

  图式 2 化合物1和2的甲基化及其手性拆分 Scheme2. Methylation of compounds 1 and 2 and their chiral separation

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  图2 (－)-12和(+)-12以及(－)-13和(+)-13的(S)-和(R)-MTPA酯的Δδ (δ_S－δ_R)值 Figure2. Δδ (δ_S－δ_R) values of (S)-and (R)-MTPA esters of (－)-12 & (+)-12 and (－)-13 & (+)-13

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  经过波谱数据(质谱MS、核磁共振NMR)、ECD数据分析及其比旋光值[5: [α]_D¹⁶ －5.8 (c 0.05, MeOH), 6: [α]_D¹⁶+29.4 (c 0.24, MeOH), 7:[α]_D¹⁶－47.7 (c 0.24, MeOH), 10: [α]_D¹⁶+130.3 (c 0.1, MeOH), 11: [α]_D¹⁶－245 (c 0.1, EtOH)], 化合物3~11的结构依次被鉴定为:霉酚酸(3)、3-羟基霉酚酸(4)^[4]、(S)-2-甲基-4-[5-羟基-7-甲氧基-4-甲基-1-氧亚基-6-(1, 3-二氢异苯并呋喃基)]丁酸(5)^[5]、norpestaphthalides A (6)和B (7)^[6]、5, 7-二甲氧基-4-甲基异苯并呋喃-1(3H)-酮(8)^[5]、6, 8-二羟基-3-羟甲基-1H-异苯并吡喃-1-酮(9)^[7]、brevianamide A (10)^{[8, 9]}和brevianamide E (11)^{[10, 11]}.

  1.3   化合物的生物活性

  采用药敏纸片法和二倍稀释法测试了化合物1~11对金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus (ATCC6538)、铜绿假单孢菌Pseudomonas aeruginosa (ATCC10145)、大肠杆菌Escherichia coli (ATCC11775)、产气杆菌Enterobacter aerogenes (ATCC 13048)、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis (ATCC 6051)、光滑念珠菌Candida glabrata (ATCC2001)、白色念珠菌Candida albicans (ATCC10231) 和烟曲霉Aspergillus fumigates (AF293) 的抑菌活性.只有霉酚酸(3)对白色念珠菌具有较强的抑菌活性, 其最小抑菌浓度(MIC)为4.7 μmol•L^－1, 略弱于阳性药酮康唑(MIC 1.5μmol•L^－1).化合物3对其它病原菌以及其余10个化合物对8种病原菌无抑制作用(MIC＞100 μg/mL).

  采用噻唑蓝(MTT)法测试了化合物1~11对小鼠白血病细胞P388、人口腔上皮癌细胞KB、人结直肠癌细胞HT29、人乳腺癌细胞MCF-7、人肺癌细胞A549及人正常胚肾细胞Hek293和大西洋鲑鱼肾细胞ASK的细胞毒活性.结果显示只有化合物3具有较强的细胞毒活性(表 2), 均强于阳性药椭圆玫瑰树碱(ellipticine), 尤其是对MCF-7, A549以及P388细胞, IC₅₀＜1 μmol•L^－1, 但对正常肾细胞的毒性也较强; 其余化合物对以上细胞的IC₅₀均大于10 μmol•L^－1.

  表 2  化合物3的肿瘤细胞毒活性[IC₅₀/(μmol•L^－1)] Table 2.  Cytotoxicity of compound 3 [IC₅₀/(μmol•L^－1)]

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  化合物	P388	KB	HT29	MCF-7	A549	Hek293	ASK
  3	0.4	5.29	5.47	0.99	0.86	0.57	0.82
  Ellipticine	1.77	2.31	2.24	2.08	1.08	1.95	2.02

  1.4   讨论

  化合物2的平面结构曾在1966年从一株青霉菌Penicillium brevicompactum的代谢产物中分离得到, 并通过NMR数据、化学转化等确定其结构为苏式^[13].但在文献中未找到其NMR数据等, 可视为新结构.本工作通过NMR、化学衍生及其甲基化衍生物的手性拆分、Mosher方法, 首次确定了左旋和右旋化合物2的绝对构型.此外, 还获得了新化合物1, 通过同样的方法, 确定了其左右旋体的绝对构型.因此, 我们将化合物1和2分别命名为brevicolides A和B.

  霉酚酸最早被发现于1893年, 具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、免疫抑制等生物活性, 吸引了科学家的广泛关注.然而, 太过广泛的生物活性以及较低的生物利用度阻碍了霉酚酸的临床应用.为此, Allison等^[14]合成了霉酚酸的2-吗啉代乙基酯——霉酚酸酯, 其在灵长类动物中表现出了远高于霉酚酸的生物利用度.美国食品药品监督管理局(FDA)于1995年批准罗氏公司将霉酚酸酯作为肾脏移植排异反应药物的申请, 并在1998年获准上市, 商品名为CellCept、骁悉、赛可平, 在器官移植领域内做出了重要贡献^[15], 将霉酚酸衍生物的研究推向了一个新的高潮.天然来源(陆地)和有机合成的霉酚酸类似物成百上千, 但海洋来源的霉酚酸类似物鲜有报道, 仅有一篇文献报道了从海洋青霉菌的代谢产物中获得霉酚酸及其衍生物^[16].本工作通过化学与生物活性相结合的集成筛选方法, 从南海海洋沉积物来源的微生物中, 筛选获得了霉酚酸的产生菌Penicillium brevicompactumOUCMDZ-4920, 并从其寡营养培养产物中获得了霉酚酸及其7个类似物.

  2   结论

  采用寡营养条件培养南海沉积物来源的短密青霉菌(Penicillium brevicompactum OUCMDZ-4920), 获得了霉酚酸及其7个类似物, 其中外消旋的brevicolides A (1)和B (2)为新化合物.从霉酚酸出发, 首次通过化学沟通(双羟化-分子内酯化)、酚羟基甲醚化及其产物的手性拆分、Mosher方法确定了(－)-brevicolide A (1a), (+)-brevicolide A (1b), (－)-brevicolide B (2a)和(+)-brevicolide B (2b)的绝对构型.霉酚酸(3)对白色念珠菌具有较强的抗真菌活性、MIC值为4.7 μmol•L^－1, 对人乳腺癌细胞MCF-7和人肺癌细胞A549有较强的细胞毒活性、IC₅₀值均小于1 μmol•L^－1.表明海洋青霉菌是产生抗菌、抗肿瘤等活性物质的主要海洋生物之一.

  3   实验部分

  3.1   仪器与试剂

  核磁共振仪型号为JNM-ECP 600 (JEOL公司); 高分辨质谱仪型号为Micromass EI-4000 (Autospec-Ultima-TOF)型(Waters公司); 普通质谱仪型号为LTQ Orbitrap XL (Thermo Scientific公司); 紫外光谱仪型号为DU 640 (Beckman公司); 电子圆二色谱仪型号为J-810 (JASCO公司); 红外光谱仪型号为NEXUS 470FT-IR (NICOLET公司); 旋光仪型号为POLAX-L (ATAGO公司).分析用高效液相色谱仪1525泵、2998二极管阵列检测器(Waters公司); 半制备用高效液相色谱仪1525泵、2487二极管阵列检测器(Waters公司); 凝胶Sephadex LH-20 (Pharmacia公司); 薄层层析硅胶板、柱层析硅胶(青岛海洋化工厂); 数字显示显微熔点测定仪型号为X-4(北京泰克有限公司).

  提取分离所用到的石油醚、二氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯、丙酮等均为工业用化学纯试剂; 分析用甲醇、乙腈等均为色谱纯试剂.

  3.2   菌株的分离鉴定

  2014年11月从采自南海沉积物样品(－68 m, 22°33' N, 115°47' E)中分离得到一株真菌OUCMDZ-4920, 综合菌株ITS序列比对(GenBank accession No. FJ717699.1) 以及菌株生长形态, 将该菌株鉴定为短密青霉菌Penicillium brevicompactum.该菌株保存于本课题组－80 ℃冰箱中.

  3.3   菌株的发酵萃取

  将菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)固体培养基中, 于28 ℃培养箱中培养2~3 d, 将生长状况较好的菌株接种于无菌的寡营养培养基SWS(可溶性淀粉10%, 蛋白胨1%, 海水1 L, pH自然)中进行规模化发酵, 发酵规模为60 L (300 mL/1000 mL), 18~32 ℃静置发酵50 d.将菌株发酵产物中的菌丝体和发酵液分开处理.其中, 菌丝体用85%丙酮-15%水体系浸泡24 h、破碎、超声60 min, 抽滤, 以此方法萃取三次, 将萃取液减压浓缩除去丙酮, 得到水相, 加等体积的乙酸乙酯萃取三次, 减压浓缩至干, 得到浸膏2.3 g.发酵液部分用等体积的乙酸乙酯在容积为100 L的萃取罐中萃取三次, 将萃取液浓缩至干, 得到浸膏8.1 g.

  3.4   菌株代谢产物的分离纯化

  运用减压硅胶柱色谱(石油醚/二氯甲烷/甲醇)极性递增梯度洗脱发酵液部分所得的8.1 g浸膏, 共分成12个组分Fr.1~Fr.12.对组分Fr.4 (1.2 g)运用Sephadex LH-20凝胶柱层析[洗脱液: V(CH₂Cl₂):V(MeOH)＝1:1], 在半制备HPLC [YMC-pack ODS-A柱, V(乙腈):V(酸水)＝32:78, 4 mL/min]上制备得到化合物1 (t_R＝10.2 min, 3 mg)、化合物2 (t_R＝11 min, 5 mg)和化合物11 (t_R＝17 min, 2.5 mg).对组分Fr.5 (0.6 g)运用Sephadex LH-20凝胶柱层析[V(CH₂Cl₂):V(MeOH)＝1:1]洗脱得到化合物9 (t_R＝14.0 min, 10.4 mg); 对组分Fr.6 (1.2 g)运用Sephadex LH-20凝胶柱层析[V(CH₂Cl₂): V(MeOH)＝1:1]洗脱, 在半制备HPLC上[YMC-pack ODS-A柱, V(甲醇):V(水)＝40:60, 4 mL/min]制备得到化合物8 (t_R＝14.0 min, 15 mg)和化合物5 (t_R＝10.5 min, 4 mg); 对组分Fr.7 (0.8 g)运用Sephadex LH-20凝胶柱层析[V(CH₂Cl₂):V(MeOH)＝1:1]洗脱得到化合物4 (30 mg); 对组分Fr. 8 (0.7 g)运用Sephadex LH-20凝胶柱层析[V(CH₂Cl₂):V(MeOH)＝1:1]洗脱得到化合物3 (16 mg); 对组分Fr.10 (0.8 g)运用Sephadex LH-20凝胶柱层析[V(CH₂Cl₂):V(MeOH)＝1:1]洗脱, 在半制备HPLC[YMC-pack ODS-A柱, V(乙腈):V(酸水)＝30:70, 4 mL/min]上制备得到化合物10 (t_R＝14.0 min, 20 mg); 对组分Fr.12 (1.7 g)运用Sephadex LH-20凝胶柱层析[V(CH₂Cl₂):V(MeOH)＝1:1]洗脱, 在半制备HPLC [COSMOSIL Cholester柱, V(乙腈):V(酸水)＝10:90, 4 mL/min]上制备得到化合物6 (t_R＝10.5 min, 35 mg)和化合物7 (t_R＝14.0 min; 15 mg).

  菌丝体部分浸膏中的化合物在发酵液部分均可找到, 且种类少于发酵液部分.

  Brevicolide A (1):白色无定型粉末, m.p. 217~218 ℃; UV-vis (MeOH) λ_max [log ε/(L•mol^－1•cm^－1)]: 220 (2.92), 248 (0.98), 300 (0.44) nm; IR (KBr) ν_max: 3429, 1759, 1735, 1621, 1456 cm^－1; HRESIMS calcd for C₁₇H₂₁O₇ [M+H]⁺337.1282, found 337.1287.

  Brevicolide B (2):白色无定型粉末, m.p. 216~218 ℃; UV-vis (MeOH) λ_max [log ε/(L•mol^－1•cm^－1)]: 220 (2.92), 248 (0.97), 300 (0.43) nm; IR (KBr) ν_max: 3428, 1735, 1623, 1457 cm^－1; HRESIMS calcd for C₁₇H₂₁O₇ [M+H]⁺ 337.1282, found 337.1276.

  霉酚酸(3):白色无定型固体, m.p. 142~143 ℃ (lit.^[15] 142~145 ℃); ¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ: 5.23 (s, 2H, H-3), 2.07 (s, 3H, H-8), 3.69 (s, 3H, H-9), 3.29 (d, J＝6.7 Hz, 2H, H-1'), 5.12 (t, J＝6.7 Hz, 1H, H-2'), 1.73 (s, 3H, 3'-CH₃), 2.15 (t, J＝7.5 Hz, 2H, H-4'), 2.25 (t, J＝7.5 Hz, 2H, H-5'), 11.99 (s, 1H, 6'-CO₂H), 9.35 (s, 1H, 7-OH); ¹³C NMR (126 MHz, DMSO-d₆) δ: 170.2 (C, C-1), 68.6 (CH₂, C-3), 145.8 (C, C-3a), 116.0 (C, C-4), 162.6 (C, C-5), 122.4 (C, C-6), 152.7 (C, C-7), 107.0 (C, C-7a), 11.0 (CH₃, C-8), 60.7 (CH₃, C-9), 22.4 (CH₂, C-1'), 122.7 (CH, C-2'), 133.6 (C, C-3'), 16.0 (CH₃, 3'-CH₃), 34.2 (CH₂, C-4'), 32.5 (CH₂, C-5'), 174.1 (C, 5'-CO₂H); ESI-MS m/z: 321.3 [M+H]⁺.

  3-羟基霉酚酸(4):黄色无定型固体, m.p. 143~144 ℃ (lit.^[17] 142~144 ℃); ¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ: 6.53 (s, 1H, H-3), 2.16 (s, 3H, H-8), 3.68 (s, 3H, H-9), 3.29 (d, J＝6.3 Hz, 2H, H-1'), 5.13 (t, J＝6.5 Hz, 1H, H-2'), 1.73 (s, 3H, CH₃-3'), 2.16 (t, J＝7.4 Hz, 2H, H-4'), 2.25 (t, J＝7.4 Hz, 2H, H-5'), 12.02 (s, 1H, 6'-CO₂H), 9.38 (s, 1H, 7-OH), 7.92 (s, 1H, 5-OH); ¹³C NMR (126 MHz, DMSO-d₆) δ: 168.1 (C, C-1), 97.2 (CH, C-3), 145.1 (C, C-3a), 118.3 (C, C-4), 162.9 (C, C-5), 122.5 (C, C-6), 152.4 (C, C-7), 108.1 (C, C-7a), 10.8 (CH₃, C-8), 60.6 (CH₃, C-9), 22.6 (CH₂, C-1'), 124.2 (CH, C-2'), 133.8 (C, C-3'), 16.1 (CH₃, 3'-CH₃), 34.2 (CH₂, C-4'), 32.5 (CH₂, C-5'), 174.1 (C, 6′-CO₂H); ESI-MS m/z: 335.11 [M－H]^–.

  (S)-2-甲基-4-[5-羟基-7-甲氧基-4-甲基-1-氧亚基-6-(1, 3-二氢异苯并呋喃基)]丁酸(5):白色无定型固体, m.p. 165~166 ℃ (lit.^[17] 164~167 ℃); [α]_D¹⁶－5.8 (c 0.05, MeOH); ECD (0.0017 M, MeOH) λ_max [Δε/(L• mol^－1•cm^－1)]: 209 (+0.4), 214 (+0.8), 227 (+0.2) nm; ¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ: 5.23 (s, 2H, H-3), 2.59 (t, J＝7.9 Hz, 2H, H-1'), 1.47~1.54 (ddt, J＝15.1, 6.5, 7.9 Hz, 1H, H-2'), 1.71~1.78 (ddt, J＝15.1, 6.5, 7.9 Hz, 1H, H-2'), 2.34 (tq, J＝6.5, 7.0 Hz, 1H, H-3'), 1.11 (d, J＝7.0 Hz, 3H, H-4'), 2.08 (s, 3H, H-8), 3.72 (s, 3H, H-9); ¹³C NMR (126 MHz, DMSO-d₆) δ: 170.3 (C, C-1), 68.6 (CH₂, C-3), 145.9 (C, C-3a), 116.0 (C, C-4), 162.7 (C, C-5), 122.9 (C, C-6), 152.9 (C, C-7), 106.9 (C, C-7a), 21.2 (CH₂, C-1'), 33.2 (CH₂, C-2'), 38.9 (CH, C-3'), 16.8 (CH₃, 3'-CH₃), 177.3 (C, C-4'), 11.1 (CH₃, C-8), 60.9 (CH₃, C-9); ESI-MS m/z: 293.1 [M－H]^－.

  Norpestaphthalide A (6):白色无定型固体, m.p. 206~208 ℃ (lit.^[18] 206~208 ℃); [α]_D¹⁶+29.4 (c 0.24, MeOH); ECD (0.0024 M, MeOH) λ_max [Δε/(L•mol^－1• cm^－1)]: 213 (+1.7), 235 (+0.1), 287 (－0.2) nm; ¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ: 5.14 (d, J＝2.6 Hz, 1H, H-3), 6.29 (s, 1H, H-4), 6.37 (s, 1H, H-6), 4.02 (ddq, J＝2.3, 5.1, 6.3 Hz, 1H, H-1'), 1.04 (d, J＝6.3 Hz, 3H, H-2'), 10.37 (s, 1H, 5-OH), 10.41 (s, 1H, 7-OH), 4.93 (d, J＝5.1 Hz, 1H, 1'-OH); ¹³C NMR (126 MHz, DMSO-d₆) δ: 168.1 (C, C-1), 81.8 (CH, C-3), 152.1 (C, C-3a), 102.4 (CH, C-4), 157.9 (C, C-5), 100.9 (CH, C-6), 164.2 (C, C-7), 104.2 (C, C-7a), 66.4 (CH, C-1'), 18.5 (CH₃, C-2'); ESI-MS m/z: 211.2 [M+H]⁺.

  Norpestaphthalide B (7):白色无定型固体, m.p. 207~208 ℃; [α]_D¹⁶ －47.7 (c 0.24, MeOH); ECD (0.0024 M, MeOH) λ_max [Δε/(L•mol^－1•cm^－1)]: 211 (－2.0), 256 (+0.5), 287 (+0.3) nm; ¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ: 5.17 (d, J＝5.5 Hz, 1H, H-3), 6.30 (s, 1H, H-4), 6.40 (s, 1H, H-6), 3.82 (ddq, J＝5.5, 4.7, 6.3 Hz, 1H, H-1′), 1.02 (d, J＝6.3 Hz, 3H, H-2'), 10.38 (s, 1H, 5-OH), 10.44 (s, 1H, 7-OH), 5.10 (d, J＝4.7 Hz, 1H, OH-1'); ¹³C NMR (126 MHz, DMSO-d₆) δ: 168.0 (C, C-1), 82.5 (CH, C-3), 151.9 (C, C-3a), 102.5 (CH, C-4), 158.0 (C, C-5), 101.3 (CH, C-6), 164.3 (C, C-7), 103.6 (C, C-7a), 67.8 (CH, C-1'), 18.0 (CH₃, C-2'); ESI-MS m/z: 211.2 [M+H]⁺.

  5, 7-二甲氧基-4-甲基异苯并呋喃-1(3H)-酮(8):白色无定型固体, 分子式为C₉H₈O₄; m.p. 204~205 ℃ (lit.^[19] 203~205 ℃); ¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ: 5.10 (s, 2H, H-3), 6.41 (s, 1H, H-6), 1.91 (s, 3H, H-8); ¹³C NMR (126 MHz, DMSO-d₆) δ: 169.1 (C, C-1), 67.7 (CH₂, C-3), 149.3 (C, C-3a), 108.6 (C, C-4), 162.0 (C, C-5), 102.1 (CH, C-6), 156.0 (C, C-7), 102.2 (C, C-7a), 10.1 (CH₃, C-8); ESI-MS m/z: 179.3 [M－H]^－.

  6, 8-二羟基-3-羟甲基-1H-异苯并吡喃-1-酮(9):白色无定型固体, m.p. 225~227 ℃ (lit.^[20] 223~226 ℃); ¹H NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ: 6.43 (s, 1H, H-4), 6.60 (s, 1H, H-5), 6.34 (s, 1H, H-7), 4.25 (d, J＝4.5 Hz, 2H, H-1'), 10.89 (s, 1H, 6-OH), 10.93 (s, 1H, 8-OH), 5.61 (t, J＝4.5 Hz, 1H, 1'-OH); ¹³C NMR (126 MHz, DMSO-d₆) δ: 165.7 (C, C-1), 157.0 (C, C-3), 103.2 (CH, C-4), 139.2 (C, C-4a), 103.0 (CH, C-5), 165.2 (C, C-6), 101.8 (CH, C-7), 162.8 (C, C-8), 98.3 (C, C-8a), 59.5 (CH₂, C-1'); ESI-MS m/z: 207.3 [M－H]^－.

  Brevianamide A (10):黄绿色无定型固体, m.p. 228~230 ℃ (lit.^[21]: 220~250 ℃); [α]_D¹⁶+130.3 (c 0.1, MeOH); ECD (0.0014 M, MeOH) λ_max [Δε/(L•mol^－1• cm^－1)]: 208 (+2.7), 225 (−3.4), 242 (+2.6), 263 (+0.9), 321 (−1.6) nm; ¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ: 7.55 (dd, J＝7.9, 0.8 Hz, 1H, H-4), 6.79 (t, J＝7.9 Hz, 1H, H-5), 7.42 (td, J＝7.8, 1.2 Hz, 1H, H-6), 6.78 (d, J＝7.8 Hz, 1H, H-7), 2.78 (d, J＝16.2 Hz, 1H, H-8), 2.40 (d, J＝16.2 Hz, 1H, H-8), 2.76 (dt, J＝13.1, 6.5 Hz, 1H, H-13), 1.85 (d, J＝13.3 Hz, 1H, H-13), 2.00~2.06 (m, 2H, H-14), 3.40~3.51 (m, 2H, H-15), 2.40 (dd, J＝9.7, 2.1 Hz, 1H, H-19), 1.92 (dd, J＝13.3, 10.4 Hz, 1H, H-20), 1.85 (dd, J＝13.5, 1.8 Hz, 1H, H-20), 0.91 (s, 3H, H-21), 1.11 (s, 3H, H-22); ¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃) δ: 79.0 (C, C-2), 202.2 (C, C-3), 124.7 (CH, C-4), 121.0 (C, C-4a), 119.1 (CH, C-5), 137.8 (CH, C-6), 112.1 (CH, C-7), 160.3 (C, C-7a), 37.1 (CH₂, C-8), 67.8 (C, C-9), 172.6 (C, C-11), 69.6 (C, C-12), 28.8 (CH₂, C-13), 25.1 (CH₂, C-14), 44.1 (CH₂, C-15), 170.0 (C, C-17), 48.6 (C, C-18), 55.6 (CH, C-19), 29.1 (CH₂, C-20), 23.7 (CH₃, C-21), 19.5 (CH₃, C-22); ESI-MS m/z: 366.2 [M+H]⁺.

  Brevianamide E (11):乳白色无定型固体, m.p. 231~233 ℃; [α]_D¹⁶－245 (c 0.1, EtOH)]; ECD (0.0028 M, MeOH) λ_max [Δε/(L•mol^－1•cm^－1)]: 212 (－6.9), 246 (－5.6), 297 (－1.2) nm; ¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ: 7.27 (d, J＝7.4 Hz, 1H, H-4), 6.72 (t, J＝7.4 Hz, 1H, H-5), 7.08 (t, J＝7.5 Hz, 1H, H-6), 6.74 (d, J＝7.4 Hz, 1H, H-7), 2.58 (t, J＝12.8 Hz, 1H, H-10), 2.48 (dd, J＝12.8, 8.2 Hz, 1H, H-10), 3.74 (dd, J＝12.0, 8.3 Hz, 1H, H-11), 3.36 (dt, J＝11.8, 7.4 Hz, 1H, H-14), 3.29 (ddd, J＝12.2, 7.6 Hz, 5.1 Hz, H-14), 1.75~1.80 (m, H-15), 2.08 (ddd, J＝19.6, 9.5, 7.9 Hz, H-16), 1.90 (ddd, J＝19.8, 14.4, 7.9 Hz, 1H, H-16), 4.08 (t, J＝7.8 Hz, 1H, H-17), 4.84 (d, J＝17.7 Hz, 1H, H-20), 4.83 (d, J＝10.4 Hz, 1H, H-20), 6.24 (dd, J＝17.6, 11.0 Hz, 1H, H-21), 1.16 (s, 3H, H-23), 1.19 (s, 3H, H-24), 6.60 (br s, 1H, H-N); ¹³C NMR (125 MHz, DMSO-d₆) δ: 90.8 (C, C-2), 88.1 (C, C-3), 110.5 (CH, C-4), 118.6 (CH, C-5), 129.6 (CH, C-6), 123.8 (CH, C-3), 149.2 (C, C-8), 131.4 (C, C-9), 34.9 (CH₂, C-10), 58.7 (CH, C-11), 165.8 (C, C-12), 44.5 (CH₂, C-14), 23.3 (CH₂, C-15), 27.8 (CH₂, C-16), 61.0 (CH, C-17), 172.1 (C, C-18), 110.9 (CH₂, C-20), 145.6 (CH, C-21), 44.4 (C, C-22), 24.3 (CH₃, C-23), 24.5 (CH₃, C-24); ESI-MS m/z: 368.3 [M+H]⁺.

  3.4   化学转化霉酚酸为brevicolides A (1) 和B (2)

  将80.3 mg霉酚酸与129.5 mg mCPBA各自溶解在6 mL充分回流干燥的CH₂Cl₂中, N₂保护下将mCPBA溶液缓慢滴加于霉酚酸(3)溶液中, 室温条件下搅拌反应8 h, 待反应液变为澄清透明黄色液体后终止反应.反应液减压蒸馏浓缩干后, 运用加压硅胶柱色谱极性递增[V(CH₂Cl₂):V(MeOH)＝100:0, 100:1, 80:1, 60:1, 40:1, 10:1]进行梯度洗脱, 组分[V(CH₂Cl₂):V(MeOH)＝60:1]浓缩后利用利用半制备HPLC (YMC-pack ODS-A column, 5 μm, 4.6 mm×250 mm, 4 mL/min)对混合物进行制备纯化[洗脱液: V(MeCN):V(H₂O)＝3:7], 得到brevicolide A (1) (45 mg, t_R=17 min).

  将20 mg霉酚酸与19 mg柠檬酸溶解于3 mL叔丁醇和水(V:V＝1:1) 的混合溶剂中, 加入3.4 mg K₂OsO₄•2H₂O及9 mg N-甲基-N-氧化吗啉(NMO)室温条件下反应45 h; 随后加入16.3 mg Na₂SO₃室温条件下反应1 h, 反应液以8 mL乙酸乙酯萃取三次后, 有机相合并浓缩后以甲醇溶解, 利用半制备HPLC (YMC-pack ODS-A column, 5 μm, 4.6 nm×250 mm, 4 mL/min)对混合物进行制备纯化[洗脱液: V(MeCN):V(H₂O)＝35:65], 得到brevicolide B (2) (12 mg, t_R＝13 min).

  3.5   Brevicolides A (1) 和B (2) 的酚羟基甲基化及产物的手性拆分

  Brevicolides A (1)和B (2)的甲基化:将50 mg NaHCO₃低温(－4 ℃)搅拌下悬浮于1.5 mL N, N-二甲基甲酰胺(DMF)中, 10 min后投入1 mL DMF溶解的10 mg brevicolide A (1), N₂保护下反应30 min; 随后投入30 μL的CH₃I, 室温条件下继续反应36 h后以饱和NH₄Cl溶液淬灭反应.反应液以3 mL乙酸乙酯萃取三次, 有机相合并浓缩后以甲醇溶解, 利用半制备HPLC (YMC-pack ODS-A column, 5 μm, 4.6 mm×250 mm, 4 mL/min)对混合物进行制备纯化[洗脱液: V(MeCN):V(H₂O)＝3:7], 得到7-O-methylbrevicolide A (12) (8 mg, t_R＝22 min), 收率为76.8%.相同的方法制得brevicolide B (2)的甲基化衍生物7-O-methylbrevicolide B (13) (6.8 mg, t_R＝19 min), 收率为65.3%.

  7-O-Methylbrevicolides A (12)和B (13)的手性拆分:将8 mg 7-O-methylbrevicolide A (12)配置成10 mg/mL溶液, 利用HPLC (Chiralpac IC column, 5 μm, 4.6 mm×250 mm, 1 mL/min)进行手性拆分[洗脱液: V(EtOH):V(n-C₆H₁₄)＝3:7], 得到了化合物12的一对对映异构体(–)-7-O-methylbrevicolide A (12a) (3 mg, t_R＝31 min)与(+)-7-O-methylbrevicolide A (12b) (2.8 mg, t_R＝34 min) (图S43);利用相同的拆分方法可以得到7-O-methylbrevicolide B (13)的一对对映异构体(－)-7-O-methylbrevicolide B (13a) (3 mg, t_R＝36 min)与(+)-7-O-methylbrevicolide B (13b) (3.3 mg, t_R＝40 min).

  7-O-Methylbrevicolide A (12): ¹H NMR (DMSO-d₆, 600 MHz) δ: 5.28 (s, 2H, H-3), 3.94 (s, 3H, 7-OCH₃), 2.14 (s, 3H, H-8), 3.78 (s, 3H, H-9), 2.78 (dd, J＝13.2, 10.3 Hz, 1H, H-1'a), 2.64 (dd, J＝13.1, 2.3 Hz, 1H, H-1'b), 3.77 (dd, J＝8.7, 2.3 Hz, 1H, H-2'), 1.40 (s, 3H, 3'-CH₃), 2.36 (ddd, J＝12.8, 10.0, 6.8 Hz, 1H, H-4'a), 1.87 (ddd, J＝12.6, 10.3, 6.5 Hz, 1H, H-4'b), 2.59 (ddd, J＝17.2, 10.4, 7.0 Hz, 1H, H-5'a), 2.55 (ddd, J＝17.2, 10.0, 6.5 Hz, 1H, H-5'b), 5.11 (brs, 1H, 2'-OH); ¹³C NMR (DMSO-d₆, 150 MHz) δ: 168.5 (C, C-1), 68.4 (CH₂, C-3), 147.8 (C, C-3a), 120.1 (C, C-4), 163.0 (C, C-5), 126.5 (C, C-6), 156.3 (C, C-7), 111.8 (C, C-7a), 62.1 (CH₃, 7-OCH₃), 11.3 (CH₃, C-8), 60.6 (CH₃, C-9), 26.4 (CH₂, C-1'), 73.5 (CH, C-2'), 88.4 (C, C-3'), 22.2 (CH₃, 3'-CH₃), 28.2 (CH₂, C-4'), 29.0 (CH₂, C-5'), 176.8 (C, C-6'); HRESIMS calcd for C₁₈H₂₃O₇ [M+H]⁺ 351.1438, found 351.1432.

  (－)-7-O-Methylbrevi-colide A (12a): [α]_D¹⁶－14.0 (c 0.17, MeOH); (+)-7-O-methylbrevicolide A (12b):[α]_D¹⁶+11.6 (c 0.26, MeOH).

  7-O-Methylbrevicolide B (13): ¹H NMR (DMSO-d₆, 600 MHz) δ: 5.28 (s, 2H, H-3), 3.94 (s, 3H, 7-OCH₃), 2.14 (s, 3H, H-8), 3.77 (s, 3H, H-9), 2.82 (t, J＝12.5 Hz, 1H, H-1'a), 2.65 (brd, J＝12.8 Hz, 1H, H-1'b), 3.73 (brd, J＝12.2 Hz, 1H, H-2'), 1.41 (s, 3H, 3'-CH₃), 2.22~2.30 (m, 1H, H-4'a), 1.90~1.97 (m, 1H, H-4'b), 2.60 (dd, J＝17.4, 8.5 Hz, 1H, H-5'a), 2.53 (dd, J＝17.4, 8.0 Hz, 1H, H-5'b), 5.07 (brs, 1H, 2'-OH); ¹³C NMR (DMSO-d₆, 150 MHz) δ: 168.4 (C, C-1), 68.4 (CH₂, C-3), 147.7 (C, C-3a), 120.0 (C, C-4), 162.9 (C, C-5), 126.6 (C, C-6), 156.3 (C, C-7), 111.8 (C, C-7a), 62.1 (CH₃, 7-OCH₃), 11.3 (CH₃, C-8), 60.6 (CH₃, C-9), 26.1 (CH₂, C-1'), 74.6 (CH, C-2'), 88.4 (C, C-3'), 22.1 (CH₃, 3'-CH₃), 29.1 (CH₂, C-4'), 30.2 (CH₂, C-5'), 176.9 (C, C-6'); HRESIMS calcd for C₁₈H₂₃O₇ [M+H]⁺ 351.1438, found 351.1436.

  (－)-7-O-Methylbrevicolide B (13a): [α]_D¹⁶－36.3 (c 0.2, MeOH); (+)-7-O-methylbrevicolide B (13b):[α]_D¹⁶+44.5 (c 0.2, MeOH).

  3.6   (－)-、(+)-7-O-Methylbrevicolides A和B MTPA酯的制备

  将2 mg的(－)-7-O-methylbrevicolide A (12a)平均分成两份, 分别与10 μL (S)-及(R)-MTPA chloride在充分回流干燥过的500 μL CH₂Cl₂与100 μL Et₃N的混合溶剂中进行反应, 并进行N₂保护. 5 h后以蒸馏水淬灭反应, 反应液以1 mL CH₂Cl₂萃取三次, 有机相彻底浓缩后以甲醇溶解, 利用半制备HPLC (YMC-pack ODS-A column, 5 μm, 4.6 mm×250 mm, 4 mL/min)对混合物进行制备纯化[洗脱液: V(MeCN):V(H₂O)＝6:4], 分别得到12a的(R)-MTPA酯12aa (0.9 mg, t_R＝21 min)和(S)-MTPA酯12ab (1.3 mg, t_R＝19 min).采用相同的方法, 获得(+)-7-O-methylbrevicolide A (12b)的(R)-MTPA酯12ba (1.0 mg, t_R＝19 min)和(S)-MTPA酯12bb (1.2 mg, t_R＝21 min); (－)-7-O-methylbrevicolide B (13a)的(R)-MTPA酯13aa (0.7 mg, t_R＝17 min)和(S)-MTPA酯13ab (0.6 mg, t_R＝15 min); (+)-7-O-methylbrevicolide B (13b)的(R)-MTPA酯13ba (0.8 mg, t_R＝15 min)和(S)-MTPA酯13bb (1.1 mg, t_R＝17 min).

  R-(－)-7-O-Methylbrevicolide A MTPA酯(12aa): [α]_D¹⁶－22.6 (c 0.09, MeOH); ¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) δ: 5.35 (s, 2H, H-3), 3.96 (s, 3H, 7-OCH₃), 2.15 (s, 3H, H-8), 3.75 (s, 3H, H-9), 3.01 (brd, J＝14.7 Hz, 1H, H-1'a), 3.09 (dd, J＝14.7, 9.9 Hz, 1H, H-1'b), 5.73 (brd, J＝10.2 Hz, 1H, H-2'), 1.50 (s, 3H, 3'-CH₃), 2.22 (ddd, J＝11.7, 10.9, 10.9 Hz, 1H, H-4'a), 2.06 (dd, J＝11.7, 10.9 Hz, 1H, H-4'b), 2.82 (ddd, J＝18.2, 10.4, 10.4 Hz, 1H, H-5'a), 2.43 (dd, J＝18.4, 10.2 Hz, 1H, H-5'b); HRESIMS calcd for C₂₈H₃₃O₉F₃ [M+NH₄]⁺ 584.2102, found 584.2101.

  S-(－)-7-O-Methylbrevicolide A MTPA酯(12ab): [α]_D¹⁶－11.4 (c 0.15, MeOH); ¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) δ: 5.29 (s, 2H, H-3), 3.85 (s, 3H, 7-OCH₃), 2.01 (s, 3H, H-8), 3.64 (s, 3H, H-9), 2.93 (brd, J＝14.7 Hz, 1H, H-1'a), 3.02 (dd, J＝14.7, 9.9 Hz, 1H, H-1'b), 5.72 (brd, J＝10.2 Hz, 1H, H-2'), 1.55 (s, 3H, 3'-CH₃), 2.37 (ddd, J＝11.7, 10.9, 10.9 Hz, 1H, H-4'a), 2.15 (dd, J＝11.7, 10.9 Hz, 1H, H-4'b), 2.84 (ddd, J＝18.2, 10.4, 10.4 Hz, 1H, H-5'a), 2.57 (dd, J＝18.4, 10.2 Hz, 1H, H-5'b); HRESIMS calcd for C₂₈H₃₃O₉F₃ [M+NH₄]⁺ 584.2102, found 584..

  R-(+)-7-O-Methylbrevicolide A MTPA酯(12ba): [α]_D¹⁶+11.5 (c 0.1, MeOH); ¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) δ: 5.30 (s, 2H, H-3), 3.85 (s, 3H, 7-OCH₃), 2.01 (s, 3H, H-8), 3.64 (s, 3H, H-9), 2.94 (brd, J＝14.7 Hz, 1H, H-1'a), 3.02 (dd, J＝14.7, 9.9 Hz, 1H, H-1'b), 5.72 (brd, J＝10.2 Hz, 1H, H-2'), 1.55 (s, 3H, 3'-CH₃), 2.38 (ddd, J＝11.7, 10.9, 10.9 Hz, 1H, H-4'a), 2.15 (dd, J＝11.7, 10.9 Hz, 1H, H-4'b), 2.84 (ddd, J＝18.2, 10.4, 10.4 Hz, 1H, H-5'a), 2.58 (dd, J＝18.4, 10.2 Hz, 1H, H-5'b); HRESIMS calcd for C₂₈H₃₃O₉F₃ [M+NH₄]⁺ 584.2102, found 584.2097.

  S-(+)-7-O-Methylbrevicolide A MTPA酯(12bb): [α]_D¹⁶+11.9 (c 0.18, MeOH); ¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) δ: 5.35 (s, 2H, H-3), 3.96 (s, 3H, 7-OCH₃), 2.15 (s, 3H, H-8), 3.75 (s, 3H, H-9), 3.01 (brd, J＝14.7 Hz, 1H, H-1′a), 3.09 (dd, J＝14.7, 9.9 Hz, 1H, H-1'b), 5.73 (brd, J＝10.2 Hz, 1H, H-2'), 1.50 (s, 3H, 3'-CH₃), 2.22 (ddd, J＝11.7, 10.9, 10.9 Hz, 1H, H-4'a), 2.06 (dd, J＝11.7, 10.9 Hz, 1H, H-4'b), 2.82 (ddd, J＝18.2, 10.4, 10.4 Hz, 1H, H-5'a), 2.43 (dd, J＝18.4, 10.2 Hz, 1H, H-5'b); HRESIMS calcd for C₂₈H₃₃O₉F₃ [M+NH₄]⁺ 584.2102, found 584.2104.

  R-(－)-7-O-Methylbrevicolide B MTPA酯(13aa): [α]_D¹⁶－4.3 (c 0.06, MeOH); ¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) δ: 5.34 (s, 2H, H-3), 3.99 (s, 3H, 7-OCH₃), 2.15 (s, 3H, H-8), 3.76 (s, 3H, H-9), 2.98 (dd, J＝14.5, 2.6 Hz, 1H, H-1'a), 3.09 (dd, J＝14.6, 10.2 Hz, 1H, H-1'b), 5.61 (dd, J＝10.2, 2.5 Hz, 1H, H-2'), 1.41 (s, 3H, 3'-CH₃), 2.14~2.25 (m, 1H, H-4'a), 2.11 (m, 1H, H-4'b), 2.73 (ddd, J＝17.8, 10.0, 7.8 Hz, 1H, H-5'a), 2.47 (ddd, J＝17.8, 9.9, 5.7 Hz, 1H, H-5'b); HRESIMS calcd for C₂₈H₃₃O₉F₃ [M+NH₄]⁺ 584.2102, found 584.2109.

  S-(－)-7-O-Methylbrevicolide B MTPA酯(13ab): [α]_D¹⁶－6.9 (c 0.05, MeOH); ¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) δ: 5.32 (s, 2H, H-3), 3.82 (s, 3H, 7-OCH₃), 2.01 (s, 3H, H-8), 3.58 (s, 3H, H-9), 2.89 (dd, J＝14.5, 2.6 Hz, 1H, H-1'a), 3.02 (dd, J＝14.6, 10.2 Hz, 1H, H-1'b), 5.68 (dd, J＝10.2, 2.5 Hz, 1H, H-2'), 1.54 (s, 3H, 3'-CH₃), 2.20~2.27 (m, 1H, H-4'a), 2.14~2.20 (1H, m, H-4'b), 2.79 (ddd, J＝17.8, 10.0, 7.8 Hz, 1H, H-5'a), 2.64 (ddd, J＝17.8, 9.9, 5.7 Hz, 1H, H-5'b); HRESIMS calcd for C₂₈H₃₃O₉F₃ [M+NH₄]⁺ 584.2102, found 584.2094.

  R-(+)-7-O-Methylbrevicolide B MTPA酯(13ba): [α]_D¹⁶+3.0 (c 0.05, MeOH); ¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) δ: 5.32 (s, 2H, H-3), 3.82 (s, 3H, 7-OCH₃), 2.01 (s, 3H, H-8), 3.58 (s, 3H, H-9), 2.91 (dd, J＝14.5, 2.6 Hz, 1H, H-1'a), 3.03 (dd, J＝14.6, 10.2 Hz, 1H, H-1'b), 5.69 (dd, J＝10.2, 2.5 Hz, 1H, H-2'), 1.54 (s, 3H, 3'-CH₃), 2.20~2.27 (m, 1H, H-4'a), 2.14~2.20 (m, 1H, H-4'b), 2.79 (ddd, J＝17.8, 10.0, 7.8 Hz, 1H, H-5'a), 2.64 (ddd, J＝17.8, 9.9, 5.7 Hz, 1H, H-5'b); HRESIMS calcd for C₂₈H₃₃O₉F₃ [M+NH₄]⁺ 584.2102, found 584.2109.

  S-(+)-7-O-Methylbrevicolide B MTPA酯(13bb): [α]_D¹⁶+19.9 (c 0.1, MeOH); ¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz) δ: 5.34 (s, 2H, H-3), 3.99 (s, 3H, 7-OCH₃), 2.15 (s, 3H, H-8), 3.76 (s, 3H, H-9), 2.97 (dd, J＝14.5, 2.6 Hz, 1H, H-1'a), 3.09 (dd, J＝14.6, 10.2 Hz, 1H, H-1'b), 5.62 (dd, J＝10.2, 2.5 Hz, 1H, H-2'), 1.41 (s, 3H, 3'-CH₃), 2.15~2.25 (m, 1H, H-4'a), 2.10~2.15 (m, 1H, H-4'b), 2.73 (ddd, J＝17.8, 10.0, 7.8 Hz, 1H, H-5'a), 2.48 (ddd, J＝17.8, 9.9, 5.7 Hz, 1H, H-5'b); HRESIMS calcd for C₂₈H₃₃O₉F₃ [M+NH₄]⁺ 584.2102, found 584.2104.

  3.7   化合物活性测试

  化合物1~11对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC6538)、铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa ATCC10145)、大肠杆菌(Escherichia coli ATCC11775)、产气杆菌(Enterobacter aerogenes ATCC 13048)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ATCC 6051)、光滑念珠菌(Candida glabrata ATCC2001) 及白色念珠菌(Candida albicans ATCC10231) 的抑菌活性初筛采用药敏纸片法进行, 初筛浓度设为100 μg/mL.对有活性的化合物3, 再采用二倍稀释法, 用96孔板测定其MIC值.两种方法采用相同的菌液制备方法:将平板或斜面中培养好的菌落接种在含有30 mL培养基的塑料离心管中, 28 ℃, 180 r/min摇床培养12~24 h.操作方法如下.

  药敏纸片法:将化合物和阳性药环丙沙星(病原细菌)或酮康唑(病原真菌)配制成100 μg/mL的甲醇溶液, 各取10 μL加到提前切好的无菌圆形滤纸片上, 将纸片在酒精灯前烘干备用.将制备好的菌液均匀地涂布在配置好的病原细菌(LB)或病原真菌(PDA)培养基上, 待菌液被充分吸收后将已加样品的滤纸片贴到培养基上, 用镊子压实.每个样品设置三个平行.平板倒置用保鲜袋包好后放入28 ℃培养箱中培养24 h.观察有无抑菌圈产生.

  96孔板法:配制120 μg/mL化合物3的二甲亚砜(DMSO)溶液, 并用新鲜的酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)培养基将之稀释为6 μg/mL, 之后采用二倍稀释法继续依次稀释为3, 1.5, 0.75和0.38 μg/mL.将稀释好的样品加入药敏板中, 每孔100 μL.将菌液用新鲜的YPD培养基稀释至5×10⁵ Cuf/mL, 依次加入各孔, 每孔100 μL.本次实验设置空白对照组(200 μL YPD培养基)和阴性对照组(100 μL YPD培养基和100 μL菌液).每组实验设置三个平行. MIC定义为无菌落生长的最小浓度.

  化合物1~11对烟曲霉(Aspergillus fumigates, AF293) 的抑菌活性初筛:刮取PDA平板上的成熟烟曲霉孢子于盛有3 mL生理盐水的研钵中, 将之研匀, 转移至无菌试管中, 静置10 min, 取液面下方1/2~2/3处的液体, 用过滤好的无菌1640培养基将菌稀释至2.0×10⁴ CFU/mL.将菌液加入96孔板中, 每孔100 μL.将配制好的20 mg/mL的化合物DMSO溶液用无菌水稀释至200 μg/mL, 加入到上述含有菌液的96孔板中(终浓度100 μg/mL).本次实验设置阴性对照组(100 μL 1640培养基和100 μL无菌水)生长对照组(100 μL菌液和100 μL无菌水)和阳性对照组(100 μL菌液和100 μL浓度为5 μg/mL的伊曲康唑).每组实验设置三个平行, 有抑菌活性再用二倍稀释法测试其MIC值.

  肿瘤细胞毒活性采用MTT法测试.所选细胞模型为小鼠白血病细胞P388、人口腔上皮癌细胞KB、人结直肠癌细胞HT29、人乳腺癌细胞MCF-7、人肺癌细胞A549, 正常细胞为人胚肾细胞Hek293和大西洋鲑鱼肾细胞ASK, 阳性对照选择Ellipticine(椭圆玫瑰树碱).用含7%胎牛血清和93% RPMI-1640培养基的混合液将处于对数生长期的肿瘤细胞稀释成3×10⁵个/mL, 将之接种于96孔板中, 每孔100 μL, 置于37 ℃、CO₂浓度为5%的培养箱中于培养12 h.化合物先用细胞级DMSO配成浓度为2 mmol•L^－1的溶液, 再用RPMI-1640培养基稀释100倍至浓度为20 μmol•L^－1.阳性药先配制成浓度为200 μmol•L^－1的细胞级DMSO溶液, 再用RPMI-1640培养基稀释100倍至浓度为2 μmol•L^－1.实验设置空白对照组和阳性对照组, 其中空白对照为RPMI-1640培养基, 阳性对照为配好的2 μmol•L^－1的Ellipticine, 每孔加入100 μL待测液, 每种待测液设置三个平行.继续培养72 h后, 每孔加入20 μL浓度为5 mg/mL的MTT溶液进行染色.继续培养4 h后, 小心甩净孔内溶液, 向每孔加入150 μL分析纯DMSO, 在微孔振荡仪上低速振荡5 min, 用酶标仪测定各个孔在570 nm下的吸光度(OD值), 进而计算出样品对肿瘤细胞的增值抑制率(IR%).对抑制率在50%以上的化合物, 再设置5个浓度梯度进行化合物IC₅₀的测试.

  辅助材料(Supporting Information)  化合物1, 2, 12, 13的谱图数据、手性分析及部分化合物的ECD数据.这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.

• 1. [1]

     赵成英, 朱统汉, 朱伟明, 有机化学, 2013, 33, 1195. http://sioc-journal.cn/Jwk_yjhx/CN/abstract/abstract342155.shtmlZhao, C.-Y.; Zhu, T.-H.; Zhu, W.-M. Chin. J. Org. Chem. 2013, 33, 1195(in Chinese). http://sioc-journal.cn/Jwk_yjhx/CN/abstract/abstract342155.shtml

  2. [2]

     Ma, H.-G.; Liu, Q.; Zhu, G.-L.; Liu, H.-S.; Zhu, W.-M. J. Asian Nat. Prod. Res. 2016, 18, 92. doi: 10.1080/10286020.2015.1127230

  3. [3]

     Regina, S.; Christina, B.; Alban, R.; Jens, H. ISME J. 2010, 4, 159. doi: 10.1038/ismej.2009.106

  4. [4]

     Jekkel, A.; Barta, I.; Boros, S.; Sütő, J.; Horváth, G.; Szabó, Z.; Ambrus, G. J. Mol. Catal. B:Enzym. 2002, 19~20, 209.

  5. [5]

     Habib, E.; León, F.; Bauer, J. D.; Hill, R. A.; Carvalho, P.; Cutler, H. G.; Cutler, S. J. J. Nat. Prod. 2008, 71, 1915. doi: 10.1021/np8003497

  6. [6]

     Hemphill, C. F. P.; Daletos, G.; Liu, Z.; Lin, W.-H.; Proksch, P. Tetrahedron Lett. 2016, 57, 2078. doi: 10.1016/j.tetlet.2016.03.101

  7. [7]

     Kumagai, H.; Amemiya, M.; Naganawa, H.; Sawa, T.; Ishizuka, M.; Takeuchi, T. J. Antibiot. 1994, 47, 440. doi: 10.7164/antibiotics.47.440

  8. [8]

     Williams, R. M.; Kwast, E.; Coffman, H.; Glinka, T. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 3064. doi: 10.1021/ja00190a050

  9. [9]

     贾彦来, 管菲菲, 马洁, 王长云, 邵长伦, 中国海洋药物, 2016, 35, 35.Jia, Y.-L.; Guan, F.-F.; Ma, J.; Wang, C.-Y.; Shao, C.-L. Chin. J. Mar. Drugs 2016, 35, 35(in Chinese).

  10. [10]

      Kato, H.; Nakamura, Y.; Finefield, J. M.; Umaoka, H.; Nakahara, T.; Williams, R. M.; Tsukamoto, S. Tetrahedron Lett. 2011, 52, 6923. doi: 10.1016/j.tetlet.2011.10.065

  11. [11]

      Kato, H.; Nakamura, Y.; Finefield, J. M.; Umaoka, H.; Nakahara, T.; Williams, R. M.; Tsukamoto, S. Tetrahedron Lett. 2014, 55, 559. doi: 10.1016/j.tetlet.2013.11.076

  12. [12]

      Lu, X.-H.; Zheng, Z.-H.; Zhang, H.; Huo, C.-H.; Dong, Y.-S.; Ma, Y.; Ren, X.; Ke, A.-B.; He, J.-G.; Gu, Y.-C.; Shi, Q.-W. J. Antibiot. 2009, 62, 527. doi: 10.1038/ja.2009.54

  13. [13]

      Campbell, I. M.; Calzadilla, C. H.; McCorkindale, N. J. Tetrahedron Lett. 1966, 42, 5107.

  14. [14]

      Allison, A. C.; Eugui, E. M. Clin. Transplant. 1993, 7, 96.

  15. [15]

      Bentley, R. Chem. Rev. 2000, 100, 3801. doi: 10.1021/cr990097b

  16. [16]

      Chen, Z.; Zheng, Z.; Huang, H.; Song, Y.; Zhang, X.; Ma, J.; Wang, B.; Zhang, C.; Ju, J. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2012, 22, 3332. doi: 10.1016/j.bmcl.2012.02.106

  17. [17]

      Jones, D. F.; Moore, R. H.; Crawley, G. C. J. Chem. Soc. C 1970, 12, 1725.

  18. [18]

      Uchida, K.; Watanabe, H.; Usui, T.; Osada, H.; Kitahara, T. Heterocycles 1998, 48, 2049. doi: 10.3987/COM-98-8246

  19. [19]

      Fujimoto, H.; Fujimaki, T.; Okuyama, E.; Yamazaki, M. Chem. Pharm. Bull. 1999, 47, 1426. doi: 10.1248/cpb.47.1426

  20. [20]

      Ayer, W. A.; Browne, L. M.; Feng, M. C.; Orszanska, H.; Saeedighomi, H. Can. J. Chem. 1986, 64, 904. doi: 10.1139/v86-149

  21. [21]

      Birch, A. J.; Wright, J. J. Tetrahedron 1970, 26, 2329. doi: 10.1016/S0040-4020(01)92812-1

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  图 1  化合物1和2的¹H-¹H COSY和主要的HMBC的相关

  Figure 1  ¹H-¹H COSY and key HMBC correlations of compounds 1 and 2

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  图式 1  化学转化霉酚酸为化合物1和2

  Scheme 1  Chemical transformation of mycophenolic acid to compounds 1 and 2

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  图式 2  化合物1和2的甲基化及其手性拆分

  Scheme 2  Methylation of compounds 1 and 2 and their chiral separation

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  图 2  (－)-12和(+)-12以及(－)-13和(+)-13的(S)-和(R)-MTPA酯的Δδ (δ_S－δ_R)值

  Figure 2  Δδ (δ_S－δ_R) values of (S)-and (R)-MTPA esters of (－)-12 & (+)-12 and (－)-13 & (+)-13

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  表 1  化合物1和 2的¹H NMR (500 MHz)和¹³C NMR (125 MHz)数据(DMSO-d₆, TMS)

  Table 1.  ¹H NMR (500 MHz) and ¹³C NMR (125 MHz) data of compound 1 and 2 (DMSO-d₆, TMS)

  Position	1		2
  	δC	δH (J in Hz)	δC	δH (J in Hz)
  1	169.7 (C)		169.8 (C)
  3	68.4 (CH2)	5.24 (s)	68.4 (CH2)	5.23 (s)
  3a	146.4 (C)		146.3 (C)
  4	115.8 (C)		115.9 (C)
  5	163.0 (C)		163.0 (C)
  6	120.5 (C)		120.7 (C)
  7	153.8 (C)		153.7 (C)
  7-OH		9.58 (s)		9.60 (s)
  7a	107.0 (C)		107.1 (C)
  8	11.1 (CH3)	2.09 (s)	11.1 (CH3)	2.09 (s)
  9	60.7 (CH3)	3.74 (s)	60.7 (CH3)	3.74 (s)
  1'	26.2 (CH2)	2.77 (dd, 13.7, 1.3), 2.70 (dd, 13.5, 9.9)	26.0 (CH2)	2.78 (dd, 13.8, 2.1), 2.71 (dd, 13.8, 9.9)
  2'	74.1 (CH)	3.82 (ddd, 9.7, 4.1, 1.3)	75.2 (CH)	3.77 (dd, 9.6, 2.1)
  2'-OH		5.77 (d, 4.1)		5.74 (br s)
  3'	88.2 (C)		88.3 (C)
  4'	28.1 (CH2)	2.36 (ddd, 12.6, 10.2, 7.5), 1.87 (ddd, 12.6, 10.4, 6.3)	30.0 (CH2)	2.25 (ddd, 13.5, 10.3, 7.4), 1.93 (ddd, 13.5, 10.5, 5.9)
  5'	28.9 (CH2)	2.62 (ddd, 17.6, 10.4, 7.5), 2.55 (ddd, 17.6, 10.2, 6.4)	29.0 (CH2)	2.63 (ddd, 17.7, 10.4, 7.4), 2.54 (ddd, 17.6, 10.3, 6.1)
  6'	176.6 (C)		176.8 (C)
  3'-Me	22.2 (CH3)	1.40 (s)	21.9 (CH3)	1.40 (s)

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  表 2  化合物3的肿瘤细胞毒活性[IC₅₀/(μmol•L^－1)]

  Table 2.  Cytotoxicity of compound 3 [IC₅₀/(μmol•L^－1)]

  化合物	P388	KB	HT29	MCF-7	A549	Hek293	ASK
  3	0.4	5.29	5.47	0.99	0.86	0.57	0.82
  Ellipticine	1.77	2.31	2.24	2.08	1.08	1.95	2.02

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