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熊果酸A环衍生物的合成及抗肿瘤活性研究

孟艳秋 ,  曹佳 ,  汤义 ,  鹿学宇 ,  刘立伟

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引用本文: 孟艳秋, 曹佳, 汤义, 鹿学宇, 刘立伟. 熊果酸A环衍生物的合成及抗肿瘤活性研究[J]. 有机化学, 2016, 36(5): 1080-1087. doi: 10.6023/cjoc201510034 shu
Citation:  Meng Yanqiu, Cao Jia, Tang Yi, Lu Xueyu, Liu Liwei. Synthesis and Anti-tumor Activity of Derivatives of Ring A of Ursolic Acid[J]. Chinese Journal of Organic Chemistry, 2016, 36(5): 1080-1087. doi: 10.6023/cjoc201510034 shu

熊果酸A环衍生物的合成及抗肿瘤活性研究

  • 1.

    沈阳化工大学制药工程教研室 沈阳 110142

    • 通讯作者: 孟艳秋,E-mail: mengyanqiu@hotmail.com
  • 基金项目:

    和沈阳市科学技术计划 No.F16-230-6-00

    国家自然科学基金 No.21372156

    辽宁省教育厅高等学校优秀人才支持计划 No.LR2013017

摘要: 以天然产物熊果酸为起始原料,在A环上引入含氮、氧杂环,同时对其C(28)位羧基进行酰胺化结构修饰,设计合成了10个新的熊果酸衍生物,其结构经过1H NMR、13C NMR、MS和元素分析确认.采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法,选用高表达人口腔表皮样癌细胞(KB)和人胃癌细胞(SGC7901)对它们进行初步的体外抗肿瘤活性研究.结果表明,所测化合物对KB和SGC7901肿瘤细胞的抑制活性均明显强于熊果酸,其中化合物UA4-1和UA4-2对SGC7901肿瘤细胞的抑制效果显著,在10μg/mL浓度下IC50值分别为0.289和0.04μmol/L,活性明显高于已上市药物吉非替尼(IC50=1.03μmol/L).

English

  • 

    熊果酸(Ursolic acid,UA)又名乌索酸、乌苏酸,属于五环三萜类化合物[1],在自然界中广泛分布于白花蛇舌草、女贞子、乌梅、夏枯草等植物中. 熊果酸及其衍生物具有广泛的生物活性,包括抗病毒[2]、抗菌[3]、保肝和抗炎[4]以及抗肿瘤作用[5]. 通过对熊果酸的抗肿瘤活性研究,发现其通过抑制细胞的增殖来诱导细胞凋亡[6, 7]. 近年来,熊果酸结构修饰主要集中于对A环、C环和C(28)位羧基的改造[8, 9]. 熊果酸C(3)位羟基通过EDCI介导的偶联反应[10]得到相应的化合物1,产率较高. Meng课题组[11]在C(3),C(28)位引入氨基酸、氨基醇、氨基酸酯以及芳胺等不同基团,体外HeLa细胞抑制试验显示,C(3)位羟基乙酰化和C(28)位同时连有氨基醇或苄胺或杂环胺类化合物的结构类似物抗肿瘤活性均高于UA; 但若C(3)位乙酰基水解,只保留C(28)酰胺结构,化合物活性下降; C(28)酰胺结构的烷基支链越多对抗肿瘤活性越不利,若支链上含有苯环的结构,其活性普遍很好,且苯环上具有供电子基团的化合物作用效果比无取代基或连有吸电子基团的化合物要强[12～15]. Chen课题组[16]对熊果酸A环及C(28)位进行结构修饰,得到化合物2. 体内和体外的抗骨髓瘤细胞活性研究结果表明,化合物2通过诱导骨肉瘤细胞凋亡和阻滞细胞分裂G1期,显著抑制骨肉瘤细胞的存活率,同时抑制应激活化蛋白激酶(JNK)信号通路,使得caspase-3蛋白增加. Fu等[17]通过对熊果酸C(28)位引入酰胺,C(3)位连接苯并异噁唑环得到化合物3来增加其对TPH-1的抑制活性,显著抑制蛋白质TPH-1及其mRNA的表达. 表面等离子体共振技术(SPR)研究表明,化合物3具有较强的亲和力,通过抑制血清素的生物合成防止骨质流失,而无去卵巢雌激素副作用.

    以上文献报道对熊果酸的结构修饰主要集中在C(3)位羟基以及C(28)位羧基. 本文是对熊果酸进行研究,主要对熊果酸A环及C(28)位进行结构修饰,获得相应的衍生物,并运用计算机辅助药物分子对接进行模拟,在A环上引入含氮、氧杂环,同时对其C(28)位羧基进行酰胺化结构修饰,设计合成了10个新型熊果酸衍生物,并对化合物进行了体外抗肿瘤活性的研究.

    1    结果与讨论

    1.1    化学合成

    以UA为原料,将C(3)位羟基与Jones试剂反应得到3-氧代熊果酸(UA1),同时C(28)位羧基与胺反应成酰胺,得到UA2系列5个N-(3-羰基-乌索烷-12-烯-28-酰)胺类化合物. 在甲酸乙酯、甲醇钠的反应条件下,将熊果酸C(2)位引入醛基,得到UA3系列5个N-(2-羟甲叉基-3-羰基-乌索烷-12-烯-28-酰)-胺类化合物. 进一步与水合肼(或盐酸羟胺)反应,在A环引入吡唑和异噁唑环,分别得到UA4系列5个N-{乌索烷并[2, 3]吡唑-12-烯-28-酰}-胺类化合物、UA5系列5个N-{乌索烷并[2, 3]异噁唑-12-烯-28-酰}-胺类化合物. 目标化合物的合成路线见Scheme 1.

    1.2    生物活性评价

    表1 目标化合物对KB细胞和SGC7901细胞的活性抑制 Table1. Inhibitory activity of the target compounds on the KBand SGC7901cells.
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    Compd. 抑制率a/% IC50/(μmol•L-1)
    KB SGC7901 KB SGC7901
    UA 11.63 9.31 ＞50 ＞50
    UA4-1 52.78 55.98 13.23 0.29
    UA4-2 60.21 66.72 6.88 0.04
    UA4-3 51.41 42.55 25.63 18.71
    UA4-4 39.82 43.27 28.52 16.58
    UA4-5 33.28 40.46 ＞50 ＞50
    UA5-1 29.71 32.67 29.60 ＞50
    UA5-2 37.88 40.98 7.69 ＞50
    UA5-3 32.17 27.33 30.17 20.23
    UA5-4 28.06 29.58 ＞50 12.35
    UA5-5 33.47 23.47 ＞50 ＞50
    吉非替尼 42.95 45.21 20.48 1. 03
    阿霉素 46.88 48.29 2.33 1. 91
    a化合物浓度为10 μg/mL,经过72 h处理后的细胞抑制率.
    表1 目标化合物对KB细胞和SGC7901细胞的活性抑制
    Table1. Inhibitory activity of the target compounds on the KBand SGC7901cells.

    以吉非替尼(Gefitinib)和阿霉素(adriamycin)为阳性对照物,采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法测试目标化合物体外抗肿瘤活性,活性数据见表 1.

    分析肿瘤细胞形态变化图可知,持续用药蓄积72 h后,菱形呈片状分布的SGC7901细胞逐步呈现碎块状、空泡,逐步出现细胞凋亡的形态特征,而空白对照组的SGC7901细胞仍具有完整细胞膜,细胞株呈连片堆积的恶性增殖状态. 由对比观察可以得出,化合物UA4-1和UA4-2对其细胞有显著的抑制作用.

    经化合物UA4-1和UA4-2处理72 h后,KB和SGC7901细胞形态发生变化(见图 1和图 2).

    图2 不同化合物给药72 h后SGC7901细胞形态变化及正常细胞对照图

    Figure 2. Morphological changes of SGC7901 cells induced by different compounds affer 72 h

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    图图式1 熊果酸衍生物的合成

    Figure 图式1. Synthesis of derivatives of ursolic acid

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    图1 不同化合物给药72 h后KB细胞形态变化及正常细胞对照图

    Figure 1. Morphological changes of KB cells induced by different compounds after 72 h

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    从表 1中可以看出,所测试的目标化合物对KB和SGC7901细胞的生长均具有一定的抑制作用,且优于母体UA. 尤其是化合物UA4-1、UA4-2对2种肿瘤细胞表现出显著的抑制作用,在 10 μmol/L 浓度下对KB细胞的抑制率分别为52.78%和60.21%,其IC50值分别为 13.23和6.88 μmol/L; 对SGC7901细胞的抑制率分别为55.98%和66.72%,其IC50值分别为0.298和0.04 μmol/L,尤其是对SGC7901 细胞的抑制率分别是阳性对照物吉非替尼的3.6和25.8倍,是阿霉素的6.6和47.8倍.

    1.3    分子对接

    图3 UA4-2和UA5-2与人源性Tph-1结晶模型的分子对接模型

    Figure 3. Molecular docking model of UA4-2 and UA5-2 with human derived Tph-1 crystal model

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    由于Tph-1的晶体结构被建立(PDB编号: 1mlw),本文将化合物用molegro virtual docker软件与之对接,并用Discovery studio 4.0直观分析化合物与靶点的结合情况. 发现所设计的熊果酸衍生物插入了靶点的疏水口袋当中,与周围的一些氨基酸紧密相连. 从图 3可以观察到UA4-2、UA5-2与氨基酸利用疏水键、π-s键和π-alkyl键等相互作用,使化合物分子在疏水口袋里牢固的固定. 键能在此次分子对接过程中没有测量.

    2    结论

    为了寻求抗肿瘤活性好的新候选化合物,熊果酸(UA)为先导化合物,运用计算机辅助药物分子对接进行模拟,在A环上引入含氮、氧杂环,同时C(28)位羧基成酰胺,最终设计合成的10个新型的熊果酸衍生物,其结构经1H NMR和MS所表征. 对人口腔表皮样癌细胞(KB)和人胃癌细胞(SGC7901)均表现出较好的增殖抑制活性. 尤其是化合物UA4-1和UA4-2对SGC7901细胞的抑制率分别是阳性对照物吉非替尼的3.6和25.8倍,是阿霉素的6.6和47.8倍. 在化合物UA4系列中,对SGC7901细胞的IC50值UA4-2＞UA4-1＞UA4-4＞UA4-3＞UA4-5,说明苯环上碳链的延长和吸电子基团不利于抗肿瘤活性. UA4-1、UA4-2＞UA5-1＞UA5-2,说明熊果酸A环引入吡唑环比异噁唑环抗肿瘤活性更好. 这对熊果酸衍生物的进一步结构设计、优化和药理活性研究具有一定的指导意义,为今后研究和开发高效、低毒的抗肿瘤药物打下良好的基础.

    3    实验部分

    3.1    仪器与试剂

    Büchi B-540型熔点测定仪; BrukerARX-600型核磁共振分析仪,CDCl3为溶剂,TMS为内标; 热电-菲尼根LCQ型质谱仪. 熊果酸购于广西昌洲天然产物有限公司; 薄层色谱硅胶GF254购于深圳市宇恒硅橡胶制品有限公司; 显色剂为10%硫酸乙醇溶液; 活性测试所用的RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清,100 U/mL青霉素,100 μg/mL链霉素); 溴化四氮唑盐(MTT)、蛋白酶K(Proteinase K)和小牛血清蛋白(BSA) 购于上海图赫实业有限公司; KB细胞和SGC7901细胞由沈阳药科大学药理教研室提供; 阳性对照物吉非替尼J20070047购于阿斯利康制药有限公司. 所有试剂均为分析纯或化学纯.

    3.2    实验方法

    3.2.1    中间体的合成

    N-(2-羟甲叉基-3-羰基-乌索烷型-12-烯-28-酰)-3- 氯-4-氟苯胺(UA3-5)的合成: 按照化合物UA3的合成方法,将化合物UA2-5和甲醇钠、甲酸乙酯反应,得到中间体UA3-5,该化合物为烯醇结构不稳定,所以无需处理直接投入下一步反应.

    N-(2-羟甲叉基-3-羰基-乌索烷-12-烯-28-酰)-苄胺(UA3-2)的合成: 按照化合物UA3的合成方法,将化合物UA2-2和甲醇钠、甲酸乙酯反应,得到中间体UA3-2,该化合物为烯醇结构不稳定,所以无需处理直接投入下一步反应.

    N-(3-羰基-乌索烷-12-烯-28-酰)-苄胺(UA2-2)的合成: 照化合物UA2的合成方法,将化合物UA2中C(28)位引入苄胺. 粗品用硅胶柱色谱纯化[洗脱剂: V(石油醚):V(乙酸乙酯)=3:1],得淡黄色固体,产率为58.7%. m.p. 198.7～199.5 ℃.

    3-羰基-乌索烷-12-烯-28-酸(UA1)的合成[10]: 于茄形瓶中加入300 mg (0. 66 mol)熊果酸,30 mL丙酮,冰水浴冷却下滴加新配置的Jones试剂至反应液10 min内红褐色不褪去,升温至室温,反应1 h,TLC监测反应终点[展开剂: V(石油醚):V(乙酸乙酯)=3:1]. 反应完毕,加4 mL异丙醇,反应液变绿,室温搅拌30 min,淬灭剩余的氧化剂. 反应完成后,用乙酸乙酯和饱和的食盐水萃取3次,合并有机相(清亮液体),加入无水硫酸钠干燥过夜,抽滤旋蒸,浓缩得白色3-羰基-乌索烷-12-烯- 28-酸(即3-氧代熊果酸)粗品291 mg. 快速柱层析[脱洗剂为V(石油醚):V(乙酸乙酯)=5:1],分离纯化浓缩,室温干燥得固体,产率为83.33%. m.p. 233.2～234.5 ℃.

    N-(2-羟甲叉基-3-羰基-乌索烷-12-烯-28-酰)-胺类(UA3)的合成[18]: 于茄形瓶中加入上一反应产物100 mg,20 mL二氯甲烷,甲醇钠0.1 g,甲酸乙酯0.1 mL,反应10 h,TLC监测反应终点[展开剂: V(石油醚):V(乙酸乙酯)=3:1],反应完毕减压蒸除反应溶剂二氯甲烷 ,用乙酸乙酯和饱和食盐水萃取3次,合并有机相(黄色澄明液体),减压蒸除乙酸乙酯,得到N-(2-羟甲叉基-3-羰基-乌索烷-12-烯-28-酰)-胺类粗品.

    N-(3-羰基-乌索烷-12-烯-28-酰)-对异丙基胺(UA2-4)的合成: 照化合物UA2的合成方法,将化合物UA2中C(28)位引入对异丙基苯胺. 粗品用硅胶柱色谱纯化[洗脱剂: V(石油醚):V(乙酸乙酯)=5:1],得淡黄色固体,产率为43.3%. m. p. 210.6～211.4 ℃.

    N-(2-羟甲叉基-3-羰基-乌索烷-12-烯-28-酰)-对异丙基苯胺(UA3-4)的合成: 按照化合物UA3的合成方法,将化合物UA2-4和甲醇钠、甲酸乙酯反应,得到中间体UA3-4,该化合物为烯醇结构不稳定,所以无需处理直接投入下一步反应.

    N-(3-羰基-乌索烷-12-烯-28-酰)-3-氯-4-氟苯胺(UA2-5)的合成: 照化合物UA2的合成方法,将化合物UA2中C(28)位引入3-氯-苯胺. 粗品用硅胶柱色谱纯化[洗脱剂: V(石油醚):V(乙酸乙酯)=5:1],得淡黄色固体,产率为48.1%. m. p. 213.8～214.5 ℃.

    N-(2-羟甲叉基-3-羰基-乌索烷-12-烯-28-酰)-苯胺(UA3-1)的合成: 按照化合物UA3的合成方法,由化合物UA2-1和甲醇钠、甲酸乙酯反应,得到中间体UA3-1,该化合物为烯醇结构不稳定,所以无需处理直接投入下一步反应.

    N-(3-羰基-乌索烷-12-烯-28-酰)-苯胺(UA2-1)的合成: 照化合物UA2的合成方法,将化合物UA2中C(28)位引入苯胺. 粗品用硅胶柱色谱纯化[洗脱剂: V(石油醚):V(乙酸乙酯)=3:1],得淡黄色固体,产率为60.3%. m. p. 193.4～194.6 ℃.

    N-(3-羰基-乌索烷-12-烯-28-酰)-间甲氧基苯胺(UA2-3)的合成: 照化合物UA2的合成方法,将化合物UA2中C(28)位引入间甲氧基苯胺. 粗品用硅胶柱色谱纯化[洗脱剂: V(石油醚):V(乙酸乙酯)=5:1],得淡黄色固体,产率为47.3%. m. p. 202.5～203.9 ℃.

    N-(3-羰基-乌索烷-12-烯-28-酰)胺类(UA2)的合 成[17]: 于茄形瓶中加入上一反应产物200 mg,20 mL二氯甲烷,2 mL草酰氯,加入2滴DMF作为催化剂,在室温下搅拌4 h,TLC监测反应终点[展开剂: V(石油醚):V(乙酸乙酯)=3:1],反应完毕,减压蒸除溶剂二氯甲烷,用环己烷洗两次再进行旋蒸,得3-氧代-乌苏烷型- 12-烯-28-酰氯粗品,用二乙胺调pH至8～9,待pH稳定后再加入4 mL胺类,室温搅拌24 h,TLC监测反应终点[展开剂: V(石油醚):V(丙酮)=3:1],反应完成后,加入30 mL水,使其分层,用HCl调pH至3,减压蒸除反应溶剂,浓缩得黄色N-(3-羰基-乌索烷-12-烯-28-酰)胺类粗品.

    N-(2-羟甲叉基-3-羰基-乌索烷-12-烯-28-酰)-间甲氧基苯胺(UA3-3)的合成: 按照化合物UA3的合成方法,将化合物UA2-3和甲醇钠、甲酸乙酯反应,得到中间体UA3-3,该化合物为烯醇结构不稳定,所以无需处理直接投入下一步反应.

    3.2.2    目标化合物的合成

    N-{乌索烷并[2, 3]异噁唑-12-烯-28-酰}-对异丙基苯胺(UA5-4)的合成: 按照化合物UA5的合成方法,由化合物UA3-4和盐酸羟胺反应. 粗品用硅胶柱色谱纯化[洗脱剂: V(石油醚):V(乙酸乙酯)=10:1],得黄色固体,产率为48.7%. m.p. 207.3～204.7 ℃; 1H NMR (CDCl3,600 MHz) δ: 7.85 (s,1H),7.66 (s,1H),7.42 (d,J=8.6 Hz,2H),7.23 (d,J=4.5 Hz,2H),5.33 (s,1H),3.12 (s,1H),2.26～2.23 (m,1H),2.15～2.03 (m,3H),1.93～1.82 (m,3H),1.75～1.54 (m,4H),1.40～1.38 (m,4H),1.35～1.31 (m,6H),1.27 (s,3H),1.23 (s,3H),1.18 (s,3H),1.14 (s,3H),0.97 (s,3H),0.86 (d,J=4.6 Hz,3H),0.74 (s,3H); 13C NMR (150 MHz,CDCl3) δ: 176.1,174.2,152.6,150.0,144.2,140.1,136.5,126.8,125.7,113.5,54.2,53.3,48.6,45.9,42.6,39.8,39.4,39.2,38.7,36.9,35.5,34.6,31.9,31.7,30.7,29.6,28.7,27.8,24.9,24.6,24.4,23.4,23.1,21.1,18.6,17.1,16.5,15.4; MS (70 eV) m/z (%): 620 (M+,17),598 (32),596 (100),595 (25),524 (19). Anal. calcd for C40H56N2O2: C 80.49,H 9.46,N 4.69; found C 80.41,H 9.43,N 4.67.

    N-{乌索烷并[2, 3]吡唑-12-烯-28-酰}-苄胺(UA4-2)的合成: 按照化合物UA4的合成方法,由化合物UA3-2和水合肼反应. 粗品用硅胶柱色谱纯化[洗脱剂: V(石油醚):V(乙酸乙酯)=10:1],得淡黄色固体,产率为54.6%. m.p. 18 7.4～188.7 ℃; 1H NMR (CDCl3,600 MHz) δ: 7.78 (s,1H),7.40～7.27 (m,3H),7.23 (s,2H),7.15 (s,1H),6.16 (t,J=5.1 Hz,1H),5.27 (d,J=3.3 Hz,1H),4.52 (dd,J=14.5,5.8 Hz,1H),4.23 (dd,J=14.5,4.6 Hz,1H),2.53 (d,J=15.1 Hz,1H),2.07～1.78 (m,7H),1.75～1.62 (m,3H),1.56～1.41 (m,7H),1.30 (s,3H),1.24 (s,3H),1.18 (s,3H),1.09 (s,3H),0.93 (s,3H),0.86 (s,3H),0.81 (s,3H); 13C NMR (150 MHz,CDCl3) δ: 177.6,172.9,150.0,139.7,138.2,128.5,127.8,127.3,125.3,113.6,54.0,53.3,47.7,45.9,43.6,42.5,39.6,38.9,38.4,37.1,35.5,34.6,32.0,30.8,28.7,27.8,24.7,23.1,21.1,18.6,17.0,16.7,15.3; MS (70 eV) m/z (%): 763 (M+,37),750 (24),598 (21),584 (45),568 (100),558 (23),471 (16),407 (19). Anal. calcd for C38H53N3O: C 80.37,H 9.41,N 7.40; found C 80.41,H 9.34,N 7.41.

    N-{乌索烷并[2, 3]吡唑-12-烯-28-酰}-苯胺(UA4-1)的合成: 按照化合物UA4的合成方法,由化合物UA3-1和水合肼反应. 粗品用硅胶柱色谱纯化[洗脱剂: V(石油醚):V(乙酸乙酯)=10:1],得淡黄色固体,产率为58.3%. m.p. 18 3.5～184.7 ℃; 1H NMR (CDCl3,600 MHz) δ: 7.82 (s,1H),7.70 (s,1H),7.45 (d,J=8.8 Hz,2H),7.30 (d,J=6.5 Hz,3H),7.11 (s,1H),5.56 (s,1H),2.61 (d,J=16.6 Hz,1H),2.20～2.05 (m,6H),1.72～1.53 (m,4H),1.50～1.5 (m,6H),1.06 (s,3H),0.98 (s,3H),0.93 (s,3H),0.85 (s,3H),0.81 (d,J=6.4 Hz,3H),0.76 (s,3H),0. 73 (s,3H); 13C NMR (150 MHz,CDCl3) δ: 177.6,172.9,139.7,138.2,128.5,127.8,127.3,120.3,113.6,54.0,53.9,45.6,43.2,42.5,39.6,38.9,38.4,37.1,35.5,34.6,32.0,30.8,28.6,27.8,24.7,23.1,21.1,18.5,17.0,16.7,15.3; MS (70 eV) m/z (%): 1107 (M+,78),944 (37),819 (35),555 (35),554 (100),287 (25). Anal. calcd for C37H51N3O: C 80.24,H 9.28,N 7.59; found C 80.21,H 9.22,N 7.53.

    N-{乌索烷并[2, 3]吡唑-12-烯-28-酰}-3-氯-4-氟苯胺(UA4-5)的合成: 按照化合物UA4的合成方法,由化合物UA3-5和水合肼反应. 粗品用硅胶柱色谱纯化[洗脱剂: V(石油醚):V(乙酸乙酯)=10:1],得黄色固体,产率为47.7%. m.p. 197.5～198.1 ℃; 1H NMR (CDCl3,600 MHz) δ: 7.78 (s,1H),7.64 (d,J=9.1 Hz,2H),7.50 (s,1H),7.21 (s,1H),7.10 (s,1H),5.50 (s,1H),2.94 (d,J=15.1 Hz,1H),2.10～1.96 (m,6H),1.75 (dd,J=28.3,18.7 Hz,4H),1.46～1.38 (m,6H),1.36 (s,3H),1.33 (s,3H),1.29 (s,3H),1.10 (s,3H),0.94 (d,J=6.4 Hz,3H),0.87 (s,3H),0.73 (s,3H); 13C NMR (150 MHz,CDCl3) δ: 176.1,172.9,159.7,150.0,143.2,140.1,136.5,128.3,121.8,119.7,113.4,108.5,54.2,53.3,48.6,45.9,42.6,39.8,39.4,39.2,38.7,36.9,35.5,34.3,31.9,30.7,29.6,28.7,27.8,24.9,23.4,23.0,21.1,18.6,17.1,16.5,15.4; MS (70 eV) m/z (%): 721 (M+,50),658 (31),606 (100),553 (35),508 (25). Anal. calcd for C37H49ClFN3O: C 73.30,H 8.15,N 6.93; found C 73.24,H 8.09,N 7.01.

    N-{乌索烷并[2, 3]吡唑-12-烯-28-酰}-胺类(UA4)的合成[18]: 于茄形瓶中加入上一反应产物100 mg,乙醇20 mL,水合肼0.1 mL,83 ℃冷凝回流4 h,TLC监测反应终点[展开剂: V(石油醚):V(乙酸乙酯)=10:1],反应完毕减压蒸除反应溶剂无水乙醇,用乙酸乙酯和饱和食盐水萃取3次,合并有机相(黄色澄明液体),减压蒸除乙酸乙酯,得到N-{乌索烷并[2, 3]吡唑-12-烯-28-酰}-胺类粗品.

    N-{乌索烷并[2, 3]异噁唑-12-烯-28-酰}-苄胺(UA5-2)的合成: 按照化合物UA5的合成方法,由化合物UA3-2和盐酸羟胺反应. 粗品用硅胶柱色谱纯化[洗脱剂: V(石油醚):V(乙酸乙酯)=10:1],得淡黄色固体,产率为55.9%. m.p. 201.8～202.6 ℃; 1H NMR (CDCl3,600 MHz) δ: 7.85 (s,1H),7.46～7.28 (m,3H),7.25 (s,2H),6.24 (t,J=5.1 Hz,1H),5.34 (d,J=3.3 Hz,1H),4.62 (dd,J=14.5,5.8 Hz,1H),4.31 (dd,J=14.5,4.6 Hz,1H),2.57 (d,J=15.11 Hz,1H),2.10～1.93 (m,7H),1.90～1.72 (m,3H),1.60～1.41 (m,7H),1.35 (s,3H),1.29 (s,3H),1.21 (s,3H),1.15 (s,3H),1.07 (s,3H),0.94 (s,3H),0.82 (s,3H); 13C NMR (150 MHz,CDCl3) δ: 177.6,174.2,150.0,145.2,139.7,138.2,128.5,127.3,125.3,113.6,54.0,53.3,47.7,45.9,43.6,42.5,39.6,38.9,38.4,37.1,35.5,34.6,32.0,30.8,28.7,27.8,24.7,23.1,21.1,18.6,17.0,16.7,15.3; MS (70 eV) m/z (%): 896 (M+,33),758 (43),595 (32),569 (100),279 (42). Anal. calcd for C35H52N2O2: C 80.24,H 9.21,N 4.92; found C 80.16,H 9.17,N 4.89.

    N-{乌索烷并[2, 3]吡唑-12-烯-28-酰}-间甲氧基苯胺(UA4-3)的合成: 按照化合物UA4的合成方法,由化合物UA3-3和水合肼反应. 粗品用硅胶柱色谱纯化[洗脱剂: V(石油醚):V(乙酸乙酯)=10:1],得黄色固体,产率为46.9%. m.p. 189.6～190.4 ℃; 1H NMR (CDCl3,600 MHz) δ: 7.73 (s,1H),7.57 (s,1H),7.36 (d,J=8.9 Hz,2H),7.15 (s,1H),7.09 (s,1H),6.67 (s,1H),5.52 (s,1H),3.75 (s,3H),2.45 (d,J=15.1 Hz,1H),2.13～1.94 (m,6H),1.87～1.70 (m,4H),1.60～1.51 (m,4H),1.31 (s,3H),1.17 (s,3H),1.15 (s,3H),0.98 (s,3H),0.93 (d,J=6.4 Hz,3H),0.87 (s,3H),0.78 (s,3H); 13C NMR (150 MHz,CDCl3) δ: 175.8,172.9,162.2,150.1,140.3,136.2,131.1,129.5,125.3,115.7,113.6,108.6,55.3,54.2,53.3,48.3,45.9,42.6,39.8,39.5,39.0,38.4,37.0,35.5,34.6,31.9,30.8,28.7,27.8,24.9,23.2,23.0,21.1,18.6,17.1,16.6,15.4; MS (70 eV) m/z (%): 1059 (M+,31),721 (37),720 (49),633 (22),582 (49),583 (100). Anal. calcd for C38H53N3O2: C 78.17,H 9.15,N 7.20; found C 78.21,H 9.21,N 7.17.

    N-{乌索烷并[2, 3]吡唑-12-烯-28-酰}-对异丙基苯胺(UA4-4)的合成: 按照化合物UA4的合成方法,由化合物UA3-4和水合肼反应. 粗品用硅胶柱色谱纯化[洗脱剂: V(石油醚):V(乙酸乙酯)=10:1],得黄色固体,产率为44.8%. m.p. 193.1～194.5 ℃; 1H NMR (CDCl3,600 MHz) δ: 7.72 (s,1H),7.64 (s,1H),7.40 (d,J=8.6 Hz,2H),7.23 (d,J=4.5 Hz,2H),7.03 (s,1H),5.31 (s,1H),3.12 (s,1H),2.30～2.23 (m,1H),2.15～2.02 (m,3H),1.95～1.84 (m,3H),1.76～1.53 (m,4H),1.41～1.37 (m,4H),1.35～1.31 (m,6H),1.25 (s,3H),1.17 (s,3H),1.12 (s,3H),1.06 (s,3H),0.86 (d,J=4.6 Hz,3H),0.82 (s,3H),0.71 (s,3H); 13C NMR (150 MHz,CDCl3) δ: 176.1,172.9,150.0,144.2,140.1,138.4,136.5,126.8,125.7,113.5,54.2,53.3,48.6,45.9,42.6,39.8,39.4,39.2,38.7,36.9,35.5,34.6,31.9,31.7,30.7,29.6,28.7,27.8,24.9,24.4,24.1,23.4,23.1,21.1,18.6,17.1,16.5,15.4; MS (70 eV) m/z (%): 595 (M+,100),598 (45),594 (25),593 (20). Anal. calcd for C40H57N3O: C 80.62,H 9.64,N 7.05; found C 80.54,H9.61,N 6.99.

    N-{乌索烷并[2, 3]异噁唑-12-烯-28-酰}-3-氯-4-氟苯胺(UA5-5)的合成: 按照化合物UA5的合成方法,由化合物UA3-5和盐酸羟胺反应. 粗品用硅胶柱色谱纯化[洗脱剂: V(石油醚):V(乙酸乙酯)=10:1],得黄色固体,产率为53.6 %. m.p. 211.4～212.6 ℃; 1H NMR (CDCl3,600 MHz) δ: 7.88 (s,1H),7.68 (d,J=9.1 Hz,2H),7.50 (s,1H),7.22 (s,1H),5.62 (s,1H),3.11 (d,J=15.1 Hz,1H),2.62～2.07 (m,6H),1.86 (dd,J=28.3 Hz,18.7 Hz,4H),1.71～1.55 (m,6H),1.43 (s,3H),1.40 (s,3H),1.37 (s,3H),1.31 (s,3H),0.99 (d,J=6.4 Hz,3H),0.92 (s,3H),0.75 (s,3H); 13C NMR (150 MHz,CDCl3) δ:176.1,174.2,159.7,153.5,150.0,140.1,136.5,128.3,121.8,119.7,113.4,108.5,54.2,53.3,48.6,45.9,42.6,39.8,39.4,39.1,38.7,36.9,35.5,34.6,31.9,30.7,29.6,28.7,27.8,24.9,23.0,23.1,21.1,18.6,17.1,16.5,15.4; MS (70 eV) m/z (%): 908 (M+,27),906 (57),577 (40),607 (100),606 (61). Anal. calcd for C37H48ClFN2O2: C 73.18,H 7.97,N 4.61; found C 73.18,H 7.92,N 4. 58.

    N-{乌索烷并[2, 3]异噁唑-12-烯-28-酰}-间甲氧基苯胺(UA5-3)的合成: 按照化合物UA5的合成方法,由化合物UA3-3和盐酸羟胺反应. 粗品用硅胶柱色谱纯化[洗脱剂: V(石油醚):V(乙酸乙酯)=10:1],得黄色固体,产率为44.3%. m.p. 205.7～206.4 ℃; 1H NMR (CDCl3,600 MHz) δ: 7.84 (s,1H),7.60 (s,1H),7.42 (d,J=8.9 Hz,2H),7.16 (s,1H),6.71 (s,1H),5.62 (s,1H),3.78 (s,3H),2.53 (d,J=15.1 Hz,1H),2.17～1.98 (m,6H),1.90～1.72 (m,4H),1.67～1.55 (m,4H),1.32 (s,3H),1.20 (s,3H),1.17 (s,3H),0.98 (s,3H),0.92 (d,J=6.4 Hz,3H),0.88 (s,3H),0.78 (s,3H); 13C NMR (150 MHz,CDCl3) δ: 175.8,174.2,162.2,153.7,150.1,140.3,131.1,129.7,121.3,115.7,113.6,108.6,55.3,54.2,53.3,48.3,45.9,42.6,39.8,39.5,39.0,38.4,37.0,35.5,34.6,31.9,30.8,28.7,27.8,24.9,23.2,23.0,21.1,18.6,17.1,16.6,15.4; MS (70 eV) m/z (%): 627 (M+,20),613 (40),584 (45),553 (21),524 (15),492 (15). Anal. calcd for C38H52N3O3: C 78.04,H 8.96,N 4.79; found C 78.01,H 9.01,N 4.79.

    N-{乌索烷并[2, 3]异噁唑-12-烯-28-酰}-胺类(UA5)的合成[19]: 于茄形瓶中加入上一反应产物100 mg,乙醇20 mL,盐酸羟胺0.1 mL,83 ℃恒温冷凝回流4 h,TLC监测反应终点[展开剂: V(石油醚):V(乙酸乙酯)=3:1],反应完毕减压蒸除反应溶剂无水乙醇,用乙酸乙酯和饱和食盐水萃取3次,合并有机相(黄色澄明液体),减压蒸除乙酸乙酯,得到N-{乌索烷并[2, 3]异噁唑-12-烯-28-酰}-胺类粗品.

    N-{乌索烷并[2, 3]异噁唑-12-烯-28-酰}-苯胺(UA5-1)的合成: 按照化合物UA5的合成方法,由化合物UA3-1和盐酸羟胺反应. 粗品用硅胶柱色谱纯化[洗脱剂: V(石油醚):V(乙酸乙酯)=10:1],得淡黄色固体,产率为 57.4 %. m.p. 198.9～199.5 ℃; 1H NMR (CDCl3,600 MHz) δ: 7.86 (s,1H),7.75 (s,1H),7.48 (d,J=8.8 Hz,2H),7.30 (d,J=6.5 Hz,3H),5.62 (s,1H),2.70 (d,J=16.6 Hz,1H),2.25～2.10 (m,6H),1.86～1.76 (m,4H),1.63～1.50 (m,6H),1.48 (s,3H),1.32 (s,3H),1.27 (s,3H),1.14 (s,3H),0.97 (d,J=6.4 Hz,3H),0.89 (s,3H),0.82 (s,3H); 13C NMR (150 MHz,CDCl3) δ: 177.6,174.2,146.0,139.7,137.2,128.5,127.3,120.3,113.6,54.0,48.7,45.2,43.3,42.5,39.6,38.9,38.4,37.1,35.5,34.6,32.0,30.8,2 8.7,27.6,24.7,23.1,21.0,18.6,17.0,16.7,15.3; MS (70 eV) m/z (%): 588 (M+,21),556 (33),553 (50),554 (100),493 (32). Anal. calcd for C37H50N2O2: C 80.10,H 9.08,N 5.09; found C 80.03,H 9.05,N 5.09.

    3.2.3    初步体外细胞毒活性测试

    辅助材料(Supporting Information) 1H NMR、13C NMR和MS谱图. 这些材料可以免费从本刊网站(http://sioc-journal.cn/)上下载.

    以吉非替尼为阳性对照药,采用MTT法对合成的目标化合物进行体外抗肿瘤活性测试,所选用的肿瘤细胞为人口腔表皮样癌细胞(KB)、人胃癌细胞(SGC7901). 对数生长期肿瘤细胞培养于96孔培养板内,每孔100 μL(大约含4000个细胞),置37 ℃、5% CO2温箱中培养,培养24 h后,给药组加入含有浓度为10-5mol/L的测试物,至少设3个平行孔,阴性对照组加入与给药组等体积的溶剂,并设只加培养基的空白对照组,置37 ℃、5% CO2温箱中培养,48 h后弃培养液,每孔加入50 μL (1 mg/mL) MTT溶液,在37 ℃下孵育4 h,弃上清液,每孔加入150 μL DMSO溶解甲臜颗粒,轻度振荡溶解. 在酶标仪波长490 nm条件下测定各孔光密度(OD)值,计算所测化合物对细胞的抑制率和IC50. 试验重复3次,结果取平均值.

    1. [1]

      Wang, P.; Zhang, Z. Y.; Wu, Z. J. Chin. Med. Mater. 2000, 23, 717.

    2. [2]

      Kazakova, O. B.; Giniyatullina, G. V.; Yamansarov, E. Y.; Tolstikov, G. A. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2010, 20, 4088. doi: 10.1016/j.bmcl.2010.05.083

    3. [3]

      Cunha, W. R.; de Matos, G. X.; Souza, M. G.; Tozatti, M. G.; Andrade, E.; Silva, M. L.; Martins, C. H.; da Silva, R.; Da Silva Filho, A. A. Pharm. Biol.2010, 48, 166. doi: 10.3109/13880200903062648

    4. [4]

      Jin, Y. R.; Jin, J. L.; Li, C. H.; Piao, X. X.; Jin, N. G. Pharm. Biol. 2012, 50, 523. doi: 10.3109/13880209.2011.611143

    5. [5]

      Liu, W.; Tan, X.; Shu, L.; Sun, H.; Song, J.; Jin, P.; Yu, S.; Sun, M.; Jia, X. Molecules 2012, 17, 9104.

    6. [6]

      Wang, J.; Liu, L.; Qiu, H.; Zhang, X.; Guo, W.; Chen, W.; Tian, Y.; Fu, L.; Shi, D.; Cheng, J.; Huang, W.; Deng, W. PLoS One 2013, 8, 63872.

    7. [7]

      Leal, A. S.; Wang, R.; Salvador, J. A.; Jing, Y. Bioorg. Med. Chem. 2012, 20, 5774. doi: 10.1016/j.bmc.2012.08.010

    8. [8]

      Nobuchika, S.; Kouhei, T.; Nicole, H.; Kenji, D.; Reiko, T.; Shiro, M. J. Biol. Chem. 2009, 284, 5000. doi: 10.1074/jbc.M804073200

    9. [9]

      Meng, Y. Q.; Zhan, L. F. J. Asian Nat. Prod. Res. 2015, 11, 1.

    10. [10]

      Fu, H. J.; Zhou, Y. R.; Bao, B. H.; Jia, M. X.; Zhao, Y.; Zhang, L.; Li, J. X.; He, H. L.; Zhou, X. M. J. Med. Chem. 2014, 57, 4692. doi: 10.1021/jm5002293

    11. [11]

      Liu, D.; Meng, Y. Q.; Zhao, J. Chem. Res. Chin. Univ. 2008, 24, 42. doi: 10.1016/S1005-9040(08)60010-0

    12. [12]

      Shen, L. H.; Lai, Y. S.; Zhang, Y. H. J. Chin. Med. Univ. 2008, 39, 103 (in Chinese). (申利红, 赖宜生, 张奕华, 中国药科大学学报, 2008, 39, 103.)

    13. [13]

      Bi, Y.; Xu, J. Y.; Wu, X. M. Chin. J. New Drugs 2005, 14, 23 (in Chinese). (毕毅, 徐进宜, 吴晓明, 中国新药杂志, 2005, 14, 23.)

    14. [14]

      Li, D.; Zhou, J. P.; Wu, X. M. Pharm. Dev. 2004, 28, 120 (in Chinese). (李丹, 周金培, 吴晓明, 药学进展, 2004, 28, 120.)

    15. [15]

      Meng, Y. Q. Bioorg. Med. Chem. 2009, 17, 848. doi: 10.1016/j.bmc.2008.11.036

    16. [16]

      Chen, J.; Fu, H.; Wang, Z.; Yin, F.; Li, J.; Hua, Y. Cell. Phys. Biochem. 2014, 34, 724.

    17. [17]

      Fu, H. J.; Yang, Z.; Zhou, Y. R.; Bao, B. H.; Yun, D.; Li, J. X. Eur. J. Pharm. Sci. 2015, 76, 33. doi: 10.1016/j.ejps.2015.04.021

    18. [18]

      Chen, J.; Liu, J.; Zhang, L. Y.; Wu, G. Z.; Hua, W. Y.; Wu, X. M.; Sun, H. B. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006, 16, 2915. doi: 10.1016/j.bmcl.2006.03.009

    19. [19]

      Qiu, W. W.; Shen, Q.; Yang, F.; Wang, B.; Zou, H.; Li, J. Y.; Li, J.; Tang, J. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2009, 19, 6618. doi: 10.1016/j.bmcl.2009.10.017

  • 图式1  熊果酸衍生物的合成

    Scheme 1  Synthesis of derivatives of ursolic acid

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    图 1  不同化合物给药72 h后KB细胞形态变化及正常细胞对照图

    Figure 1  Morphological changes of KB cells induced by different compounds after 72 h

    (a) Normal KB cells; (b) UA;. (c) UA4-1; (d) UA4-2; (e) Gefitinib; (f) Adriamycin

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    图 2  不同化合物给药72 h后SGC7901细胞形态变化及正常细胞对照图

    Figure 2  Morphological changes of SGC7901 cells induced by different compounds affer 72 h

    (a) Normal KB cells; (b) UA; (c) UA4-1; (d) UA4-2; (e) Gefitinib; (f) adriamycin

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    图 3  UA4-2和UA5-2与人源性Tph-1结晶模型的分子对接模型

    Figure 3  Molecular docking model of UA4-2 and UA5-2 with human derived Tph-1 crystal model

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    表 1  目标化合物对KB细胞和SGC7901细胞的活性抑制

    Table 1.  Inhibitory activity of the target compounds on the KBand SGC7901cells.

    Compd. 抑制率a/% IC50/(μmol•L-1)
    KB SGC7901 KB SGC7901
    UA 11.63 9.31 ＞50 ＞50
    UA4-1 52.78 55.98 13.23 0.29
    UA4-2 60.21 66.72 6.88 0.04
    UA4-3 51.41 42.55 25.63 18.71
    UA4-4 39.82 43.27 28.52 16.58
    UA4-5 33.28 40.46 ＞50 ＞50
    UA5-1 29.71 32.67 29.60 ＞50
    UA5-2 37.88 40.98 7.69 ＞50
    UA5-3 32.17 27.33 30.17 20.23
    UA5-4 28.06 29.58 ＞50 12.35
    UA5-5 33.47 23.47 ＞50 ＞50
    吉非替尼 42.95 45.21 20.48 1. 03
    阿霉素 46.88 48.29 2.33 1. 91
    a化合物浓度为10 μg/mL,经过72 h处理后的细胞抑制率.
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  • 收稿日期:  2015-10-28
  • 修回日期:  2015-12-16
通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
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    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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