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  1    引言

  在本课题组之前的工作设计并合成了一种荧光探针体系^[42], 可清除活性氧物质; 但是需使用紫外光激发、发射波长在可见光区域; 紫外光会对生物组织造成伤害, 此外较短波长的激发光/发射光会导致其组织穿透性较弱、背景信号干扰强等缺点, 因此大大地限制了其在生物体系中的应用潜力.

  

  图1 细胞对DTPE-Tau的摄取及随后的酯酶催化荧光增强和活性氧清除机理图

  Figure 1. Schematic illustration of cellular uptake for DTPE-Tau and the subsequently esterase-activated fluorescence switching on and ROS scavenging

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  炎症是组织对有害刺激如受损细胞、病原体等^[31]的生理响应过程.炎症细胞中活性氧簇(ROS)含量通常会升高, 并过量表达水解酶^[32](酯酶、蛋白酶、磷酸酶等).过度表达的ROS如果得不到有效的清除就会导致氧化应激和慢性炎症.HClO/ClO⁻是最强的ROS之一^[33], 其活性极大且非常容易扩散, 在炎症细胞中往往不受控制地过量表达, 且易于导致许多疾病的产生^[34~38].

  作为一种高效抗氧化物, 牛磺酸(β-氨基乙磺酸)能有效地保护组织, 避免炎症疾病中的氧化应激.牛磺酸能直接消除组织中由髓过氧化物酶(MPO)-卤化物系统产生的毒性极大的氧化剂次卤酸(HOCl, HOBr)^[39].HOCl/HOBr与牛磺酸反应后会分别生成牛磺酸卤化物TauCl和TauBr.生成的这些较温和的氧化剂不仅对细胞的毒性较低, 而且保持有很高的抗菌性和抗炎症作用.另一方面, 虽然牛磺酸不能直接地清除其他的典型ROS, 但是它能促进许多抗氧化剂酶如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等的表达^[40], 从而起到抑制ROS的作用.此外有文献报道, 在分子中引入牛磺酸能极大地增强细胞对其的摄取能力^[41].

  为此, 在本文中我们设计了一种新型的近红外AIE荧光团DTPE, 其具有可见光激发、近红外发射、大斯托克斯位移(225 nm)等优点.克服了组织穿透性较弱、信噪比低、背景信号干扰强等缺点.随后利用牛磺酸与近红外AIE荧光团DTPE通过酯键相连, 获得了荧光探针体系DTPE-Tau.牛磺酸基团的存在增强了荧光团的水溶性同时又增强了细胞对其的摄取能力.其机理如图 1所示, DTPE-Tau中的酯键被炎症细胞中过度表达的酯酶水解, 从而释放出牛磺酸并有效清除ROS, 防止炎症进一步恶化.与此同时, 释放出牛磺酸后的荧光团由于疏水相互作用聚集而使荧光得到增强, 可作为酯酶激活释放牛磺酸的指示信号.

  荧光技术具有响应速度快、灵敏度高、实时成像和方法便捷等优点^[1~9], 已在分子识别和生物成像领域得到了成功的应用^[10~21].许多传统的荧光染料因聚集荧光淬灭(ACQ)^{[22, 23]}的问题而使其应用受限, 具备聚集诱导发光(AIE)特性的荧光化合物则可有效避免该问题.AIE荧光团^[24~26]具有在聚集状态下发光强而在溶解状态下不发光^{[27, 28]}的特点.近红外发射的荧光染料由于具有组织穿透性高、细胞低损伤、生物组织自荧光干扰小等优点, 近年来受到了越来越多的关注.然而大多数的AIE荧光染料的发射波长均低于650 nm.尽管最近已有大量的新型AIE分子染料被报道^{[29, 30]}, 然而同时具有近红外发射性能且能监控药物释放的荧光体系却并不多见.因此开发用于可视化治疗的近红外AIE荧光体系是非常有意义的并具有较好的应用前景.

  2    结果与讨论

  2.1    合成与光谱性质

  荧光体系(DTPE-Tau)的合成如图 2所示.荧光团(DTPE)的设计主要基于推拉电子理论.即在TPE的共轭体系两端分别引入吸电基和供电基, 供体-受体通过共轭体系的相互作用促进分子内电荷转移(ICT), 从而导致了分子吸收和发射的红移.通过测试荧光团DTPE随着良溶剂(DMSO)/不良溶剂(水)比例改变的荧光光谱图, 考察了其AIE性质.DTPE在水相中的最大发射峰位于680 nm处, 由于细胞内主要是水环境, 因此我们着重考量了体系在680 nm处的荧光特性(图 3A).

  斯托克斯位移小的荧光团由于其吸收与发射之间有较大的重叠从而可能会导致较大的测试误差.而具有大斯托克斯位移的荧光团能减少激发与发射之间的互相干扰, 从而增强目标荧光和背景荧光之间的对比度.许多AIE荧光团具有较小的斯托克斯位移, 相比之下DTPE-Tau荧光体系具有较大的斯托克斯位移达225 nm (图S3), 展示出非常好的生物成像应用潜力.

  

  图3 (A) DTPE在含水量不同的DMSO/H₂O混合体系中680 nm处的荧光强度(I₆₈₀)变化曲线. (B) DTPE-Tau在50 μg/mL酯酶作用下, 不同响应时间的荧光光谱. (C) DTPE-Tau在不同浓度酯酶(0, 1, 10, 30, 50 μg/mL)作用下, 在680 nm处的荧光强度随时间的变化. (D)不同浓度的DTPE在含1% DMSO磷酸盐缓冲液中(pH=7.4)的荧光强度.测试条件: 37 ℃, λ_ex/em=455/680 nm

  Figure 3. (A) Plot of FL intensity (I₆₈₀) of DTPE-Tau versus water fraction of the H₂O/DMSO mixture. (B) FL spectra of DTPE-Tau for esterase response versus time. (C) Fluorescent intensity of DTPE-Tau upon incubation with esterase at different concentrations (0, 1, 10, 30, 50 μg/mL). (DTPE-Tau 20 μmol/L in PBS containing 1% DMSO). (D) The working curve of the fluorescence intensity against the DTPE concentration in the range of 2~20 μmol/L. These measurements were performed in PBS (pH 7.4) containing 1% DMSO at 37 ℃ with λ_ex/em=455/680 nm

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  图2 荧光探针体系DTPE-Tau的合成路线

  Figure 2. Synthetic route for DTPE-Tau

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  荧光团的光稳定性是影响其应用的重要参数之一.如图S1所示, 在365 nm紫外灯的照射下, 即使照射时间长达2 h, DTPE的荧光强度变化幅度几乎可以忽略.这表明其具有很好的抗光漂白性能, 为其在成像造影方面的应用提供了有力支撑.在生物体系试验中, 荧光团化合物的pH稳定性十分重要.如图S2所示, DTPE在pH=5.0至pH=8.0缓冲液中的荧光强度保持稳定, 在37 ℃水浴锅加热2 h之后依然没有明显变化.结果表明, DTPE具有很好的pH稳定性.

  2.2    酯酶激活的牛磺酸释放

  为了表征牛磺酸在酯酶激活下的释放能力, 我们测试了在不同浓度酯酶培养下DTPE-Tau的荧光光谱图.荧光光谱通过在培养期间定期的测试获得(DTPE-Tau 20 μmol/L, pH=7.4, 37 ℃).根据文献报道^[43], 在细胞中使用酯酶控制前药释放时使用的浓度为50 μg/mL.基于此, 我们选取50 μg/mL作为体外模拟细胞内释放的酯酶浓度.如图 3B, 3C所示, 当未加入酯酶时, DTPE-Tau本身表现出很弱的荧光.当体系中加入50 μg/mL的酯酶后, 体系的荧光强度随反应时间迅速增强, 并在15 min达到了平衡.这是由于DTPE-Tau水溶性较好, 在水相缓冲液中无法聚集导致其本身的荧光微弱.当加入酯酶后, DTPE-Tau逐渐水解成水溶性差的DTPE, DTPE由于疏水相互作用聚集, 导致分子以内非辐射耗散激发态能量的路径受阻, 从而荧光强度增强.如图 3C所示, 酯酶的浓度越大, 体系的水解速度和程度越大.同时, 我们通过质谱手段证明了在酯酶的作用下体系产生了游离的牛磺酸(图S4).同时, 通过动态光散射(DLS)测量酯酶响应前后体系的粒径(图S5)可以发现, 体系的粒径从响应前的1 nm增长到了响应后的100 nm.这些结果表明, 经过酯酶响应后体系聚集程度变大了.

  随后, 为了测量牛磺酸的释放效率, 我们又测试了体系水解产物DTPE的浓度-荧光强度工作曲线.如图 3D所示, 荧光强度的增强随着浓度的增加呈线性关系, 可作为药物释放的工作曲线.线性方程为: F=11.1C(μmol/L)+36.87(R=0.998).释放率通过将酯酶响应平衡后体系的荧光强度带入方程可算出为75%.

  2.3    细胞荧光成像

  接下来我们考察了DTPE-Tau对ROS的清除能力.据文献报道, RAW264.7细胞在佛波酯(PMA)的刺激下会产生ROS^{[44, 45]}.简单来说, 即细胞激活NADPH氧化酶产生O^2-并转化成为H₂O₂, 然后被细胞分泌的髓过氧化物酶(MPO)转化为HClO.因此, 我们选用PMA刺激RAW264.7细胞作为模型^[46]来考察DTPE-Tau的ROS清除能力.细胞活性氧的水平采用商业化的ROS检测染料DCFH-DA进行表征^[47].DCFH-DA本身没有荧光, 但它能被ROS氧化生成二氯荧光素(DCF)并产生极强的绿色荧光.

  

  图5 RAW 264.7细胞(A, D, G)使用6 mg/mL佛波酯刺激30 min, 磷酸盐缓冲液洗3次, 再使用50 μmol/L DTPE-Tau培养4 h, 最后使用10 μmol/L DCFH-DA培养30 min; (B, E, H)使用6 mg/mL佛波酯刺激30 min, 磷酸盐缓冲液洗3次, 再使用50 μmol/L牛磺酸培养4 h, 最后使用10 μmol/L DCFH-DA培养30 min; (C, F, I)使用6 mg/mL佛波酯刺激30 min, 磷酸盐缓冲液洗3次, 再使用完全培养基培养4 h, 最后使用10 μmol/L DCFH-DA培养30 min的荧光显微镜成像图

  Figure 5. Fluorescence images of RAW 264.7 cells (A, D, G) stimulated with 6 mg/mL PMA for 30 min, washed with PBS 3 times and incubated with 50 μmol/L DTPE-Tau for 4 h followed by DCFH-DA 10 μmol/L for 30 min; (B, E, H) stimulated with 6 mg/mL PMA for 30 min, washed with PBS 3 times and incubated with 50 μmol/L taurine for 4 h followed by DCFH-DA 10 μmol/L for 30 min; (C, F, I) stimulated with 6 mg/mL PMA for 30 min, washed with PBS 3 times and incubated in culture medium for 4 h followed by DCFH-DA 10 μmol/L for 30 min

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  如图 5所示, PMA/DCFH-DA组(图 5C, 5I)的细胞在PMA刺激后仅使用完全培养基培养, 产生了极强的绿色荧光, 这表明PMA刺激后细胞的ROS水平显著升高.在PMA/DTPE-Tau/DCFH-DA组(图 5A, 5G)和PMA/Taurine/DCFH-DA组(图 5B, 5H)中, 将高ROS水平的RWA264.7细胞再分别与含有50 μmol·L^-1 DTPE-Tau和Taurine的培养基中培养4 h后, 二氯荧光素的绿色荧光强度急剧降低, 表明细胞中的ROS水平得到有效的降低.这是因为细胞中的ROS被牛磺酸清除.更重要的是, 与其他组相比, DTPE-Tau水解后生成的聚集体DTPE并释放出来的红色荧光(图 5D, 5E, 5F)能作为追踪牛磺酸释放的标识.另外, 如图S7所示, 在使用PMA刺激后, 不使用(A, D, G)或分别使用相同浓度的DTPE-Tau培养2 h (B, E, H)、4 h (C, F, I), 能观察到代表ROS浓度的绿色荧光信号逐渐降低和代表牛磺酸释放程度的红色荧光信号逐渐增强的过程.这从另一角度证明了该体系追踪药物释放的能力.

  为了证明牛磺酸的引入能增强细胞摄取能力, 我们分别对比了细胞对DTPE-Tau和DTPE的摄取水平.RAW264.7分别与相同浓度(50 μmol/L)的DTPE-Tau和DTPE在相同的条件下培养4 h.从荧光显微镜细胞成像可以看出, 使用DTPE培养的细胞(图 4A, 4C)荧光信号强度很微弱, 而使用DTPE-Tau培养的细胞(图 4B, 4D)具有很强的荧光发射, 荧光信号强度明显增强.由此可见, 牛磺酸基团增强了细胞对探针体系的摄取能力.

  为了验证细胞对DTPE-Tau增强的摄取能力以及其对牛磺酸释放的追踪和清除ROS的能力, 我们选用了RAW264.7细胞系(小鼠巨噬细胞, 一种炎症细胞)进行体外实验.如MTT (图S6)实验所示, 即使培养浓度达到50 μmol/L的时候细胞活性仍然超过了90%, 这表明DTPE-Tau具有极低的细胞毒性, 能很好地应用于细胞实验中.

  

  图4 RAW 264.7细胞分别使用50 μmol/L的DTPE (A, C)和DTPE-Tau (B, D)培养4 h的荧光显微镜成像图

  Figure 4. Fluorescence images of RAW 264.7 cells incubated with (A, C) DTPE and (B, D) DTPE-Tau for both 50 μmol/L for 4 h in the same condition

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  3    结论

  设计并合成了一种新型的近红外发射的AIE荧光团DTPE, 其具有很好的光稳定、pH稳定性和较大的斯托克斯位移; 更重要的是, 该荧光团具有近红外发射的优点, 极大地弥补了之前体系的紫外光激发和可见光发射的不足.通过酯键将牛磺酸偶联到DPTE上获得了DPTE-Tau, 增强了其水溶性和细胞摄取能力.在炎症细胞过度表达的酯酶的作用下, 它能释放出抗氧化剂牛磺酸, 从而清除细胞中过度表达的活性氧.同时, 释放出来的DPTE在细胞中由于水溶性的降低聚集并发光, 这可以作为牛磺酸释放的指示.随后, DPTE-Tau被成功用于细胞活性氧的清除和细胞荧光成像.本研究为可追踪治疗体系的设计与发展提供了思路.

  4    实验部分

  4.1    材料与试剂

  锌粉、4-羟基苯甲酮、四氯化钛(GR)、四氢呋喃(色谱级)、碳酸铯、N, N-二甲基甲酰胺(DMF, 色谱级)、吡啶(色谱级)、冰醋酸、丙二腈、3-羟基-3-甲基-2-丁酮、四(三苯基膦)钯、四丁基溴化铵、二甲基亚砜(DMSO, 色谱级)购自Aladdin并直接使用.4-溴二苯甲酮、4-甲酰基苯硼酸、对硝基苯基氯甲酸酯购自TCL.4-二甲氨基吡啶(DMAP)购自Alfa Aesar.二氯甲烷、正己烷、甲醇等溶剂为分析纯试剂.小鼠巨噬细胞(RAW264.7)购自南京KeyGen生物有限公司, 佛波酯(PMA)购自Abcam, DCFH-DA购自SigmaAldrich.所使用的水为三蒸水.RPMI1640和抗体(青霉素、氯霉素)购自于Gibco.胎牛血清(FBS)购自于Life Technologies.

  4.2    合成部分

  化合物3的合成:所有使用的玻璃仪器提前在烘箱中干燥12 h.在N₂气氛保护下, 将4-溴二苯甲酮(2.61 g, 10 mmol)和4-羟基苯甲酮(1.98 g, 10 mmol)溶解于无水四氢呋喃(THF)中, 加入250 mL双口圆底烧瓶中, 随后加入锌粉(3.8 g, 60 mmol).在冰浴、强搅拌的条件下逐滴滴加四氯化钛TiCl₄(6.74 mL, 67.5 mmol), 撤除冰浴将体系升温至回流过夜.将体系冷却至室温并减压蒸馏除去THF, 随后滴加饱和碳酸氢钠溶液至体系无气泡产生.体系用乙酸乙酯萃取, 所得有机相用无水硫酸钠干燥, 减压蒸馏除去溶剂后得到的粗产物经过硅胶色谱柱分离(洗脱剂:正己烷/二氯甲烷, V/V=1:3), 得到白色粉末化合物3(1.8 g, 42%).¹H NMR (600 MHz, DMSO)δ: 9.42~9.38(m, 1H), 7.29(d, J=8.5 Hz, 2H), 7.16(d, J=13.1 Hz, 2H), 7.13(s, 4H), 6.99~6.94(m, 4H), 6.90~6.85(m, 2H), 6.76~6.72(m, 2H), 6.55~6.49(m, 2H).MS (ESI)m/z: 426.5 [M]^-.

  化合物8的合成:在室温水浴的条件下, 乙醇钠(0.27 g, 4 mmol)溶于乙醇(5 mL), 随后加入3-羟基-3-甲基-2-丁酮(4 g, 40 mmol)、丙二腈(5 mL, 80 mmol).搅拌1 h后加入乙醇(12 mL), 加热至80 ℃回流1 h; 置于冰箱中冷却, 过滤, 干燥后得到白色结晶化合物8(5.2 g, 65.8%).

  化合物13(DTPE-Tau)的合成:中间体化合物11、牛磺酸(0.1 g, 0.8 mmol)、0.3 mL干燥的Et₃N立即加入新蒸的二氯甲烷中, 室温搅拌1天, 所得的混合物用饱和食盐水洗三遍, 所得有机相用无水硫酸钠干燥, 减压蒸馏除去溶剂后得到的粗产物经过硅胶色谱柱分离(洗脱剂:二氯甲烷/甲醇, V/V=10:1), 得到红色粉末化合物13(1.3 g, 92%).¹H NMR (600 MHz, MeOD)δ: 9.98~10.00(m, 1H), 7.95(dd, J=8.5, 2.2 Hz, 1H), 7.85(d, J=17.1 Hz, 1H), 7.79~7.71(m, 2H), 7.45(dd, J=10.8, 6 Hz, 2H), 7.38~7.25(m, 4H), 7.08~7.12(m, 6H), 7.05(d, J=9.6 Hz, 2H), 7.01(d, J=9.7 Hz, 2H), 6.96(s, 2H), 6.65~6.70(m, 2H), 5.34(t, J=4.6 Hz, 1H), 4.32(s, 2H), 4.07(s, 2H), 3.52(s, 2H), 2.97~3.00(m, 2H), 1.83(s, 6H); ¹³C NMR (126 MHz, DMSO)δ: 193.18, 177.62, 174.79, 156.19, 147.38, 143.85, 141.24, 139.59, 136.05, 132.50, 132.01, 131.26, 130.70, 130.66, 130.64, 130.41, 130.12, 130.03, 129.73, 129.48, 129.41, 129.36, 129.12, 128.90, 128.69, 128.49, 128.42, 128.39, 128.37, 128.25, 127.92, 127.67, 127.63, 127.50, 127.48, 127.04, 127.00, 126.97, 115.70, 115.07, 114.74, 114.36, 114.19, 66.49, 62.88, 51.11, 37.71, 35.59, 29.45.MS (ESI)m/z: 827.0 [M]^-.

  化合物经过核磁与质谱的表征(图S8-S18), 结构均为目标产物.

  化合物11的合成:将化合物9逐滴加入对硝基苯基氯甲酸酯(0.1 g, 0.5 mmol)和4-二甲氨基吡啶(0.06 g, 0.5 mmol)的二氯甲烷(10 mL)悬浮液中, 反应在室温下搅拌3 h, 过闪柱后所得的粗产物立即用于下一步反应.

  化合物5的合成:在100 mL的双口圆底烧瓶中加入化合物3(1.3 g, 3 mmol)、2-溴乙醇(0.42 mL, 6 mmol)、DMF (20 mL)和碳酸铯(1.76 g, 5.4 mmol), 随后将体系抽真空并充入氮气反复5次.反应加热至110 ℃过夜, 冷却至室温后使用二氯甲烷萃取, 所得有机相用无水硫酸钠干燥, 减压蒸馏除去溶剂后得到的粗产物经过硅胶色谱柱分离(洗脱剂:正己烷/二氯甲烷, V/V=1:3), 得到白色粉末化合物4(1.3 g, 92%).¹H NMR (600 MHz, DMSO)δ: 7.36~7.30(m, 2H), 7.21~7.08(m, 7H), 6.99~6.92(m, 4H), 6.90~6.84(m, 3H), 6.74~6.68(m, 2H), 4.82(q, J=17.2 Hz, 1H), 3.90(d, J=19.3 Hz, 2H), 3.69~3.64(m, 2H).

  化合物9(DTPE)的合成:将化合物7(0.30 g, 0.6 mmol)、化合物8(0.11 g, 0.6 mmol)和吡啶(4 mL)搅拌溶解于25 mL圆底烧瓶中, 加入冰醋酸(0.16 mL)后升温至40 ℃反应24 h, 将体系溶解于乙酸乙酯中并用0.1 mol/L盐酸洗三次、饱和食盐水洗一次, 所得有机相用无水硫酸钠干燥, 减压蒸馏除去溶剂后得到的粗产物经过硅胶色谱柱分离(洗脱剂:二氯甲烷/甲醇, V/V=100:1)得到红色粉末化合物9.¹H NMR (600 MHz, DMSO)δ: 7.96(d, J=14.6 Hz, 3H), 7.80(d, J=8.5 Hz, 2H), 7.58(d, J=8.4 Hz, 2H), 7.14~7.19(m, 6H), 7.07(s, 1H), 7.05(d, J=4.2 Hz, 2H), 7.03(d, J=8.6 Hz, 4H), 6.87(d, J=8.7 Hz, 2H), 6.70(d, J=8.8 Hz, 2H), 3.89(d, J=9.8 Hz, 2H), 3.66(d, J=9.7 Hz, 2H), 1.81(s, 6H).MS (ESI): m/z676.5 [M]^-.

  化合物7的合成:将化合物5(0.94 g, 2 mmol)溶解于甲苯(30 mL)于100 mL双口圆底烧瓶中, 加入2 mol/L碳酸钾水溶液(8 mL).随后加入四丁基溴化铵(TBAB, 0.1 g, 0.3 mmol)、4-甲酰基苯硼酸(0.36 g, 2.4 mmol), 室温搅拌30 min后, 加入四(三苯基膦)钯[Pd (PPh₃)₄, 0.010 g, 8.7 nmol], 立即将体系抽真空并充入氮气反复5次.反应加热至90 ℃保持24 h, 冷却至室温后使用乙酸乙酯萃取, 所得有机相用无水硫酸钠干燥, 减压蒸馏除去溶剂后得到的粗产物经过硅胶色谱柱分离(洗脱剂:二氯甲烷/丙酮, V/V=100:1), 得到白色粉末化合物7(0.61 g, 62% yield).¹H NMR (600 MHz, DMSO)δ: 10.02(s, 1H), 7.94(d, J=8.3 Hz, 2H), 7.86(d, J=8.3 Hz, 2H), 7.57(d, J=8.3 Hz, 2H), 7.18(d, J=10.9 Hz, 3H), 7.14(d, J=19.9 Hz, 3H), 7.07(d, J=8.3 Hz, 2H), 7.03(d, J=11.0 Hz, 4H), 6.87(d, J=8.7 Hz, 2H), 6.70(d, J=8.7 Hz, 2H), 4.82(d, J=11.0 Hz, 1H), 3.89(d, J=9.8 Hz, 2H), 3.66(d, J=15.3 Hz, 2H).MS (ESI)m/z: 518.9 [M]⁺.

  4.3    表征

  核磁谱图通过Bruker Avance 600 MHz测得.质谱通过Bruker Esquire HCT Plus质谱仪测得, UV-vis光谱通过Hitachi F-4600荧光光谱仪测得, 动态光散射(DLS)使用Malvern Nano-ZS90测得.

  4.4    光谱分析

  荧光光谱使用455 nm激发测得.将DTPE-Tau溶解至DMSO中配得母液, 将母液用磷酸盐缓冲液(10 mmol·L^-1, pH=7.4)稀释至相应浓度进行测试.酯酶响应的牛磺酸释放测试中, 相应剂量的酯酶加入到DTPE-Tau的含1% DMSO的磷酸盐缓冲液溶液中, 于37 ℃下保温, 荧光光谱通过期间定期测试获得.

  4.5    细胞MTT实验

  为了检测DTPE-Tau的毒性, 将RAW264.7细胞以1×10⁵ cells/mL的浓度接种至96孔板中, 在37 ℃含有5%的CO₂培养箱中培养24 h后, 移除培养基并使用PBS冲洗, 使用含有不同浓度DTPE-Tau的培养基再培养24 h.然后加入新配的MTT (浓度为0.5 mg/mL)培养3 h后将溶液小心移除.每孔加入100 μL DMSO震荡溶解后使用ISO 10993-5测得在570 nm处的强度, 从而算出细胞的活性.试验中每个浓度测试了8组, 细胞活性通过平均值和标准偏差表征.

  4.6    细胞培养及成像

  细胞摄取实验中, Raw 264.7细胞接种在培养皿中, 培养24 h使细胞贴壁.用PBS清洗后再使用含有50 μmol/L的完全培养基中在37 ℃及含有5%的二氧化碳的培养箱中培养4 h.细胞使用PBS清洗三次后进行荧光显微镜成像.

  做了三组实验进行对比.第一组细胞实验(PMA/DTPE-Tau/DCFH-DA), 细胞使用含有6 mg/mL佛波酯的完全培养基刺激30 min, PBS洗三次后使用含有50 μmol/L的DTPE-Tau的完全培养基培养4 h, 然后用10 μmol/L的DCFH-DA培养30 min.使用PBS清洗三次后进行荧光显微镜成像.第二组细胞实验(PMA/Tau-ring/DCFH-DA), 细胞使用含有6 mg/mL佛波酯的完全培养基刺激30 min, PBS洗三次后使用含有50 μmol·L^-1牛磺酸的完全培养基培养4 h, 然后用10 μmol/L的DCFH-DA培养30 min.使用PBS清洗三次后进行荧光显微镜成像.第三组细胞实验(PMA/DCFH-DA), 细胞使用含有6 mg/mL佛波酯的完全培养基刺激30 min, PBS洗三次后仅使用完全培养基培养4 h, 然后用10 μmol/L的DCFH-DA培养30 min.使用PBS清洗三次后进行荧光显微镜成像.

  在细胞清除活性氧实验中, 首先将Raw 264.7细胞接种在培养皿中, 培养24 h使细胞贴壁.

• 1. [1]

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  图 1  细胞对DTPE-Tau的摄取及随后的酯酶催化荧光增强和活性氧清除机理图

  Figure 1  Schematic illustration of cellular uptake for DTPE-Tau and the subsequently esterase-activated fluorescence switching on and ROS scavenging

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  图 2  荧光探针体系DTPE-Tau的合成路线

  Figure 2  Synthetic route for DTPE-Tau

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  图 3  (A) DTPE在含水量不同的DMSO/H₂O混合体系中680 nm处的荧光强度(I₆₈₀)变化曲线. (B) DTPE-Tau在50 μg/mL酯酶作用下, 不同响应时间的荧光光谱. (C) DTPE-Tau在不同浓度酯酶(0, 1, 10, 30, 50 μg/mL)作用下, 在680 nm处的荧光强度随时间的变化. (D)不同浓度的DTPE在含1% DMSO磷酸盐缓冲液中(pH=7.4)的荧光强度.测试条件: 37 ℃, λ_ex/em=455/680 nm

  Figure 3  (A) Plot of FL intensity (I₆₈₀) of DTPE-Tau versus water fraction of the H₂O/DMSO mixture. (B) FL spectra of DTPE-Tau for esterase response versus time. (C) Fluorescent intensity of DTPE-Tau upon incubation with esterase at different concentrations (0, 1, 10, 30, 50 μg/mL). (DTPE-Tau 20 μmol/L in PBS containing 1% DMSO). (D) The working curve of the fluorescence intensity against the DTPE concentration in the range of 2~20 μmol/L. These measurements were performed in PBS (pH 7.4) containing 1% DMSO at 37 ℃ with λ_ex/em=455/680 nm

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  图 4  RAW 264.7细胞分别使用50 μmol/L的DTPE (A, C)和DTPE-Tau (B, D)培养4 h的荧光显微镜成像图

  Figure 4  Fluorescence images of RAW 264.7 cells incubated with (A, C) DTPE and (B, D) DTPE-Tau for both 50 μmol/L for 4 h in the same condition

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  图 5  RAW 264.7细胞(A, D, G)使用6 mg/mL佛波酯刺激30 min, 磷酸盐缓冲液洗3次, 再使用50 μmol/L DTPE-Tau培养4 h, 最后使用10 μmol/L DCFH-DA培养30 min; (B, E, H)使用6 mg/mL佛波酯刺激30 min, 磷酸盐缓冲液洗3次, 再使用50 μmol/L牛磺酸培养4 h, 最后使用10 μmol/L DCFH-DA培养30 min; (C, F, I)使用6 mg/mL佛波酯刺激30 min, 磷酸盐缓冲液洗3次, 再使用完全培养基培养4 h, 最后使用10 μmol/L DCFH-DA培养30 min的荧光显微镜成像图

  Figure 5  Fluorescence images of RAW 264.7 cells (A, D, G) stimulated with 6 mg/mL PMA for 30 min, washed with PBS 3 times and incubated with 50 μmol/L DTPE-Tau for 4 h followed by DCFH-DA 10 μmol/L for 30 min; (B, E, H) stimulated with 6 mg/mL PMA for 30 min, washed with PBS 3 times and incubated with 50 μmol/L taurine for 4 h followed by DCFH-DA 10 μmol/L for 30 min; (C, F, I) stimulated with 6 mg/mL PMA for 30 min, washed with PBS 3 times and incubated in culture medium for 4 h followed by DCFH-DA 10 μmol/L for 30 min

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