English

• 1.   引言

  翻译后修饰是蛋白质生物合成中的关键步骤。形式多样的蛋白质翻译后修饰，不仅丰富了蛋白质的种类，更极大地拓展了蛋白质的生物功能。蛋白质磷酸化是指蛋白质分子中的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基在蛋白激酶的作用下从ATP分子上获取磷酸基团而发生磷酸化的过程。同时，蛋白质磷酸化又是一个可逆的过程。在蛋白磷酸酶的作用下，磷酸化蛋白上的磷酸化氨基酸残基又可发生去磷酸化的过程^[1]。尽管修饰形式和修饰基团较为简单，但蛋白质磷酸化却在生命活动中扮演着极为重要的角色。磷酸化和去磷酸化是实现蛋白质分子生物活性调控的主要方式，也是细胞内信号转导的重要机制，因而在细胞生长、分裂、分化、凋亡等众多细胞生命活动中，蛋白质磷酸化都发挥着重要的调控作用。同时，由于蛋白质磷酸化与细胞生命活动之间紧密的联系，蛋白质磷酸化的异常通常也与多种疾病的发生和发展密切相关^{[2, 3]}。

  建立有效的磷酸化蛋白质组学分析手段，对于深入理解蛋白质磷酸化及其参与生命活动的机理具有十分重要的价值。在自下而上的蛋白质组学研究中，质谱由于能够实现多组分同时快速分析具有强大的多肽序列结构鉴定能力，已成为应用最为广泛的研究工具。然而在磷酸化蛋白质组学研究中，对磷酸化肽进行直接的质谱分析仍面临着巨大的挑战。由于磷酸化肽的天然丰度低、离子化效率低以及样品基质中高丰度非磷酸化肽带来的干扰^[4~6]，利用质谱对磷酸化肽样品进行直接分析通常难以实现对磷酸化肽的有效检出和鉴定。因此，在进行质谱分析前，必须借助样品前处理手段来提高磷酸化肽的质谱检测灵敏度。目前应用于提高磷酸化肽质谱分析灵敏度的方法，一类是利用化学修饰将离子化效率低的磷酸基团转换为其他更易于发生离子化的功能基团，以提高修饰肽段在质谱分析过程中的离子化效率^{[7, 8]}。然而该方法在应用中存在着操作繁琐、无法应用于酪氨酸磷酸化以及修饰反应专一性有限导致磷酸化肽误检出等问题，因而此类方法的研究也较为有限。而另一类方法则是对复杂样品成分中的磷酸化肽进行特异性富集，提高质谱分析样品中的磷酸化肽浓度，并消除样品基质中非磷酸化肽、盐等各类影响磷酸化肽离子化效率的干扰成分。此类方法无需通过化学反应改变磷酸化肽的存在形式，而仅利用磷酸化肽上特征存在的磷酸基团作为富集作用的靶点，因而其质谱分析的结果更为简单直接；同时该方法还能够有效降低样品的复杂度，减少样品基质对磷酸化肽分析以及质谱仪器自身的影响。因此，基于预富集方式的磷酸化肽样品前处理方法，受到更多相关领域研究者的青睐。

  2.   基于不同类别亲和作用的磷酸化肽富集材料和富集方法

  随着材料科学的迅猛发展，基于对目标化合物具有选择性吸附能力的萃取材料的固相萃取和固相微萃取技术的发展方兴未艾。在磷酸化肽富集方法的相关研究中，固相萃取/固相微萃取也是最为普遍的应用形式，各类新型富集材料已成为磷酸化肽富集中的有力工具。随着质谱技术的快速发展，质谱已成为磷酸化蛋白质组学研究中必不可少的研究工具，并在解析细胞生命活动发生机制及其与蛋白质磷酸化之间的联系中发挥着越来越重要的作用。在这一背景下，设计制备具有高容量、高特异性、高灵敏度、成本低廉、应用方式简便的磷酸化肽富集材料，并发展相应的磷酸化肽富集方法，已成为磷酸化蛋白质组学分析方法开发中的关键问题。

  要实现对磷酸化肽的特异性富集，需要设计能够针对于磷酸化肽上特征存在的磷酸基团提供特异性亲和作用的富集材料。目前所发展的磷酸化肽富集材料，其吸附机理不尽相同，依据其吸附机理可大致分为如下几类(图 1)。

  图 1

  

  图 1.  磷酸化肽富集过程中的几种识别机理

  Figure 1.  Recognition mechanism of phosphopeptide enrichment

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  2.1   基于结构识别作用的磷酸化肽富集材料

  结构识别作用是指磷酸化氨基酸残基与富集材料表面的互补结构单元之间的识别作用。此类材料利用其材料基底上原位生长的特殊结构，或材料表面修饰识别单元，实现对磷酸化肽的特异性富集。

  基于抗原-抗体相互作用的免疫亲和富集方法是最早应用于磷酸化肽的富集方法，也是最为经典的基于识别作用的磷酸化肽富集方法。尽管酪氨酸磷酸化在所有蛋白质磷酸化中所占的比例很低，但由于酪氨酸磷酸化是重要的生物大分子识别位点，因而免疫亲和方法在酪氨酸磷酸化肽的富集中得到较为成熟的应用^{[9, 10]}。该方法通常是将具有磷酸化酪氨酸结合能力的4G10、PY99等抗体修饰于琼脂糖凝胶微球上，待其识别并吸附酪氨酸磷酸化肽后，将其与样品基质分离，再通过强酸或强碱破环抗原-抗体相互作用，从而释放材料所吸附的磷酸化肽。

  然而受限于使用成本的问题，免疫亲和方法在规模化的酪氨酸磷酸化肽富集分析中难以得到广泛的应用。而Bian等^[11]报道的利用SH2结构域替代抗体的方法则可以有效地解决上述问题。SH2结构域是多种信号转导蛋白上的一个保守的结构域，它可以识别磷酸化蛋白上的酪氨酸磷酸化位点，从而实现酪氨酸磷酸化信号向下游的传递^[12]。相比于抗体，制备SH2结构域更为简单经济，而借助于对SH2结构域序列的突变改造，SH2与磷酸化酪氨酸残基之间的亲和作用可以得到显著增强，使其能够满足高效富集酪氨酸磷酸化肽的需求。作者采用该方法，对9种人类细胞样品中的酪氨酸磷酸化肽进行了规模化的富集分析，并鉴定到共计＞20000条酪氨酸磷酸化肽和＞10000个酪氨酸磷酸化位点。

  除利用生物大分子与磷酸化肽之间的识别作用外，以磷酸化氨基酸残基为模板制备的印迹材料也可以利用识别作用实现对磷酸化肽的富集。文献[13, 14]报道了一种用于制备印迹聚合物的功能化单体，该单体分子可通过脲基与磷酸基团之间的多重氢键形成与磷酸化肽的非共价加合物。在模板分子存在的条件下将其聚合偶联，作者分别制备了能够识别并富集丝氨酸磷酸化肽和酪氨酸磷酸化肽的印迹材料。Li等^[15]则以丙烯酸锌为功能化单体，以苯膦酸为模板，利用锌离子与磷酸基团之间的亲和作用，制备得到能够识别磷酸化苯基结构的印迹材料，从而实现了对酪氨酸磷酸化肽的选择性富集。

  2.2   基于金属-磷酸基团相互作用的磷酸化肽富集材料

  磷酸基团与多种金属元素之间存在静电吸引、配位作用等多种亲和作用，因而包含这些金属元素的材料具有潜在的磷酸化肽富集能力。富集过程通常在酸性溶液条件下进行；而富集完成后，则利用氨水对金属元素配位的磷酸基团进行置换，从而实现对磷酸化肽的释放。由于金属-磷酸基团之间的相互作用形式更为简单，因而该富集方法并不会对不同氨基酸残基上的磷酸化位点有所区分。

  固定金属离子亲和色谱法是最早应用的基于金属-磷酸化肽亲和作用的磷酸化肽富集方法。该方法所使用的固定金属离子材料通常由材料基底、修饰配体和固定金属离子三部分构成。材料基底对富集过程中溶液条件有较好耐受性，对样品中的各类复杂成分均不会有明显吸附，并且其表面易于进行配体修饰。配体共价偶联修饰于材料基底上，其结构中通常含有较多的O、N等原子，用于配位金属离子。传统的固定金属离子亲和材料常使用亚氨基二乙酸^[16]、次氮基三乙酸等多齿配体^[17]，而近年来膦酸^[18]、胂酸^[19]、三磷酸腺苷^[20]、聚多巴胺^[21]、均苯三甲酸^[22]等配体也在其中得到了应用，并且在简化配体修饰过程、增加配体修饰密度、增强金属离子固定能力等方面取得了改进。金属离子多为对磷酸化肽有较好亲和能力的高价态、高配位数离子，其不饱和配位于配体基团上，利用其未被占据的配位位点结合磷酸基团，从而实现对磷酸化肽的吸附。Fe³⁺、Ga³⁺是最常用的固定金属离子^{[23, 24]}，而Ti⁴⁺、Zr⁴⁺等金属离子也先后被应用于固定金属离子亲和色谱，以改善材料对磷酸化肽的富集特异性^[25~28]。此外，不同金属离子对磷酸化肽的富集选择性有所差异，如Lai等^[29]报道Fe³⁺和Ti⁴⁺富集到的磷酸化肽中仅有约10%的重叠，而Tsai等^[30]报道Fe³⁺和Ga³⁺所富集到的磷酸化肽中仅有约8%的重叠，因而将固定不同金属离子的材料联合使用可以有效提高磷酸化肽的富集覆盖率。

  近年来，研究者开始尝试将金属有机骨架材料用于磷酸化肽富集。金属有机骨架材料是一类特殊的固定金属离子材料。在此类材料中，制备材料基底的有机骨架单元也是用于固定金属离子的配体，有机配体分子与金属离子交替配位形成周期性骨架结构，材料表面配位不饱和的金属离子提供了吸附磷酸化肽的活性位点。金属有机骨架材料在制备过程中会自发形成规整的多孔结构，从而有效增大其比表面积和吸附容量。同时，一些特定尺寸的孔道还可发挥尺寸排阻作用，从而实现内源性磷酸化肽与干扰蛋白质的分离。目前，已有基于Er、Fe、Zr、Zn等多种金属元素的金属有机骨架材料应用于磷酸化肽的富集^[31~35]。与金属有机骨架材料类似，Wang等^[36]在共价有机骨架材料中修饰了Ti⁴⁺并将其应用于磷酸化肽富集，骨架单元直接用于配位固定Ti⁴⁺，而无需额外修饰配体分子。

  金属氧化物亲和色谱则是另一类常用的利用金属-磷酸基相互作用富集磷酸化肽的方法。金属氧化物富集磷酸化肽的原理与固定金属离子材料较为相似，材料表面的配位不饱和金属元素作为路易斯酸与作为路易斯碱的磷酸基团结合, 实现对磷酸化肽的富集。Pinkse等^[37]和Sano等^[38]首先报道了利用TiO₂富集磷酸化肽，此后基于Ti、Zr、Fe、Al、Sn等多种不同金属元素的金属氧化物材料陆续被应用于磷酸化肽的富集^[39~44]。与固定金属离子材料类似，不同金属元素的氧化物在磷酸化肽富集中表现出不同的富集结果，例如ZrO₂、SnO₂、TiO₂等具有不同的单/多磷酸化肽富集倾向性^[45~47]，CeO₂在磷酸化肽解吸附过程中具有独特的去磷酸化催化活性等^[48]。因此，也有研究者尝试将NiFe₂O₄^[49]、ZnFe₂O₄^[49]、NiZnFe₂O₄^[49]、TiSnO₄^[50]、CaTiO₃^[51]、NiCoMnO₄^[52]等由2种或3种金属元素构成的组成均一的多元金属氧化物应用于磷酸化肽富集，并在富集特异性等方面取得了一些改进。相比于固定金属离子亲和色谱，金属元素以氧化物的形式存在于材料基底，可以有效避免富集操作中的金属离子流失问题。然而，由于部分金属氧化物的酸耐受性较为有限，因而在选择和设计用于磷酸化肽富集的金属氧化物时，也需要对其所能耐受的溶液酸度进行考察。与金属氧化物类似，部分金属元素形成的氟化物、磷酸盐等也在磷酸化肽富集中得到应用。

  2.3   基于静电相互作用/氢键的磷酸化肽富集材料

  在材料表面引入带正电荷的修饰基团，可使材料通过静电相互作用吸附解离后带负电荷的磷酸基团，从而实现对磷酸化肽的富集。根据修饰基团的不同结构，有些修饰基团与磷酸基之间还会形成氢键，并增强二者之间的相互作用。此类材料在富集完成后进行洗脱时，一种方法是利用阴离子交换机理，使用高浓度盐溶液交换材料所吸附的磷酸化肽^[53]。然而洗脱液中存在的盐会干扰后续分析，因而更为常用的洗脱方法是利用磷酸基的解离平衡，通过提高溶液酸度使磷酸基质子化，以破坏正电修饰基团对磷酸化肽的吸附作用。Dong等^[54]在毛细管中原位制备了季铵盐修饰的有机-无机杂化整体材料，可在与酶解兼容的弱碱性条件下对磷酸化肽进行富集，而在与质谱分析兼容的弱酸性条件下进行洗脱。Chang等^[55]制备了聚精氨酸修饰金刚石纳米颗粒，该材料具有对多磷酸化肽的选择性富集能力。本研究组曾制备胍基功能化石墨烯^[56]和酰肼基功能化硅胶微球^[57]等材料，并用于富集磷酸化肽。利用磷酸基解离程度随溶液酸度的变化，通过调节上样溶液和洗脱溶液组成，实现了对材料富集选择性的调控，并利用上述材料实现了对全部磷酸化肽的同时富集分析以及对单磷酸化肽和多磷酸化肽的分别富集分析。

  值得注意的是，利用静电作用富集磷酸化肽需考虑磷酸化肽上其它电荷的影响。在弱酸性富集条件下，通常使用的胰酶酶解得到的多肽肽链的两端会带有正电荷，并与材料表面产生排斥作用^[58]。此时，只有材料表面与磷酸基团之间的相互作用强于静电斥力时，才能够实现对磷酸化肽的吸附。

  2.4   基于化学修饰的磷酸化肽富集方法

  除利用材料对磷酸基本身的亲和作用外，也可以通过对磷酸化位点的化学修饰，将磷酸基团转化为能够被特定材料选择性吸附的其它官能团，从而实现对磷酸化肽的富集。Zhou等^[59]借助于可逆磷酰胺键将磷酸基团修饰为巯基，巯基可以与材料表面修饰的碘乙酰基团发生共价偶联反应，从而实现对磷酸化肽的富集。在富集完成后，再将磷酰胺键水解，以释放磷酸化肽。McLachlin等^[60]通过β消除-Michael加成反应，将磷酸基团转化为巯基，再通过形成二硫键的方式将其吸附于富集材料上。

  基于化学修饰的磷酸化肽富集方法操作较为繁琐，根据反应类型的不同，有时需对多肽上的其它基团进行预衍生保护，且对酪氨酸磷酸化的适用性较为有限。因而这类方法仍需对效果更好的衍生反应进行探索。

  3.   磷酸化肽富集方法的优化和改进

  在将上述亲和作用应用于磷酸化肽富集的基础上，研究者在富集材料设计、富集操作方式、富集特异性、富集材料的组合利用等方面进行了系列探索和改进，以期实现富集过程的简化和富集效果的提升。

  3.1   多样化的材料设计

  富集材料设计的改进包含材料的组成和结构两个方面。在材料组成方面，多组分复合富集材料是研究的热点方向。通过一定的方式将多种不同组成的材料组装在一起，每个组分都表现出各自的独特性质，从而为复合材料提供包括富集作用在内的多种功能。常用的复合磷酸化肽富集材料是磁性材料^[61]，包含能够响应外加磁场的γ-Fe₂O₃、Fe₃O₄等，其外表面可包覆用于富集的材料组分或修饰基团。当外加磁场存在时，材料发生聚集，在吸附/解吸附完成后，可较方便地实现材料与溶液的快速分离。SiO₂、碳纳米材料、聚合物材料等也是常用于制备复合磷酸化肽富集材料的组分^{[43, 64, 65]}。这些组分虽然本身不具有磷酸化肽富集能力，但可为富集材料提供结构支撑、表面修饰、内核保护等多种作用。

  在材料的结构方面，缩小材料的粒径有助于增大材料的比表面积，提高材料对磷酸化肽的吸附容量，但较小的粒径也会增加材料与溶液分离的难度。因而，有研究者通过烧结等方式，使磷酸化肽的纳米粒子形成纳米粒子团簇，在保留纳米粒子高比表面积的同时便于材料与溶液的分离^[64~66]。多孔结构的开发和应用则是更为常用的增大材料比表面积和吸附容量的方式。在孔径各异的多孔材料中，介孔材料的应用最为广泛。介孔材料是孔径介于2~50 nm之间的一类多孔材料，其孔道尺寸与多肽较为匹配，能够在保证孔道可以容纳磷酸化肽的同时提供更大的孔道表面积。介孔材料对分子量较大的蛋白质分子还具有尺寸排阻效应，因而部分孔表面固定金属离子或修饰有金属氧化物材料的介孔材料，成功地应用于生物样本中内源性磷酸化肽的选择性富集^[66]。

  3.2   简便、自动化的富集方式

  磷酸化肽样品量有限，常规的富集操作方法是将材料分散于样品溶液中，使其与样品溶液进行充分接触以吸附样品溶液中的磷酸化肽，之后再将材料与溶液相分离，实现针对磷酸化肽的选择性提取。然而作为一种基于固相萃取/固相微萃取的样品前处理方式，磷酸化肽的富集操作流程中包含平衡、上样、洗涤、洗脱等多个环节。这导致材料需要在溶液中进行反复的分散和聚集，使整个富集操作变得十分繁琐，并且还会因材料与溶液分离的不完全导致样品损失。

  解决上述问题的方法是将材料“固定”起来，以简化材料与溶液的分离操作，并避免操作过程中材料流失。将材料制成固相萃取柱是最为简单的实现方式，由于样品和材料的量较小，研究者常将材料填充于移液器吸头内，通过移液器的吹吸或离心实现溶液在填充柱床的流动^{[67, 68]}。对于粒状材料，需要利用筛板对柱床两端进行固定，同时需要控制材料的粒径，避免过大的反压和筛板的堵塞。利用基底和孔道双连续的整体材料可以避免上述问题，如Krenkova等^[69]将直径20 nm的氧化铁纳米粒子生长于整体材料的柱床上，既保证了纳米粒子对磷酸化肽的富集效果，又避免了纳米粒子直接填充带来的通透性差的问题；Liu等^[70]直接利用含有磷酸基的单体制备有机聚合整体材料，并在其表面固定Ti(Ⅳ)离子，用于富集磷酸化肽；本研究组原位制备了表面氨基功能化的整体材料，并用于对单磷酸化肽和多磷酸化肽的可控选择性富集。将富集材料填充柱串联于分析系统的前端则是一种集成度和自动化程度更高的方式。样品溶液中的磷酸化肽被富集材料所捕获，非磷酸化肽等干扰物质则随流动相直接流出。分离完成后，将流路的流动相切换为洗脱溶剂，洗脱下来的磷酸化肽随流动相流入后续的液相色谱分离系统或直接进行电喷雾质谱分析^[71]。而为了应对样品微量化和仪器小型化的需求，有研究者将富集材料填充于微流控装置中，实现了在芯片上的磷酸化肽在线富集分析(图 2)^{[72, 73]}。

  图 2

  

  图 2.  用于磷酸化肽在线富集的微流控装置^[72]

  Figure 2.  Microfluidic devices for on-line phosphopeptide enrichment^[72]

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  除了将材料制成填充柱的形式，靶上富集也是一种常用的快速富集分析方法。靶上富集通常是将磷酸化肽富集材料通过原位生长、修饰、烧结或沉积等方式^[74~77]固定于基质辅助激光解吸附/离子化(MALDI)质谱的样品靶板上，在靶上完成上样、洗涤、洗脱/混合基质和质谱分析的一系列操作过程。然而，靶上富集完成后富集材料与磷酸化肽仍共存于靶板上，进行质谱分析前需要考虑材料再吸附对磷酸化肽质谱分析的影响。

  3.3   富集特异性的改善

  多肽分子中酸性氨基酸及C端上的羧基与磷酸基的性质较为类似。在进行磷酸化肽富集时，由于富集材料对磷酸基和羧基的区分能力有限，常造成对包含多个羧基的非磷酸化肽的非特异性吸附。因此，研究者也在改善磷酸化肽富集特异性方面进行了探索。

  直接的富集特异性改善方法主要是针对富集材料本身的改进，通过不断设计和制备新型富集材料，寻找具有更好富集特异性的富集材料，如前面提到的基于Ti⁴⁺、Zr⁴⁺等高价金属离子的固定金属离子亲和材料^{[21, 78]}。而间接的富集特异性改善方法则包括选择性羧基衍生化和加入竞争结合试剂两类。选择性羧基衍生化是利用羧基与磷酸基团反应活性的差别，在保留磷酸化肽上磷酸基不变的前提下对羧基进行衍生化。目前，最常用的衍生方法是利用氯化亚砜或乙酰氯加入甲醇后生成的溶解有无水氯化氢的甲醇溶液将羧基甲酯化^{[79, 80]}。甲醇溶液中溶解的氯化氢可以催化反应的进行，同时该试剂不会引起磷酸基的变化。然而，该方法反应难以进行完全，对于多磷酸化肽进行衍生时常在质谱中形成不同程度衍生化的衍生物峰簇，导致质谱分析灵敏度下降，并使多肽的鉴定变得更为繁琐。同时，天冬酰胺和谷氨酰胺残基上的酰胺也会在该反应条件下转变为甲酯，导致在进行多肽鉴定时无法准确区分天冬氨酸/天冬酰胺以及谷氨酸/谷氨酰胺。此外，羧基的衍生会显著提高多肽的等电点，部分磷酸化肽带有净的正电荷，与材料表面产生静电排斥作用，进而降低材料对磷酸化肽的吸附效率。更为常用的方法则是加入小分子竞争结合试剂，材料对此类竞争结合试剂的吸附能力弱于磷酸化肽，而强于或与多肽分子上的羧基相当，因而此类竞争结合试剂以相对较高的浓度存在于样品溶液中时，可以在不影响材料对磷酸化肽富集的同时抑制对多肽分子上羧基的非特异性吸附，从而提高材料对磷酸化肽的富集特异性。目前，DHB、乳酸、乙醇酸、谷氨酸等多种小分子有机酸已在金属氧化物富集磷酸化肽中得到了应用^[81]，而甲膦酸钠则可以有效提高阴离子交换材料对磷酸化肽的吸附特异性^[58]。

  3.4   不同选择性富集材料的组合利用

  利用不同材料对磷酸化肽富集性质的差异，特别是对单磷酸化肽和多磷酸化肽富集选择性的差异，将多种材料分别应用于磷酸化肽富集，从而获得覆盖更为全面的磷酸化肽信息。如Shiau等^[82]先利用聚精氨酸修饰的纳米金刚石材料富集样品中的多磷酸化肽，而对于样品中残留的单磷酸化肽，再利用TiO₂修饰的纳米金刚石材料进行富集; 本研究组利用SnO₂的单磷酸化肽检测的倾向性以及ZnSn(OH)₆的多磷酸化肽的富集倾向性，合成了双金属纳米材料ZnSn(OH)₆, 和双金属双组份的SnO₂-ZnSn(OH)₆。并基于此，提出了基于ZnSn(OH)₆和SnO₂的两步顺序磷酸化肽富集策略以及基于SnO₂-ZnSn(OH)₆材料的单、多磷酸化肽一步富集策略^[47]。

  4.   展望

  对于磷酸化肽富集这一研究领域，新型富集材料的开发仍然是重要的研究方向。近十年来，各类应用于磷酸化肽富集的材料层出不穷，但也存在着不同材料之间同质性高、新开发的材料功能特点不明显、富集效果优势不突出等问题。因此，能够在特异性、覆盖率、灵敏度等方面相较之于现有材料取得明显改进的新型磷酸化肽富集材料，以及能够针对特定类别或与特定生命过程相关的磷酸化多肽具有选择性富集能力的磷酸化肽富集材料，仍具有广阔的发展潜力和应用前景。

  相比于磷酸化肽定性的分析，定量磷酸化肽蛋白组学在实际问题研究中具有更大的应用价值，定量蛋白质组学涉及多肽的同位素标记技术，化学标记方法可能对磷酸化肽富集过程产生影响。因此，能够适应定量磷酸蛋白组学的磷酸化肽富集方法将在磷酸化蛋白组学的应用中具有更大的优势。

  现有磷酸化肽富集的相关研究仍主要集中在方法开发上，而在磷酸化肽富集材料和富集方法逐渐丰富和完善的情况下，将所发展的富集材料和富集方法应用于解决其它技术不能解决的具体实际问题中，才是开发磷酸化肽富集方法的更重要的目的。

  
  
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  图 1  磷酸化肽富集过程中的几种识别机理

  Figure 1  Recognition mechanism of phosphopeptide enrichment

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  图 2  用于磷酸化肽在线富集的微流控装置^[72]

  Figure 2  Microfluidic devices for on-line phosphopeptide enrichment^[72]

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