English

• 1.   引言

  近一个世纪以来，显微成像技术的发展推动了对生命活动及其规律在微观层次上的研究，特别是在分子水平上对细胞及细胞内生物分子的结构和功能的探究。对于复杂的活细胞体系，其内部的生物分子具有高度的非均一性(如生物大分子构象的多元性、生化反应的非同步性，所处微环境的多样性)。而传统的生化分析方法是针对大量分子或分子聚集体系的测量，得到的平均性质常掩盖了单个生物分子的特性^[1]。在活细胞体系上检测单个生物分子的信号，实现其结构特征、动态行为及相互作用的定量表征，成为生命分析的前沿领域^{[2, 3]}。

  原子力显微镜(Atomic force microscopy, AFM)和荧光显微镜(Fluorescence microscopy, FM)是目前应用最为广泛的活细胞单分子分析检测的工具。AFM作为扫描探针显微镜家族的一员，是一种重要的表面分析技术，通过检测探针与样品间的微弱相互作用力，实现对样品表面形貌的成像，具有纳米级的空间分辨率；同时AFM单分子力谱尤为适合测定单对生物分子间的非共价键相互作用力，具有皮牛(pN)级的测力灵敏度^[4~6]。而荧光显微成像一直是探测细胞形态与行为最常用的方法，随着单分子荧光信号检测技术的突破，通过合适的荧光标记策略，结合荧光漂白步数分析，分子扩散运动分析以及荧光强度分布分析等方法^[7]，可表征单个生物分子在生理及病理过程中的动态行为，探究其生物功能的分子机制，具有高时间分辨和细胞内成像的优势^[8~11]。

  AFM及FM均可直接以活细胞为研究体系，在近生理条件下工作，对细胞功能干扰较小。它们的成像原理不同，但仪器装置兼容，检测优势互补，因而AFM-FM联用技术成为研究人员的关注热点，并得到了长足发展。本文结合本课题组的研究工作，简述了AFM单分子力谱和FM单分子荧光成像的原理，总结了AFM-FM联用技术的发展概况以及近十年来在活细胞单分子分析检测中的应用进展。

  2.   原子力显微镜及荧光显微镜的单分子检测原理

  2.1   AFM单分子力谱

  AFM诞生三十余年，经过不断改进，现已发展为不仅可精确表征样品的表面形貌，而且可量化测定其力学性质以及分子间相互作用力的多功能显微镜^[12~14]。AFM进行样品表面的形貌成像时，将对微弱力敏感的微悬臂一端固定，通过另一端的纳米级探针在样品表面进行逐点扫描，当探针接近样品并产生相互作用力时，微悬臂发生形变，使得照射在微悬臂背面激光束的反射光偏移，引起检测器电压信号的变化，反馈系统通过检测该信号调整探针和样品的距离，从而获得样品表面的相应形貌^[4]。对于较平整的表面，AFM成像的横向和纵向分辨率分别达到1.0和0.1 nm，可表征单个蛋白质、DNA等单个生物分子的精细结构^[5]。然而对于表面较软、具有一定粘性且组成复杂的活细胞，其空间分辨率则降低至10 nm，难以精确进行单分子形貌成像。因而在活细胞体系中，应用更多的是力测量模式。

  不同于形貌成像时的扫描模式，AFM以力测量模式工作时，探针相对样品做垂直运动。在AFM探针逼近样品表面及回退提拉的过程中，连续记录微悬臂的形变量以及相应的探针-样品间距离，从而获得两者间相互作用的力-距离曲线，计算出样品的杨氏模量等力学参数。将单个生物分子修饰在AFM探针上，可使探针具有分子识别功能，应用该探针以力测量模式对细胞膜进行逐点测量，即测得修饰探针的分子(如配体)与细胞膜上特定分子(如受体)间的单分子力谱，提取出两者形成单对分子复合物时的结合力和结合概率，实现生物分子间亲和力的量化表征，并获得细胞表面特定分子的分布等信息^[15~17]。采用修饰后的AFM探针, 以不同的加载速率进行力测量，记录单对生物分子间结合力随探针加载速率的变化，从而获得单分子动力学力谱，计算出复合物的解离速率常数及解离能垒等动力学参数^[18]。

  AFM形貌成像的空间分辨率高，但仅能用于样品表面的检测，且时间分辨率较低；单分子力谱测量的灵敏度高，但通量较小，且无法快速识别多种组分^[19]。

  2.2   单分子荧光成像

  荧光分析是分析化学中灵敏度极高的检测方法，然而应用于活细胞这一复杂体系时，细胞内的大量杂散光以及自发荧光等无关信号的干扰，使目标单分子荧光信号的探测尤为困难。因而要突破这一活细胞单分子检测的瓶颈，关键在于提高信噪比^[7]。目前发展的全内反射荧光显微镜(Total internal reflection fluorescence microscopy, TIRFM)及激光扫描共聚焦显微镜(Laser scanning confocal microscopy, LSCM)，均可通过减少激发及检测的体积，有效削弱背景荧光。

  TIRFM采用隐逝波激发样品。当激发光在折射率不同的介质界面处发生全反射时，会产生沿垂直界面方向光强呈指数衰减的隐逝波，从而将激发深度限制在100~200 nm范围内。由于细胞膜内外折射率不同，激发光在细胞膜区发生全反射时，产生的隐逝波仅激发细胞膜区的荧光分子，可极大削减细胞质产生的干扰荧光，实现单分子荧光成像，可研究在细胞膜区及近膜区的胞吞胞吐、分子识别及细胞骨架重构等过程^[20~22]。LSCM则引入了与焦平面共轭的照明针孔及探测针孔，使激发光束经照明针孔形成点光源，每次仅激发焦平面上的微小区域，发出的荧光则在探测针孔处被收集，从而将焦平面外的杂散光挡在其外。LSCM通过改变焦面，可获得细胞内不同深度的图像，可剖析细胞的三维空间结构，观测细胞内的生理过程^{[23, 24]}。

  荧光成像具有较高的时间分辨率(毫秒级的面成像和微秒级的点成像)，但其空间分辨率受限于衍射极限(x、y轴分辨200~300 nm, z轴分辨率500~800 nm)，无法分辨相隔距离在衍射极限以内的两个单分子^[25]。近年来超分辨荧光显微术兴起，两类超分辨荧光成像显微镜——受激辐射损耗显微镜(Stimulated emission depletion microscopy, STED)和光活化定位显微镜(Photoactivated localization microscopy, PALM)，获得2014年诺贝尔化学奖。STED实现超分辨成像的原理为：在激发光上叠加一束中空面包圈形状的高强度STED光，STED光照射区域的激发态分子通过非自发荧光辐射途径回到基态而不产生荧光，有效降低了激发半径，可分辨出直径仅为40 nm的神经突触囊泡^{[26, 27]}。而PALM以及和其原理类似的随机光学重构显微镜(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy, STORM)均是通过对具有光活化性质的荧光分子进行单分子定位，从而重构出超分辨图像的技术，在固定细胞中可获得小于25 nm的空间分辨率^[28~30]。

  3.   原子力显微镜-荧光显微镜联用系统的进展

  AFM和FM分别通过检测力学和光学信号实现活细胞单分子成像及分析，其检测方法和应用范围均有较好的相容及互补性。将两种显微镜联用，可充分发挥其各自特有的高空间分辨和高时间分辨等优势，实现细胞膜及细胞内生物分子的结构、动态行为和相互作用的多参数表征，因而研究人员不断开发并改进AFM-FM联用系统。

  3.1   AFM-TIRFM联用系统

  1989年，为适应对活细胞的荧光成像，TIRFM由正置棱镜式发展为倒置物镜式，使其与AFM的联用在仪器组装上成为可能^[36]。2000年，Mathur等将AFM扫描头装配在TIRFM样品台上(图 1A)，同步获得了基底细胞膜处黏着斑的TIRFM图像以及顶端细胞膜的AFM形貌图像^[37]。

  图 1

  

  图 1.  AFM-FM联用系统结构及成像图^[31~35] (A) AFM-TIRFM联用系统；(B) AFM-LSCM联用系统；(C) AFM-STED联用系统；(D)罗丹明标记的肌动蛋白微丝TIRFM图像，插图为白色方框区域的AFM形貌图；(E) Clathrin-EGFP包被小窝的LSCM及AFM成像叠加图(校准后)；(F)聚苯乙烯纳米颗粒的STED荧光图像(左上)、AFM形貌(右上)、力分布(左下)及黏附力(右下)图像

  Figure 1.  Schematic and imaging of the integrated AFM-FM system^[31~35]. (A) The integrated AFM-TIRFM; (B) The integrated AFM-LSCM; (C) The integrated AFM-STED; (D) TIRFM image of rhodamine-labeled actin filaments. Inset is AFM image of the area shown by the white rectangle in the TIRFM image; (E) Overlay of re-aligned height and fluorescence of EGFP-Clathrin coated pits (Clc-EGFP); (F) The integrated STED/AFM imaging of 40 nm nanobeads. STED image(upper left), AFM morphological image(upper right), AFM force volume imaging(lower left), AFM force adhesion mapping(lower right).

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  在传统的AFM-TIRFM联用系统中，由于TIRFM物镜和AFM扫描头被固定到分立的底座上，TIRFM物镜的平移、调焦等过程会引起样品与AFM扫描头间的相对振动，影响AFM的测量精度。2009年，Gumpp等^[38]为提高联用系统的机械稳定性，将TIRFM物镜直接整合在连接有AFM扫描头的底座上，最大限度实现两者的机械耦合，另一方面改变TIRFM物镜的调焦模式，通过检测TIRFM激发光的反射光的位置变化，获得物镜的纵向位移。并将装配EMCCD前的成像透镜搭载在一个高精度一维位移台上，通过其线性平移来调整成像透镜聚焦的样品平面。该位移台与搭载了AFM扫描头及TIRFM物镜的底座无机械耦合，减小了TIRFM成像时物镜轴向移动对AFM检测的干扰。AFM-TIRFM联用系统的另一技术困难为AFM的时间分辨率显著低于宽场成像模式的TIRFM。21世纪以来，高速AFM逐步兴起，也促进了高速AFM-FM联用系统的发展。2010年，Shibata等应用高速AFM成功观测到视紫红质分子的动态变化^[39]。仅3年后，Colom等便将FM的光路与高速AFM的激光系统整合在一起，实现了以960毫秒/帧的速率，原位记录人眼晶状体细胞上单个膜蛋白的动态行为^[40]，但其高速移动样品台的扫描模式会影响FM的成像。同年，Fukuda等即报道了通过高速移动AFM探针进行扫描的高速AFM-TIRFM联用系统(图 1D)，该装置基于一种激光跟踪技术，即在AFM激光器前放置一个二向色镜，通过控制其倾斜角度来精确移动激光束的位置，从而实现对悬臂运动及形变的同步追踪，应用这一联用系统可以实现3帻/秒的成像速率，观测到单个几丁质酶A分子在几丁质纤维上的运动^[34]。

  3.2   AFM-LSCM联用系统

  LSCM可观测细胞内生物分子的动态变化，因而AFM与LSCM联用技术受到了研究人员的重视。1995年，Hillner等^[41]设计出AFM-LSCM联用系统，随后这一技术进入蓬勃发展的阶段(图 1B)。早期，限制AFM-LSCM联用显微镜应用的主要技术困难是：AFM的检测激光会给LSCM的荧光成像带来高背景，降低其成像质量^[42]；将AFM的探针与LSCM的激发焦斑耦合实现同步点扫描时，由于AFM的空间分辨率显著高于LSCM，即LSCM成像的单个像素点中包含多个AFM扫描单元，因而LSCM会对同个像素点过度照明，造成严重的光漂白现象^[43]。2002年，Ebenstein等^[44]采用近红外激光追踪AFM悬臂的形变以避免对样品的荧光激发。Kassies等^[43]进一步在AFM激光器前放置一窄带通滤光片，仅1050 nm发射光可以通过，并结合LSCM探测通路中相应波长的滤波器，削弱了荧光成像背景。同时他们选用晶体硅制备AFM探针以降低其在LSCM激发焦斑处产生的干扰荧光，并发展出LSCM间断式照明的方式降低了光漂白，建立了保证AFM高分辨率及LSCM单分子荧光精度的同步成像系统。

  进一步的研究发现，AFM针尖热漂移引发的图像错误重叠，仍是联用系统进行高精度检测的主要限制因素^[45]。2014年，Timmel等^[35]将AFM探针修饰上荧光分子，在LSCM扫描样品的同时，对AFM探针上的荧光分子定位以记录AFM探针的横向热漂移，从而正形貌与荧光图像的错误重叠，实现了在成纤维细胞上对Clathrin包被小窝(Clathrin-Coated Pits，Clc)的同步成像(图 1E)。

  3.3   AFM-超分辨荧光显微镜联用系统

  由于传统光学显微镜的空间分辨率远小于AFM，两者的联用系统难以真正在单分子水平上，实现生物分子的定位及动力学行为的同时表征。超分辨荧光显微镜能够突破传统光学显微镜的衍射极限，从而达到与AFM相近的分辨率。2012年，Harke等^[46]采用两个脉冲激光器分别提供激发及损耗光的AFM-STED联用系统，测量得到Cos7细胞膜上微管的杨氏模量、表面形貌及STED图像，但仅是令AFM与STED分别成像后再进行图像叠加。2013年，本课题组首次搭建了在每个扫描点同步采集光学及力学信号的AFM-STED联用系统(图 1C)，其中激发光及STED光均由一台基于三态弛豫(T_Rex)概念的超连续脉冲激光器提供，获得了CaSki细胞丝状伪足上肌动蛋白微丝的AFM及STED同步采集图像(图 1F)^[33]。2014年，Chacko等^[47]基于一种手动校准重叠图像的技术，建立了可进行细胞操纵的AFM-STED联用系统，在STED成像的引导下，观测了固定的成纤维细胞中单个微管在AFM探针的作用力下拉伸及断裂的过程。

  与AFM-STED联用显微镜需要复杂的光学系统不同，AFM-PALM/STORM联用显微镜仅需对AFM-TIRFM联用显微镜进行简单的改造后即可实现^{[48, 49]}。2015年，Odermatt等^[50]首次建立了用于活细胞成像的AFM/PALM联用系统。两种显微镜分步进行成像，不仅保持了各自独立工作时的分辨率，并且检测的信息可互相补充：在超分辨荧光成像中发现多条肌动蛋白微丝上的荧光信号强度并不均一，而在AFM成像下证实，不仅是荧光标记效率不同，部分区域微丝成束也是导致上述现象的原因。

  4.   原子力显微镜-荧光显微镜联用技术在活细胞单分子检测中的应用

  AFM-FM联用技术用于活细胞单分子检测具有独特的优越性：通过荧光成像的引导，AFM可对特定区域的生物分子进行分析检测，提高了AFM的工作效率；AFM及TIRFM皆为表面成像技术，其联用可对细胞膜形貌，膜区生物分子的结构、分布及动态行为等进行多功能表征^[51]；利用AFM探针对细胞表面进行机械刺激或分子操纵，并通过FM的同步成像，可监测细胞膜及细胞内的分子响应行为。AFM-FM联用技术的发展，为细胞信号传导、药物作用机制、纳米生物效应等重要问题的研究提供了新的工具。

  4.1   配受体的相互作用和受体的分布

  细胞的基本生命活动依赖于众多信号通路的有序调节，膜上受体与配体的相互作用是启动信号转导的关键步骤，其功能的紊乱会诱发众多疾病。本研究组在建立了体外研究DNA-蛋白质，蛋白质-蛋白质等相互作用的AFM单分子力谱技术的基础上^[52]，较早地应用了AFM-FM联用技术在活细胞体系中检测配受体间的相互作用，例如首次测定了转化生长因子TGF-βⅠ与其受体(TβRⅠ及TβRⅡ)间的相互作用力^[53]。TGF-β调控的信号转导参与调节细胞增殖、分化、迁移和凋亡等重要生理过程。令HEK293细胞表达融合了不同荧光蛋白的两种受体，利用荧光成像引导修饰TGF-βⅠ的AFM探针对表达一种或两种受体的细胞进行力测量(图 2A~2C)。其单分子力谱结果表明，TβRⅡ与TβRⅠ共表达时，TGF-βⅠ与TβRⅡ的结合力增强。TGF-βⅠ/TβRⅡ和TGF-βⅠ/TβRⅠ/TβRⅡ两种复合物的单分子动力学力谱显示，TGF-βⅠ/TβRⅠ/TβRⅡ复合物的解离需跨越两个活化能垒，而TGF-βⅠ/TβRⅡ复合物的解离只需跨越一个活化能垒，且解离速率常数是前者的3倍(图 2D)，证实了TGF-βⅠ与TβRⅡ间的结合在招募TβRⅠ后会更加稳定。

  图 2

  

  图 2.  AFM-FM联用技术在配受体相互作用研究中的应用^{[53, 54]} (A)修饰TGF-βⅠ的AFM探针与细胞膜上特定受体间单分子力谱测量示意图；(B, C)共表达TGF-βⅠ型受体(TβRⅡ-GFP，左)及TGF-β Ⅱ型受体(TβRⅡ-RFP，右)的细胞荧光成像图；(D) TGF-βⅠ/TβRⅡ(a)及TGF-βⅠ/TβRⅠ/TβRⅡ(b)的单分子动力学力谱；(E, G) Mn²⁺活化后的Mac-1、多种Mac-1突变体与ICAM-1间相互作用的单分子动力学力谱比较

  Figure 2.  The applications of AFM-FM inligand-receptor interactions study^{[53, 54]}. (A) Schematic diagram of single-molecule force measurement in living cells with a TGF-βⅠ-modified AFM tip. The tip was positioned directly above a cell expressing the desired TGF-β receptors; (B, C) Fluorescence images recorded in GFP channel (B) and RFP channel (C) for the cells co-transfected with TβRⅠ-GFP and TβRⅡ-RFP; (D) Dynamic Force Spectra of TGF-βⅠ/TβRⅡ (a) and TGF-βⅠ/TβRⅠ/TβRⅡ (b). (E, G) Comparison of dynamic force spectra measured with Mn²⁺ activated wild-type Mac-1 and different Mac-1 mutants for ICAM-1 binding

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  基于同样的系统及策略，本研究组表征了影响整合素分子Mac-1与其配体ICAM-1亲和性的关键结构域，以及Mac-1结合配体时的构象变化^[54]。Mac-1作为调控白细胞黏附的重要受体，其构象可在静息态以及与ICAM-1亲和活性更强的活化态间转变，从而行使多种生理功能。通过比较CHO细胞膜上具有不同构象的多种Mac-1突变体与ICAM-1间相互作用的单分子动力学力谱(图 2E~2G)，证实了Mac-1由静息态向活化态的转变是通过α_MⅠ区域C端的α7螺旋结构向下移动实现的。

  结合AFM单分子力谱的识别成像以及FM荧光成像，也为细胞膜上受体分布的研究提供了新方法。采用AFM-FM联用技术，Lee等^[17]发现血管内皮生长因子受体在细胞膜上的不均匀分布与细胞骨架结构有关，并观测到邻近细胞骨架微丝的受体, 其扩散速率显著减慢；Andre等^[55]揭示了壁磷壁酸(Wall teichoic acids)在乳酸菌细胞膜上的极化分布与细胞的表面粗糙度、形状、伸展以及分裂密切相关。

  4.2   药物作用机制

  研究药物对生物分子相互作用的影响，是深入了解其作用机制，开发靶向药物的基础。本课题组首次将单分子荧光和单分子力谱联用技术应用到信号转导通路的小分子拮抗剂的抑制机理研究中^{[56, 57]}。TGF-β信号通路的异常激活与癌症、心血管及纤维化等多种疾病密切相关。研究发现，柚皮素作为一种小分子天然产物，会抑制该信号通路的转导，然而机制尚不分明。如图 3A所示，首先通过TIRFM单分子荧光成像揭示TGF-βⅠ诱导形成的TβRⅡ二聚体作为该通路信号传递的关键复合物，其比例在柚皮素作用后显著下降(图 3B, 3C)，而目前该信号通路已有的小分子抑制剂均不会有此作用，证实柚皮素是通过抑制TβRⅡ单体在TGF-βⅠ刺激后的二聚化，从而阻断了下游信号的传递^{[58, 59]}。AFM单分子力谱结果表明(图 3D)，柚皮素并没有减弱TGF-βⅠ与TβRⅡ的结合力(图 3F)，而是降低了其结合概率(图 3E)。据此并结合分子对接及动力学模拟实验，提出了TGF-β信号通路小分子抑制剂的全新作用机制。

  图 3

  

  图 3.  AFM-FM联用技术在药物作用机制研究中的应用^[56] (A)典型的TβRⅡ-GFP单分子荧光成像图；(B)不同化合物作用前后TβRⅡ单体和二聚体的比例；(C)典型的TβRⅡ-GFP荧光漂白曲线，左图为单体一步漂白, 右图为二聚体两步漂白；(D)修饰TGF-βⅠ的AFM针尖在表达TβRⅡ的细胞上测得的单分子力谱；(E)不同浓度柚皮素刺激下，TGF-βⅠ及TβRⅡ的结合概率；(F)柚皮素加入前(左)后(右)，TGF-βⅠ及TβRⅡ的结合力

  Figure 3.  The applications of AFM-FM in the drug studies^[56]. (A) A typical single-molecule image of TβRⅡ-GFP; (B) Monomer and dimer population under various conditions; (C) Schematics of one and two-step bleaching for monomeric and dimeric receptors, respectively; (D) Representative force curves obtained with TGF-βⅠ-modified AFM tips on the cell expressing TβRⅡ-GFP; (E) The binding probability of TGF-βⅠ and TβRⅡ when the cells are treated with different concentrations of Naringenin; (F) Histograms of binding forces of TGF-βⅠ and TβRⅡ with untreated cells (left) and the cells treated with 50 m mol/L Naringenin (right).

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  基于同样的方法，本研究组发现临床广泛应用的降糖类药物二甲双胍可直接与TβRⅡ竞争地结合TGF-βⅠ，从而降低TGF-βⅠ/TβRⅡ间的结合概率，抑制受体的二聚化激活，起到TGF-β通路的抑制作用^[60]，该机理的阐明为二甲双胍的老药新用提供了依据^{[61, 62]}。同时还研究了抗体类药物^{[63, 64]}、植物提取物^{[65, 66]}等分子对多种信号通路配受体结合的影响。例如发现表皮生长因子受体HER3与配体HRG的结合在HER2共表达时更加稳定，而抗肿瘤药赫赛汀(Herceptin)会抑制HER2这一增强HRG-HER3结合的作用^[64]。

  基于AFM-FM联用技术，Valle-Delgado等^[67]测定了肝素分子与恶性疟原虫感染的血细胞间特异性的单分子相互作用力，Zhang等^[68]揭示了抗癌药物白藜芦醇对人乳腺癌细胞膜上表皮生长因子受体的表达水平的抑制作用。

  4.3   机械刺激响应机制

  在复杂的生命系统中，除化学及生物信号外，细胞还受到机械力等环境因素的影响，解析细胞在不同刺激下的分子响应行为，有助于深入理解细胞的生理过程。Alsteens等^[69]基于AFM-LSCM联用技术观测到机械力引发的细胞表面黏附区域的形成及传播过程，首先发现修饰V5抗体后的AFM探针，在表达了带有V5-tag的黏附素(ALS5P)的酵母菌细胞上，可检测到两种单分子相互作用力。较弱的力对应V5抗体与V5-tag间的解离，较强的力对应ALS5P分子的解折叠。采用AFM探针以单分子力谱模式对细胞进行反复扫描，观测到ALS5P聚集区域形成以及缓慢传播至整个细胞表面的过程(图 4A)。LSCM成像结果表明，表达ALS5P突变体的细胞经力刺激后几乎不形成聚集颗粒(图 4B，4C)，从而认为黏附区域的形成是由于机械力改变了ALS5P的构象从而促使其发生自组装。

  图 4

  

  图 4.  AFM-FM联用技术在细胞刺激响应机制研究中的应用^{[69, 71]}. (A) Als5p黏附区域的AFM形貌图及单分子黏附力谱图；(B, C)表达Als5p(B)及Als5p突变体(C)的细胞，其聚集情况的荧光成像图；(D). Fluo-4标记的钙信号沿细胞间膜纳米管的传播

  Figure 4.  The applications of AFM-FM in the study of cell response after mechanical stimulation ^{[69, 71]}. (A) AFM topographic images and single molecular adhesion force maps of Als5p nanodomains; Fluorescence imaging of the aggregation of cells expressing Als5p (B) or Als5p mutant (C); (D) Calcium flux propagation between two membrane nanotube connected cells

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  本研究组利用AFM-LSCM联用系统研究了Ca²⁺在新生小鼠的心肌细胞(CMs)及心肌成纤维细胞(FBs)之间，通过新发现的膜纳米管的传播过程^{[70, 71]}。使用AFM针尖对心肌细胞进行局部的机械刺激，引发Ca²⁺释放。同步的LSCM成像结果表明，钙信号会通过膜纳米管由受激的CMs/FBs细胞迅速传至相距几个微米的另一CMs/FBs细胞，而相邻的无膜纳米管连接的细胞则不受影响(图 4D)。由此发现了心肌细胞间通过膜纳米管进行信号传输的新通讯方式，有望改变教科书上关于心肌细胞间电信号传递的定义^[72]。

  4.4   纳米粒子与细胞的相互作用

  随着碳纳米管、富勒烯等纳米材料在生物医学等领域中的广泛应用，其生物效应引起人们的日益关注。本研究组利用AFM-LSCM联用技术，研究了羧基富勒烯对植物细胞壁组成的影响^[73]。采用AFM以单分子力谱模式对烟草细胞进行扫描，发现其壁上防御相关的重要糖基GlcNAc与修饰了其特异性结合分子WGA的AFM探针间的结合概率在受到羧基富勒烯胁迫后显著上升(图 5C, 5D)。LSCM成像结果也表明，羧基富勒烯处理后的细胞，其细胞壁上的FITC-WGA荧光信号显著增强(图 5A, 5B)。而在除去羧基富勒烯环境下孵育一段时间后，细胞壁上的GlcNAc含量回归到正常水平。因而推测表达量增高的GlcNAc可抑制羧基富勒烯对植物细胞的毒性，该研究工作为探究纳米材料对生物及环境的影响提供了新的方法。

  图 5

  

  图 5.  AFM-FM联用技术在纳米粒子与细胞相互作用研究中的应用^{[73, 32]}。(A，B) C₇₀ (C(COOH)₂)_2-4刺激前(A)后(B)BY-2细胞的明场及LSCM荧光成像叠加图；(C，D)单分子力谱测得WGA/GlcNAc的结合力及不同条件下的结合概率；(E，F) TVA-mCherry荧光成像图(E)及与DIC图像的叠加图(F)，表明AFM探针置于MDCK-TVA细胞上方；(G)单分子力谱测得MDCK细胞上RABV-TVA的结合力；(H) RABV与TVA间的动力学力谱，插图为单个病毒与细胞膜通过多个键进行结合的示意图

  Figure 5.  Applications of AFM-FM in the study of nanoparticle-cell interaction ^{[73, 32]}. (A, B) Overlay of the optical and LSCM images of the untreated cells(A) and C₇₀ (C(COOH)₂)_2-4-treated cells(B); (C, D) The specific binding force between the WGA-modified tip and carboxyfullerene-treated BY-2 cell(C), and the binding probability under various conditions (D). The typical specific binding force curves before (A) and after the blocking (B) were shown (C, inser); (E, F) TVA-mCherry images (E) and superimposition with DIC images (F) showing the confluent layer of MDCK-TVA cells and the AFM tip placed above; (G) Distribution of adhesion forces measured between the AFM tip bearing RABV and MDCK-TVA cells, Insets: representative force-distance curves with asterisks indicating maximum adhesion peaks; (H) Rupture forces separating single virus-receptor bonds (circles) plotted against loading rate, Insets: the simplified model of a virus establishing multiple interactions with a cell surface

  下载: 全尺寸图片 幻灯片

  迄今为止，众多难以攻克的疾病均由病毒感染引起，了解病毒与宿主细胞膜结合的机理，将推动新型抗病毒药物以及基因治疗载体的开发。Alsteens等利用AFM-LSCM联用系统量化表征了单个狂犬病毒(RABV)锚定犬肾脏细胞(MDCK)的过程^[32]，采用先LSCM定位、后AFM扫描的策略(图 5E, 5F)，精确测定了单个RABV与其特异性受体TVA间的相互作用力；基于单分子动力学力谱结果，提出单个RABV可与1、2或3个TVA分子结合，且解离速率常数依次下降(图 5G, 5H)。从而认为RABV锚定细胞时，其表面的糖蛋白三聚体首先以一个亚基与单个TVA受体快速结合，形成弱相互作用。其它TVA受体与同一RABV的另外两亚基逐步连接，增强亲和力，使病毒稳定附着在细胞表面。

  5.   展望

  AFM-FM联用技术的建立和发展，推动了生命分析化学的发展，但针对活细胞体系的单分子水平分析检测仍处于起步阶段，需要解决诸多挑战性问题。首先是时间及空间分辨率的进一步提高，以发展适合于活细胞成像的高速AFM、超分辨荧光显微镜以及两者联用系统；其次，提高单个分子信号的检测水平，以实时反映生物单分子在生理过程中的动态行为。另一方面，在联用系统中除结合荧光强度检测外，还可充分发挥荧光光谱、荧光相关光谱和荧光寿命显微镜等多种荧光分析检测模式的优势，增强对生物分子结构变化的解析能力。若进一步与质谱等谱学技术联用，有望在活细胞体系实现成分、形貌以及生物单分子相互作用的同时检测。而发挥AFM的操纵功能，可实现在荧光显微镜的实时监测下，对活细胞体系的单个生物分子进行精准操控。AFM-FM联用技术在生命科学领域的广泛应用，将为阐明致病的诱因和机制、开发新型的药物及疗法、揭示生命的本质与规律带来新的机遇。

  
  
• 1. [1]

     余军平, 林毅, 江雅新, 赵新生, 方晓红.单分子荧光成像和单分子力谱研究活细胞中的单分子行为, 北京:科学出版社, 2005:13YU Jun-Ping, LIN Yi, JIANG Ya-Xin, ZHAO Xin-Sheng, FANG Xiao-Hong. Single-molecule Fluorescence Imaging and Single Molecular Force Spectroscopy in the Study of Single Molecular Behavior In Living Cells. Beijing:Science Press, 2005:13

  2. [2]

     Müller D J, Dufrêne Y F. Nature Nanotech., 2008, 3(5):261-269 doi: 10.1038/nnano.2008.100

  3. [3]

     Gahlmann A, Moerner W E. Nat. Rev. Microbiol., 2014, 12(1):9-22 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24336182

  4. [4]

     Hinterdorfer P, Dufrêne Y F. Nat. Methods, 2006, 3(5):347-355 doi: 10.1038/nmeth871

  5. [5]

     Fotiadis D, Liang Y, Filipek S, Saperstein D A, Engel A, Palczewski K. Nature, 2003, 421(6919):127-128 doi: 10.1038/421127a

  6. [6]

     Stroh C, Wang H, Bash R, Ashcroft B, Nelson J, Gruber H, Lohr D, Lindsay S M, Hinterdorfer P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2004, 101(34):12503-12507 doi: 10.1073/pnas.0403538101

  7. [7]

     程茗, 李楠, 方晓红.中国科学:化学, 2012, (12):1663-1671 http://kns.cnki.net/KCMS/detail/detail.aspx?filename=jbxk201212003&dbname=CJFD&dbcode=CJFQCHENG Ming, LI Nan, FANG Xiao-Hong. Sci. China-Chem., 2012, (12):1663-1671 http://kns.cnki.net/KCMS/detail/detail.aspx?filename=jbxk201212003&dbname=CJFD&dbcode=CJFQ

  8. [8]

     Sun Y, Li N, Fang X. Prog. Biophys. Mol. Biol., 2015, 118(3):95-102 doi: 10.1016/j.pbiomolbio.2015.04.009

  9. [9]

     Wang S, Su J H, Beliveau B, Bintu B, Moffitt J, Wu C, Zhuang X. Science, 2016, 353(6299):598-602 doi: 10.1126/science.aaf8084

  10. [10]

      Wang C, Han B, Zhou R, Zhuang X W. Cell, 2016, 165(4):990-1001 doi: 10.1016/j.cell.2016.04.040

  11. [11]

      Lu H P, Xun L, Xie X S. Science, 1998, 282(5395):1877-1882 doi: 10.1126/science.282.5395.1877

  12. [12]

      Binnig G, Quate C F, Gerber C. Phys. Rev. Lett., 1986, 56(9):930-933 doi: 10.1103/PhysRevLett.56.930

  13. [13]

      Seelert H, Poetsch A, Dencher N A, Engel A, Stahlberg H, Müller D J. Nature, 2000, 405(6785):418-419 doi: 10.1038/35013148

  14. [14]

      Kufer S K, Puchner E M, Gumpp H, Liedl T, Gaub H E. Science, 2008, 319(5863):594-596 doi: 10.1126/science.1151424

  15. [15]

      Shi X, Zhang X, Xia T, Fang X H. Nanomedicine, 2012, 7(10):1625-1637 doi: 10.2217/nnm.12.130

  16. [16]

      Benoit M, Gabriel D, Gerisch G, Gaub H E. Nat. Cell. Biol., 2000, 2(6):313-317 doi: 10.1038/35014000

  17. [17]

      Lee S, Mandic J, Van Vliet K J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2007, 104(23):9609-9614 doi: 10.1073/pnas.0702668104

  18. [18]

      Horton M, Charras G, Lehenkari P. J. Recept Signal Transduct Res., 2002, 22(1-4):169-190 doi: 10.1081/RRS-120014594

  19. [19]

      Xiao J, Dufrêne Y F. Nat. Microbiol., 2016, 1(11):16186 doi: 10.1038/nmicrobiol.2016.186

  20. [20]

      Yang Y, Xia T, Zhang W, Fang X. Chin. Sci. Bull., 2011, 56(11):1063-1067 doi: 10.1007/s11434-011-4415-1

  21. [21]

      Kaksonen M, Toret C P, Drubin D G. Cell, 2005, 123(2):305-320 doi: 10.1016/j.cell.2005.09.024

  22. [22]

      Dyachok O, Isakov Y, Sågetorp J, Tengholm A. Nature, 2006, 439(7074):349-352 doi: 10.1038/nature04410

  23. [23]

      Bougourd S, Marrison J, Haseloff J. Plant J. Cell Mol. Biol., 2000, 24(4):543-550 doi: 10.1046/j.1365-313x.2000.00892.x

  24. [24]

      Erickson J R, Joiner M A, Guan X, Kutschke W, Yang J, Oddis C V, Bartlett R K, Lowe J S, O'Donnell S, Aykinburns N. Cell, 2008, 133(3):462-474 doi: 10.1016/j.cell.2008.02.048

  25. [25]

      Laskowski P R, Pfreundschuh M, Stauffer M, Ucurum Z, Fotiadis D, Müller D J. ACS Nano, 2017, 11(8):8292-8301 doi: 10.1021/acsnano.7b03456

  26. [26]

      Hell S W, Wichmann J. Opt. Lett., 1994, 19(11):780-782 doi: 10.1364/OL.19.000780

  27. [27]

      Willig K I, Rizzoli S O, Westphal V, Jahn R, Hell S W. Nature, 2006, 440(7086):935-939 doi: 10.1038/nature04592

  28. [28]

      Betzig E, Patterson G H, Sougrat R, Lindwasser O W, Olenych S, Bonifacino J S, Davidson M W, Lippincottschwartz J, Hess H F. Science, 2006, 313(5793):1642-1645 doi: 10.1126/science.1127344

  29. [29]

      Rust M J, Bates M, Zhuang X W. Nat. Methods, 2006, 3(10):793-795 doi: 10.1038/nmeth929

  30. [30]

      York A G, Ghitani A, Vaziri A, Davidson M W, Shroff H, Nat. Methods, 2011, 8(4):327-333 doi: 10.1038/nmeth.1571

  31. [31]

      Shaw J E, Oreopoulos J, Wong D, Hsu J C Y, Yip C M. Surf. Interface Anal., 2010, 38(11):1459-1471 doi: 10.1002/sia.2444

  32. [32]

      Alsteens D, Newton R, Schubert R, Martinezmartin D, Delguste M, Roska B, Müller D J. Nat. Nanotech., 2016, 12(2):177-183 doi: 10.1038/nnano.2016.228

  33. [33]

      Yu J, Yuan J, Zhang X, Liu J, Fang X. Chin. Sci. Bull., 2013, 58(33):4045-4050 doi: 10.1007/s11434-013-6011-z

  34. [34]

      Fukuda S, Uchihashi T, Iino R, Okazaki Y, Yoshida M, Igarashi K, Ando T. Rev. Sci. Instrum., 2013, 84(7):073706 doi: 10.1063/1.4813280

  35. [35]

      Timmel T, Schuelke M, Spuler S. Microsc. Microanal., 2014, 20(2):514-520 doi: 10.1017/S1431927613014098

  36. [36]

      Axelrod D. Method Cell Biol., 1989, 30(11):245-270 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2648115

  37. [37]

      Mathur A B, Truskey G A, Reichert W M. Biophys. J., 2000, 78(4):1725-1735 doi: 10.1016/S0006-3495(00)76724-5

  38. [38]

      Gumpp H, Stahl S W, Strackharn M, Puchner E M, Gaub H E. Rev. Sci. Instrum., 2009, 80(10):063704 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19566207

  39. [39]

      Shibata M, Yamashita H, Uchihashi T, Kandori H, Ando T. Nat. Nanotech., 2010, 5(3):208-212 doi: 10.1038/nnano.2010.7

  40. [40]

      Colom A, Casuso I, Rico F, Scheuring S. Nat. Commun., 2013, 4:2155 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23857417

  41. [41]

      Hillner P E, Walters D A, Lal R, Hansma H G, Hansma R. Microsc. Microanal., 1995, 1(3):127-130 doi: 10.1017/S1431927695111277

  42. [42]

      Meyer G, Amer N M. Appl. Phys. Lett., 1988, 53(12):1045-1047 doi: 10.1063/1.100061

  43. [43]

      Kassies R, Ko V D W, Lenferink A, Hunter C N, Olsen J D, Subramaniam V, Otto C. J. Microsc., 2005, 217(1):109-116 doi: 10.1111/jmi.2005.217.issue-1

  44. [44]

      Ebenstein Y, Mokari T, Banin U. Appl. Phys. Lett., 2002, 80(21):4033-4035 doi: 10.1063/1.1482785

  45. [45]

      Müller D J, Schabert F A, Büldt G, Engel A. Biophys. J., 1995, 68(5):1681-1686 doi: 10.1016/S0006-3495(95)80345-0

  46. [46]

      Harke B, Chacko J V, Haschke H, Canale C, Diaspro A. Optical Nanoscopy, 2012, 1(1):1-6 doi: 10.1186/2192-2853-1-1

  47. [47]

      Chacko J V, Canale C, Harke B, Diaspro A. Plos One, 2013, 8(6):e66608 doi: 10.1371/journal.pone.0066608

  48. [48]

      Monserrate A, Casado S, Flors C. Chemphyschem, 2014, 15(4):S1 647-650 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24273067

  49. [49]

      Chacko J V, Zanacchi F C, Diaspro A. Cytoskeleton, 2013, 70(11):729-740 doi: 10.1002/cm.v70.11

  50. [50]

      Odermatt P D, Shivanandan A, Deschout H, Jankele R, Nievergelt A P, Feletti L, Davidson M W, Radenovic A, Fantner G E. Nano Lett., 2015, 15(8):4896-4904 doi: 10.1021/acs.nanolett.5b00572

  51. [51]

      Weghuber J, Sunzenauer S, Plochberger B, Brameshuber M, Haselgrübler T, Schütz G J. Anal. Bioanal.Chem., 2010, 397(8):3339-3347 doi: 10.1007/s00216-010-3854-x

  52. [52]

      Yu J, Sun S, Jiang Y, Ma X, Chen F, Zhang G, Fang X. Polymer, 2006, 47(7):2533-2538 doi: 10.1016/j.polymer.2005.12.087

  53. [53]

      Yu J, Wang Q, Shi X, Ma X, Yang H, Chen Y G, Fang X. J. Phys. Chem. B, 2007, 111(48):13619-13625 doi: 10.1021/jp0758667

  54. [54]

      Yang H, Yu J, Fu G, Shi X, Xiao L, Chen Y, Fang X, He C. Exp. Cell Res., 2007, 313(16):3497-3504 doi: 10.1016/j.yexcr.2007.08.001

  55. [55]

      Andre G, Deghorain M, Bron P A, van Swam I I, Kleerebezem M, Hols P, Dufrene Y F, ACS. Chem. Biol., 2011, 6(4):366-376 doi: 10.1021/cb1003509

  56. [56]

      Yang Y, Xu Y, Xia T, Chen F, Zhang C, Liang W, Lai L, Fang X. Chem. Commun., 2011, 47(19):5440-5442 doi: 10.1039/c1cc10778j

  57. [57]

      Yang Y, Wolfram J, Shen H, Fang X, Ferrari M. Eur. J. Med. Chem., 2012, 58:390-395 doi: 10.1016/j.ejmech.2012.10.028

  58. [58]

      Zhang W, Yuan J, Yang Y, Xu L, Wang Q, Zuo W, Fang X, Chen Y G. Cell Res., 2010, 20(11):1216-1223 doi: 10.1038/cr.2010.105

  59. [59]

      Zhang W, Jiang Y, Wang Q, Ma X, Xiao Z, Zuo W, Fang X, Chen Y G. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2009, 106(37):15679-15683 doi: 10.1073/pnas.0908279106

  60. [60]

      Ye Z, Li N, Zhao L, Sun Y, Ruan H, Zhang M, Yuan J, Fang X. Sci. Bull., 2016, 61(8):632-638 doi: 10.1007/s11434-016-1043-9

  61. [61]

      Xiao H, Ma X, Feng W, Fu Y, Lu Z, Xu M, Shen Q, Zhu Y, Zhang Y. Cardiovasc. Res., 2010, 87(3):504-513 doi: 10.1093/cvr/cvq066

  62. [62]

      Xiao H, Zhang J, Xu Z H, Li J Y, Xu Z, Feng Y, Zhang M, Liu J, Chen R, Shen J, Wu J, Lu Z, Fang X, Li J, Zhang Y. Sci. Rep., 2016, 6(6):28597

  63. [63]

      Li Y, Shi X L, Liu H L, Yi S Q, Zhang X J, Fang X H. Sci. China-Chem., 2010, 53(4):752-758 doi: 10.1007/s11426-010-0111-2

  64. [64]

      Shi X, Xu L, Yu J, Fang X. Exp. Cell Res., 2009, 315(16):2847-2855 doi: 10.1016/j.yexcr.2009.05.023

  65. [65]

      Wei Y, Zhang X, Xu L, Yi S, Li Y, Fang X, Liu H. Sci. China Life Sci., 2012, 55(10):891-897 doi: 10.1007/s11427-012-4383-y

  66. [66]

      Liu J, Zhang X, Wang X, Li X, Li J, Fang X. Sci. Bull., 2016, 61(15):1-8 http://kns.cnki.net/KCMS/detail/detail.aspx?filename=jxtw201615008&dbname=CJFD&dbcode=CJFQ

  67. [67]

      Valle-Delgado J J, Urbán P, Fernàndez-Busquets X. Nanoscale, 2013, 5(9):3673-3680 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23306548

  68. [68]

      Zhang L, Yang F, Cai J Y, Yang P H, Liang Z H. Biosens.Bioelectron., 2014, 56(1):271-277 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24514079

  69. [69]

      Alsteens D, Garcia M C, Lipke P N, Dufrene Y F. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2010, 107(48):20744-20749 doi: 10.1073/pnas.1013893107

  70. [70]

      He K, Luo W, Zhang Y, Liu F, Liu D, Xu L, Qin L, Xiong C, Lu Z, Fang X. ACS Nano, 2010, 4(6):3015-3022 doi: 10.1021/nn1002198

  71. [71]

      He K, Shi X, Zhang X, Dang S, Ma X, Liu F, Xu M, Lyu Z, Han D, Fang X. Cardiovasc. Res., 2011, 92(1):39-47 doi: 10.1093/cvr/cvr189

  72. [72]

      Dixon I M, Davies J J. Cardiovasc. Res., 2011, 92(1):5-6 doi: 10.1093/cvr/cvr216

  73. [73]

      Liu Q, Zhang X, Zhao Y, Lin J, Shu C, Wang C, Fang X. Environ. Sci. Technol., 2013, 47(13):7490-7498 doi: 10.1021/es4010224

• 

  图 1  AFM-FM联用系统结构及成像图^[31~35] (A) AFM-TIRFM联用系统；(B) AFM-LSCM联用系统；(C) AFM-STED联用系统；(D)罗丹明标记的肌动蛋白微丝TIRFM图像，插图为白色方框区域的AFM形貌图；(E) Clathrin-EGFP包被小窝的LSCM及AFM成像叠加图(校准后)；(F)聚苯乙烯纳米颗粒的STED荧光图像(左上)、AFM形貌(右上)、力分布(左下)及黏附力(右下)图像

  Figure 1  Schematic and imaging of the integrated AFM-FM system^[31~35]. (A) The integrated AFM-TIRFM; (B) The integrated AFM-LSCM; (C) The integrated AFM-STED; (D) TIRFM image of rhodamine-labeled actin filaments. Inset is AFM image of the area shown by the white rectangle in the TIRFM image; (E) Overlay of re-aligned height and fluorescence of EGFP-Clathrin coated pits (Clc-EGFP); (F) The integrated STED/AFM imaging of 40 nm nanobeads. STED image(upper left), AFM morphological image(upper right), AFM force volume imaging(lower left), AFM force adhesion mapping(lower right).

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  图 2  AFM-FM联用技术在配受体相互作用研究中的应用^{[53, 54]} (A)修饰TGF-βⅠ的AFM探针与细胞膜上特定受体间单分子力谱测量示意图；(B, C)共表达TGF-βⅠ型受体(TβRⅡ-GFP，左)及TGF-β Ⅱ型受体(TβRⅡ-RFP，右)的细胞荧光成像图；(D) TGF-βⅠ/TβRⅡ(a)及TGF-βⅠ/TβRⅠ/TβRⅡ(b)的单分子动力学力谱；(E, G) Mn²⁺活化后的Mac-1、多种Mac-1突变体与ICAM-1间相互作用的单分子动力学力谱比较

  Figure 2  The applications of AFM-FM inligand-receptor interactions study^{[53, 54]}. (A) Schematic diagram of single-molecule force measurement in living cells with a TGF-βⅠ-modified AFM tip. The tip was positioned directly above a cell expressing the desired TGF-β receptors; (B, C) Fluorescence images recorded in GFP channel (B) and RFP channel (C) for the cells co-transfected with TβRⅠ-GFP and TβRⅡ-RFP; (D) Dynamic Force Spectra of TGF-βⅠ/TβRⅡ (a) and TGF-βⅠ/TβRⅠ/TβRⅡ (b). (E, G) Comparison of dynamic force spectra measured with Mn²⁺ activated wild-type Mac-1 and different Mac-1 mutants for ICAM-1 binding

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  图 3  AFM-FM联用技术在药物作用机制研究中的应用^[56] (A)典型的TβRⅡ-GFP单分子荧光成像图；(B)不同化合物作用前后TβRⅡ单体和二聚体的比例；(C)典型的TβRⅡ-GFP荧光漂白曲线，左图为单体一步漂白, 右图为二聚体两步漂白；(D)修饰TGF-βⅠ的AFM针尖在表达TβRⅡ的细胞上测得的单分子力谱；(E)不同浓度柚皮素刺激下，TGF-βⅠ及TβRⅡ的结合概率；(F)柚皮素加入前(左)后(右)，TGF-βⅠ及TβRⅡ的结合力

  Figure 3  The applications of AFM-FM in the drug studies^[56]. (A) A typical single-molecule image of TβRⅡ-GFP; (B) Monomer and dimer population under various conditions; (C) Schematics of one and two-step bleaching for monomeric and dimeric receptors, respectively; (D) Representative force curves obtained with TGF-βⅠ-modified AFM tips on the cell expressing TβRⅡ-GFP; (E) The binding probability of TGF-βⅠ and TβRⅡ when the cells are treated with different concentrations of Naringenin; (F) Histograms of binding forces of TGF-βⅠ and TβRⅡ with untreated cells (left) and the cells treated with 50 m mol/L Naringenin (right).

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  图 4  AFM-FM联用技术在细胞刺激响应机制研究中的应用^{[69, 71]}. (A) Als5p黏附区域的AFM形貌图及单分子黏附力谱图；(B, C)表达Als5p(B)及Als5p突变体(C)的细胞，其聚集情况的荧光成像图；(D). Fluo-4标记的钙信号沿细胞间膜纳米管的传播

  Figure 4  The applications of AFM-FM in the study of cell response after mechanical stimulation ^{[69, 71]}. (A) AFM topographic images and single molecular adhesion force maps of Als5p nanodomains; Fluorescence imaging of the aggregation of cells expressing Als5p (B) or Als5p mutant (C); (D) Calcium flux propagation between two membrane nanotube connected cells

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
  

  图 5  AFM-FM联用技术在纳米粒子与细胞相互作用研究中的应用^{[73, 32]}。(A，B) C₇₀ (C(COOH)₂)_2-4刺激前(A)后(B)BY-2细胞的明场及LSCM荧光成像叠加图；(C，D)单分子力谱测得WGA/GlcNAc的结合力及不同条件下的结合概率；(E，F) TVA-mCherry荧光成像图(E)及与DIC图像的叠加图(F)，表明AFM探针置于MDCK-TVA细胞上方；(G)单分子力谱测得MDCK细胞上RABV-TVA的结合力；(H) RABV与TVA间的动力学力谱，插图为单个病毒与细胞膜通过多个键进行结合的示意图

  Figure 5  Applications of AFM-FM in the study of nanoparticle-cell interaction ^{[73, 32]}. (A, B) Overlay of the optical and LSCM images of the untreated cells(A) and C₇₀ (C(COOH)₂)_2-4-treated cells(B); (C, D) The specific binding force between the WGA-modified tip and carboxyfullerene-treated BY-2 cell(C), and the binding probability under various conditions (D). The typical specific binding force curves before (A) and after the blocking (B) were shown (C, inser); (E, F) TVA-mCherry images (E) and superimposition with DIC images (F) showing the confluent layer of MDCK-TVA cells and the AFM tip placed above; (G) Distribution of adhesion forces measured between the AFM tip bearing RABV and MDCK-TVA cells, Insets: representative force-distance curves with asterisks indicating maximum adhesion peaks; (H) Rupture forces separating single virus-receptor bonds (circles) plotted against loading rate, Insets: the simplified model of a virus establishing multiple interactions with a cell surface

  下载: 全尺寸图片 幻灯片
•