English

• 1.   引言

  碳点是一类粒径约10 nm的新型光致发光碳纳米材料，包括碳量子点(Carbon quantum dots，CQDs)、石墨烯量子点(Graphene quantum dots，GQDs)和碳纳米点(Carbon nanodots)^[1]。碳量子点具有量子限域效应和晶体结构，是一种球形量子点; 石墨烯量子点同样具有量子限域效应和晶体结构，但仅由π共轭的单片状或寡层的石墨烯层构成; 而碳纳米点一般是由单分子或线状的聚合物分子组成的无定形结构，不具有晶体结构。碳是生物有机体的骨架元素，具有良好的生物相容性，且来源广泛、经济易得，因此自2004年首次发现以来^[2]便获得研究人员的青睐。早期制备碳点主要以炭黑、蜡烛灰、石墨烯或碳纳米管等碳材料为原料，通过激光消融法^{[3, 4]}、电化学合成法^[5~8]和酸氧化法^[9~11]等从上到下的策略合成。为了增强碳点荧光并拓宽其应用，通常需要在碳点合成后进行表面钝化和功能化处理^{[3, 10, 12, 13]}。

  经过十多年的研究，制备碳点的方法变得越来越简单、成熟，而且多样化; 反应前体也由传统的碳材料转为有机小分子、高分子聚合物，甚至是天然物质和废弃材料等^[14~22]。由于碳点具有良好的生物相容性和抗光漂白作用，即使早期碳点的荧光量子产率相对较低，发射相对单一(多为蓝绿色发射的荧光)，研究人员也将其用于荧光成像^{[4, 7, 8]}。随着碳点功能化研究的深入，光致发光效率得到显著提高，其成像应用研究越来越广泛。研究人员发现，碳点功能化是改善碳点结构和性能的重要手段，主要包括表面修饰和异元素掺杂两种方式。表面修饰是将具有特殊性质的小分子或蛋白质等修饰到碳点的表面; 异元素掺杂则是直接将待掺杂的元素与反应物共合成，即异元素参与了碳点中碳核的形成^{[23, 24]}，从而改变碳点的结构和性质。本文系统地总结了异元素掺杂碳点的合成及其在生物成像应用中的研究发展。

  2.   异元素掺杂碳点的合成

  2.1   合成方法

  异元素掺杂碳点的制备策略与未掺杂碳点相同，包括自上至下和自下至上两种路径。因为掺杂碳点的碳核中需要引入新元素，所以采用自上而下策略制备掺杂碳点的报道相对较少。主要是以石墨棒^[25]、石墨烯^[26]、碳化纤维^[27]等为原料，通过在特殊电解液或溶剂中发生电化学反应^{[25, 26]}或溶剂热反应^[28]，将异元素掺杂在GQDs中。大部分掺杂碳点通过自下而上的路径制备，在这种策略下，碳源和掺杂元素的来源选择性更大(包括各种小分子、生物大分子、天然物质甚至废弃物)，合成方法更多。掺杂碳点的合成从操作步骤上可分为多步合成和一步合成，多步合成包括碳点合成和元素掺杂两个步骤，合成得到碳点后，再进一步反应将异元素掺杂在碳点中，操作相对复杂^{[29, 30]}; 一步法则是将碳源与掺杂元素原料一起反应，在制备碳点的过程中同时实现元素掺杂，其操作简单，因此广泛用于合成掺杂碳点。

  制备掺杂碳点最常用的方法有热解法、微波辅助法和水热法。热解法是指有机分子在高温下受热碳化从而获得碳点的方法，无设备要求，操作简单，其中反应温度是影响碳点性质的最直接因素^{[31, 32]}。Krysmann等^[32]以柠檬酸与乙二胺为前体，在180、230、300和400℃的温度下裂解得到碳点，发光性质各不相同。CDs-180有很强的荧光(量子产率为50%)，呈现不依赖于激发波长的发射性质(Excitation-independent emission，EIE)，此时主要是柠檬酸与乙二胺脱水形成分子的荧光，即分子态荧光; CDs-230的荧光量子产率降低到约15%，这是因为有大量的荧光分子碳化形成了碳核，此时分子态和碳核态光致发光并存; CDs-300的荧光量子产率减弱到约4%，粒径由180℃时的19 nm减小到300℃时的约8 nm，荧光呈现出依赖激发波长(Excitation-dependent emission，EDE)的发射。说明随着温度升高，表面未反应的分子进一步碳化形成碳核，光致发光也由以分子态为主转变为以碳核态为主。该研究表明，在热解制备碳点的过程中，较低温度下，分子态荧光占主导地位，碳核是在较高温度下形成的，碳点的发光性质和效率很大程度上依赖于反应条件，主要是反应温度的影响。微波辅助合成反应速度快效率高，反应体系中条件均一，所得产品均匀，因此应用广泛^[33~39]。Zhai等^[37]以柠檬酸为碳源、乙二胺为氮源，考察了微波辅助合成中反应时间对碳点性质的影响，发现2 min是最佳反应时间。时间不足2 min，碳核未形成; 超过2 min又会造成温度过高，碳点表面结构被破坏，荧光减弱。水热或溶剂热法相对能够提供更高的温度和更大的压强，对于分子结构中键能较大的分子可以采用这种方法合成，是应用最多的方法^[40~54]。Hsu等^[55]分别用4种含N小分子(氨基丁三醇、四乙酸乙二胺、尸胺和甘氨酸)为前体水热合成碳点，这些分子不仅是碳核氮元素来源也是碳点表面功能化的分子，不同的功能化分子造成碳点荧光强弱不同。以甘氨酸合成碳点为例，作者认为碳点的形成分为4个步骤：脱水、聚合、碳化和钝化(图 1)。Moon等^[56]分析了两种不同制备方法对碳点表面基团的影响：以富马二腈为原料，分别通过热解法和水热法制备了疏水性和亲水性的N掺杂石墨烯结构碳点，热解过程中，腈基经历热氧化还原降解和环化步骤，然后碳化形成疏水性的碳点; 水热反应时，富马二腈结构部分转变成氨基和亚氨酸，通过脱水缩合形成两亲性的碳点。

  图 1

  

  图 1.  由甘氨酸水热法合成N掺杂碳点示意图^[55]

  Figure 1.  Illustration of hydrothermal synthesis of nitrogen doped carbon dots (N-CDs) from glycine^[55]

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  这些合成方法通常需要消耗大量能量，研究者进一步发展了绿色合成方法，包括自放热合成法和室温合成法等。自放热合成法在非掺杂碳点合成中已有文献报道，Fang等^[57]利用P₂O₅在水中溶解产生的溶解热使醋酸气化或碳化产生中空的荧光碳点。合成元素掺杂碳点时采用这些方法，可以更好地保留碳源和异元素前体的活性官能团。Wei^[58]和Kang^[59]等分别报道了利用中和反应热制备掺杂碳点的研究：体系中由乙二胺与无机酸提供中和反应热，分别以葡萄糖和多巴胺为碳源，乙二胺为氮源，合成得到N掺杂碳点。本课题组利用过氧化氢分解放热，由对苯二酚与乙二胺制备N-CDs^[60]。Tang等^[61]发现，葡萄糖与氨水在常温常压下放置8个月可得到N掺杂碳点，但用此方法制备碳点显然耗时太长。Liu等^[62]用对苯醌与三亚乙基四胺在室温条件下反应20 h合成N-CDs，分离后得到绿色EIE荧光的N-CNDs和黄色EDE荧光的N-GQDs。两者有类似的粒径大小和化学基团，但是其表面氧化程度具有显著差异，说明碳点的光致发光性质主要受表面氧化程度的影响。

  2.2   掺杂元素

  元素掺杂是调节CDs内在结构性能、优化碳点性质的重要手段。这是因为异原子的引入能改变CDs的电子分布，这与最高已占轨道HOMO和最低未占轨道LUMO能隙相关，从而影响其光学性质。通过调整掺杂原子的种类和数量可以提高碳点的荧光量子产率，改变其荧光发射峰位。因此，近十年来，研究人员用各掺杂试剂或多元素共掺杂制备具有良好光学性能的碳点。

  2.2.1   非金属元素掺杂

  非金属元素掺杂碳点一般指的是N、S、B、P和Cl等元素掺杂的碳点，这些元素的电负性均与碳不同。无论是掺入电负性比碳高还是电负性比碳低的异原子，都会引起碳点电子重新分布。N是掺杂碳点中研究最早也是研究最多的元素，最早提出N掺杂概念的文献是以草水热合成制备的N掺杂富碳荧光纳米点的研究。草中有多种生物大分子，如糖和纤维素等，也有含N元素的各种分子，水热反应过程得到了N掺杂的富碳荧光纳米颗粒^[63]。随后，出现了大量以自然界富含氮元素的物质(蚕丝^[64]、豆浆^[52]、枸杞^[65]、土豆^[43]、荸荠和洋葱^[66]等)制备掺杂碳点的报道。这些研究所用材料组分复杂，不利于分析N含量对碳点性质影响趋势。

  研究人员以不同的小分子作为C、N源，通过控制C/N比得到不同N掺杂碳点，并探索了氮对碳点光学性质的影响趋势。Zhu等^[50]在相同的反应条件下，改变碳源(柠檬酸、柠檬酸盐或直接以乙二胺为碳源)、氮源(乙二胺、乙胺、尿素、庚胺和对苯二胺等)及碳源和氮源的组成比例制备碳点。结果显示，柠檬酸和乙二胺分别为碳氮源时，在一定范围内，荧光量子产率随着乙二胺用量增加而增大，且柠檬酸0.42 g和乙二胺536 μL合成得到的碳点荧光量子产率最高，可达到80%。目前，柠檬酸是制备掺杂碳点应用最广的碳源，乙二胺也是相对应用较多的N源。本课题组通过调节柠檬酸和盐酸胍的比例，合成了一系列含氮量逐渐增加的N-CDs，对比碳点的发光性质，再次确认随着N含量的增加N-CDs荧光量子产率大幅增加^[67]。通过表征碳点结构后，分析推断有两种可能的影响因素：首先是N掺杂增加碳点共轭程度，电子跃迁的可能性更大，工业从而提高量子产率; 再者，N掺杂在碳点能带间隙中引入能量势陷，这些势陷捕获电子或者空穴，碳点更有可能发生高效率的辐射跃迁，因此氮元素的掺杂有利于高效的辐射跃迁，并且抑制非辐射跃迁。同时N含量增加还促使碳点从EDE荧光到EIE荧光的转变，造成这种转变的原因是N以—NH₂钝化碳点表面，足量的—NH₂钝化后，碳点表面各种基团造成的多能级变成单一能级，因此原来的多种跃迁形式也变成单一跃迁形式，从而表现出EIE荧光。Li等^[48]以柠檬酸和尿素为前体，改变其比例和水热反应的时间，制备出不同碳点，发现温度较低(160℃)时碳点表现出EIE荧光，且荧光量子产率更高，达到44.7%;温度升高至240℃后，表现出EDE发射且荧光减弱(荧光量子产率为20.8%)。进一步表征，得出相同的推论：CDs-160表面的—NH₂可以增大共轭程度，造成荧光增强; 另外—NH₂钝化CDs原本存在的多样基团，使得CDs能量级单一，呈现EIE荧光(图 2)。

  图 2

  

  图 2.  碳点表面-NH₂与激发依赖或激发无关发光特性的关系：具有不同表面状态的碳点呈现依赖于激发的发射，表面富含氨基的碳点呈现不依赖于激发的发射^[48]

  Figure 2.  Excitation-dependent emission (EDE) or excitation-independent emission (EIE) of CDs depend on surface-state of carbon dots. Carbon dots with various surface states present EDE. CDs rich in amino-groups exhibit EIE^[48]

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  N掺杂对碳点荧光性质的影响还表现在影响碳点的发射波长。Jiang等^[45]以邻、间、对苯二胺为反应前体，以甲醇为溶剂，分别在反应釜中合成碳点，所得溶液即显不同的颜色(黄色、白色和红色)，硅胶柱纯化后得到的碳点溶液在365 nm波长激发下分别呈现绿色、蓝色和红色的荧光(图 3)。进一步表征发现，3种碳点表面基团相似，只有粒径和N元素含量不同，因此推断这两项差异是造成3种碳点发射峰位不同的原因。Ding等^[68]在此基础上以对苯二胺和尿素为原料合成碳点，经过硅胶柱分离后得到从蓝色到红色的多色发射碳点，这些碳点的发射波长随着碳点表面的氧化程度增加而红移，与粒径大小无关。Qu等^[69]分别以柠檬酸和尿素为碳、氮源，以二甲基甲酰胺(DMF)为溶剂，制备具有大共轭sp²区域的碳点，该碳点发橙色荧光。Lu等^[70]考虑苯二胺与多巴胺能形成大的共轭结构，因此选择二者作为原料，200℃下水热合成得到近红外发射的N掺杂碳点。该碳点在540 nm激发时发射峰位于710 nm，并带有665 nm的肩峰，荧光量子产率可达26.28%。为了解释碳点近红外发射的机理，他们在150℃和250℃下分别合成得到红色发射和蓝色发射的碳点，通过IR和XPS表征发现：反应温度150℃时的产物是多巴胺和邻苯二胺通过脱水反应形成交织在一起的聚合物链，即以分子态为主，此时有石墨N结构; 200℃下合成的碳点由碳核与聚合物链共存，此时仍然存在石墨N结构; 在250℃下合成的碳点表面的聚合物链基本碳化，石墨N结构消失。因此推断羰基和石墨N在碳点红色发射上扮演着重要的角色。

  图 3

  

  图 3.  分别以邻、间、对苯二胺为前体，溶剂热反应制备发射绿、蓝、红色荧光的碳点^[45]

  Figure 3.  Preparation of RGB fluorescent CDs from three different phenylenediamine isomers^[45]

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  基于N掺杂对碳点性质影响的趋势和机理，也经常利用N元素与其它异元素共掺杂改变碳点的性质^[71~81]。Dong等^[81]以柠檬酸与L-半胱氨酸合成N，S-CDs，荧光量子产率达73%。比较了O-CDs(由柠檬酸制备的未掺杂碳点)、N-CDs(柠檬酸和甘氨酸制备)与N，S-CDs三者的荧光性质。N-CDs的荧光比未掺杂碳点有所增强，且N，S-CDs的荧光量子产率比N-CDs大幅增加; 同时由O-CDs的EDE荧光变成EIE荧光。这是因为N掺杂引入了新的表面态，使得碳点表面原来的多能级减少，且辐射程度增强; S元素掺杂放大了N对碳点的能级分布状态的影响(图 4)。Lin^[74]和Qu^[80]等也分别用不同的来源制备高荧光量子产率的N，S-CDs。S元素单独掺杂也有报道，Chandra等^[82]以硫代苹果酸在浓H₂SO₄中受热回流4 h得到S-CDs，碳点表面存在S，因此该碳点易于包裹在AuNPs周围。Ge等^[83]以制备的聚噻吩苯丙酸为碳点来源，经过水热反应合成得到S-CDs，该碳点呈现红色发射。

  图 4

  

  图 4.  O-CDs、N-CDs、N，S-CDs的发光机理示意图。(1)从基态激发且被表面状态束缚的电子，(2)从基态以非辐射方式回到基态的电子，(3)从激发态以辐射方式回到基态的电子^[81]

  Figure 4.  Schematic of fluorescence mechanism of O-CDs, N-CDs, and N, S-CDs. (1) Electrons excited from the ground state and trapped by the surface states; (2) non-radiative route of excited electrons; (3) radiative route of excited electrons^[81]

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  除N、S两种研究相对较多的掺杂元素外，B、Si、P和Cl等非金属元素也被用于碳点掺杂，并改变碳点的结构和性质^[84~98]。Choi等^[86]以柠檬酸、乙二胺和硼酸分别为C、N、B源，微波辅助合成B，N-CDs; 并以同样的方法，改变原料分别合成无掺杂CDs、N-CDs和B-CDs。发现单独B掺杂对碳点的荧光增强没有作用，而B，N-CDs荧光量子产率达80%，比单独N掺杂的碳点荧光量子产率(40%)有大幅增加。分析应该是B，N-CDs具有更少且更均匀的表面状态，这是其荧光强于N-CDs的原因; 另外一个原因是其单颗粒发射的光子比N-CDs多。Jahan等^[96]以羟苯甘氨酸和硼酸为原料合成N，B-CDs，用于检测苏丹红-Ⅲ。基于硼与葡萄糖的作用，Zhang^[89]和Shen^[90]分别制备B-CDs，用于葡萄糖检测。Chen等^[97]以3-氨基丙基3-甲氧基硅烷(APTMS)为原料，采用水热法一步合成Si-CDs。因为Si—OH的存在，碳点易于修饰固化。Jiang等^[85]以3-氨基丙基3-乙氧基硅烷和甘油为原料，采用微波法合成Si，N掺杂碳点，多巴胺功能化后特异性检测Ag⁺，并用于细胞中Ag⁺的传感和成像。Zhang等^[84]利用柠檬酸与N-(3-(三甲氧基硅基)丙基)乙二胺合成得到N，Si-CDs，制备白光发光器件。Shi等^[99]以葡萄糖为碳源，与氨水、磷酸为掺杂试剂水热法制备N，P-CDs，用于Fe³⁺灵敏检测，并用于细胞中Fe³⁺的荧光成像。Li等^[40]以果糖和盐酸水热合成制备Cl-CDs，Cl^-的有效掺杂会引入额外的能级，从而使电子跃迁更加多样化。Cl、P共掺杂碳点由Hu等^[100]以五氯化磷和乙二醇为反应物水热合成得到，表现出良好的催化性能。因为Cl和P的掺杂调整了碳点表面的电荷分布，促使碳点表面光致电荷分离更容易，因此催化活性增强。

  2.2.2   金属元素掺杂

  金属元素的掺杂不仅改变碳点的电子分布，还能赋予碳点一些新的功能，受到广泛关注。研究人员发展了金属元素(Cu、Mg、Fe、Ge、Gd等)与非金属元素(以N最常见)共掺杂的碳点合成路线。Wu等^[101]以Na₂[Cu(EDTA)]为前体一步热解法合成N，Cu-CDs，这是由于在热解过程中，类似希夫碱结构转变成石墨烯矩阵与铜离子鳌和的配位化合物。由于Cu的引入，这种Cu、N共掺杂的碳点接收电子和给予电子的能力分别增加2.5和1.5倍，电导率增大; 催化能力比无Cu的N-CDs高了3.5倍。本课题组以具有还原性的抗坏血酸和Na₂[Cu(EDTA)]为前体，250℃热解得到具有锯齿形边界的黄色荧光CDs，Cu(Ⅰ)掺杂其中并稳定存在(图 5)^[102]。其中的Cu(Ⅰ)具有能够催化叠氮基与炔基反应的作用，并因为掺杂在稳定碳点结构中，得以缓慢释放。相比于传统的Cu(Ⅰ)催化试剂，这种Cu(Ⅰ)-CDs可以通过紫外光照可控释放Cu(Ⅰ)，而且具有更小的生物毒性。

  图 5

  

  图 5.  Cu(Ⅰ)-CDs的合成及其催化应用示意图^[102]

  Figure 5.  Schematic of synthesis of Cu(Ⅰ)-CDs and application of Cu(Ⅰ)-CDs in catalysis on Huisgen 1, 3-dipolar cycloaddition reaction^[102]

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  利用有磁性的金属元素掺杂可以合成具有荧光和磁性的碳点。Liu等^[103]利用γ-聚谷氨酸和氨水、Fe²⁺/Fe³⁺通过水热法合成N、Fe共掺杂的碳点(C-Fe₃O₄ QDs)。该碳点呈现明亮的蓝绿色荧光，能够作为一种很好的荧光成像试剂。更重要的是，在碳点中Fe元素以Fe₃O₄的形式存在，尽管Fe₃O₄对碳点的荧光强度没有贡献，却使掺杂碳点带有显著的超顺磁性和高的饱和磁化强度，因此作者考察了其核磁共振性质，并将其用于多模式成像。钆(Gd)是一种镧系金属元素，有7个未成对电子，因此有很强的磁矩，已被广泛应用于磁共振成像造影剂和放射增敏剂。临床常用的Gd造影剂是Gd螯合物，但是Gd离子从螯合物中释放后可抑制Ca²⁺通道，具有一定的生物毒性。研究人员发现在碳点中掺杂Gd元素，可以得到荧光和磁共振双重成像试剂Gd-CDs，具有良好的生物相容性。Bourlinos等^[104]将钆喷酸和三羟甲基氨基甲烷、甜菜碱盐酸盐混合，然后在250℃下热解得到Gd掺杂的CDs。该碳点具有荧光和磁共振双重成像作用，而且表现出比商品化的磁共振成像试剂(钆布醇)更低的毒性。Xu等^[105]以柠檬酸、乙二胺和氯化钆为原料，水热法一步合成Gd-CDs; Du等^[106]以钆喷酸和甘氨酸为原料水热合成Gd-CDs; 均证实所得Gd-CDs具有良好的荧光信号、磁共振性质和生物相容性。

  部分金属元素掺杂也能增强碳点荧光。Li等^[107]以Mg(OH)₂和柠檬酸水热反应合成Mg-CDs，同时分别合成无掺杂CDs，乙二胺与柠檬酸共合成的N-CDs，Mg(OH)₂、EDA和柠檬酸合成的Mg，N-CDs。比较这些碳点的荧光量子产率，发现Mg和N元素分别掺杂均可增强碳点荧光，尤其是N-CDs荧光量子产率达73.1%; Mg、N共掺杂可以使量子产率增大到83%。Mg掺杂增加了N-CDs荧光量子产率，是因为Mg的鳌合作用保留了更多的羧基，从而使得表面结合更多的氨基，荧光量子产率增加。本课题组用Ge-132与柠檬酸热解合成Ge-CDs，Ge掺杂影响碳点表面的电子分布，进而改变碳点表面的能量势阱，增加了碳点荧光强度。Ge-CDs对Hg²⁺有特异性识别作用，可用于细胞中Hg²⁺的检测^[108]。Xu等^[109]以氯化锌和柠檬酸钠水热合成Zn-CDs，荧光量子产率超过30%，他们将碳点用于双氧水和葡萄糖的检测。另外，还有一些金属元素掺杂后用于检测的研究：本课题组以柠檬酸为碳源，硝酸铽为铽源，通过直接碳化法合成Tb-CDs，并用以检测苦味酸^[110]；利用柠檬酸与硝酸铕在200℃下热解得到Eu-CDs，并用于四环素的选择性检测^[111]。

  3.   掺杂碳点在成像中的应用

  碳点具有良好的生物相容性和抗光漂白作用，是一种优良的荧光成像试剂^{[112, 113]}。近年来，研究者通过在碳点中掺杂异元素，从多方面改善了其光学性质：增大碳点的荧光量子产率从而增强信号; 促使碳点发射光红移，并得到近红外发射碳点，可减小生物体自身的蓝色荧光干扰; 获得除荧光以外的多信号，如核磁共振信号和光声成像信号，使得成像更准确清晰。

  3.1   细胞成像

  碳点用于细胞成像的报道日益增加^{[36, 44, 49, 50, 78, 85, 94, 114~119]}，研究人员依据各碳点对H⁺、Fe³⁺、Hg²⁺的灵敏响应实现细胞中不同组分的监测。Zhou等^[64]以柠檬酸和双氰胺为反应前体，通过水热法一步合成高光致发光的蓝色荧光碳点，该碳点对pH值敏感，可用于细胞pH值的监测。Shangguan等^[42]用柠檬酸与碱性品红制得N掺杂碳点，该碳点有两个发射峰，且两个发射峰比例与pH值有关，并基于比率荧光法用于细胞中pH传感。Zhu等^[50]将制备N-CDs应用于细胞中铁离子的选择性检测。本课题组合成的锗掺杂碳点对汞离子具有灵敏的响应，随着细胞中汞离子含量的增加，碳点的蓝色荧光逐渐被猝灭(图 6)，以此实现了细胞中Hg²⁺的实时成像分析^[108]。荧光共聚焦成像中，细胞可显较强的蓝绿色荧光，为了去除背景干扰，研究者通过元素掺杂和表面状态调谐制备红色或近红外发射荧光碳点用于成像^{[45, 68, 70, 83, 120]}。Jiang等^[45]直接使用富含氮元素的有机分子(邻苯二胺、间苯二胺和对苯二胺)作为反应前驱体通过溶剂热法合成具有光致发光的蓝色、绿色和红色发射的三色碳点，并将三色碳点分别用于细胞成像(图 7)。

  图 6

  

  图 6.  Ge-CDs预孵育的Hep-2细胞在不同浓度的Hg²⁺作用后的荧光共聚焦动态成像^[108]

  Figure 6.  Dynamic laser confocal microscopic images of Ge-CDs pre-incubated Hep-2 cells under different concentrations of Hg^2+[108]

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  图 7

  

  图 7.  R-CDs和Hoechst用于MCF-7细胞(对照细胞和核糖核酸酶处理后细胞)共聚焦成像^[120]

  Figure 7.  Confocal fluorescent images of R-CDs and Hoechst without and with RNase treatment of MCF-7 cells^[120]

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  碳点用于细胞成像时，由于细胞核膜强有力的防御作用，碳点通常分布于细胞质中，细胞核染色相对较少。Kang等^[59]以多巴胺为前体制备N-CDs，不需进一步修饰即可用于细胞核的成像，可作为潜在的细胞核成像试剂。Sun等^[120]以柠檬酸的甲酰胺溶液微波合成红色氮掺杂碳点(R-CDs)，可用于细胞核染色; 而且研究人员通过对比该碳点用于未进行核糖核酸酶处理和处理后的细胞成像结果发现，该碳点具有RNA特异性识别作用，可用于RNA成像。

  本课题组利用半胱氨酸和柠檬酸合成得到的蓝色N，S-CDs，对细胞中的高尔基体具有特殊的识别能力^[121]。碳点的来源之一L-半胱氨酸的立体构型和游离巯基是高尔基体定位功能的关键，L-半胱氨酸修饰的SiNPs也表现出高尔基体定位作用，证实了该推断(图 8)。优良的抗光漂白能力、良好的生物相容性、特异性高尔基体识别能力说明该碳点非常适合在高尔基体长时间原位成像，因此，可用于病毒感染早期高尔基体的动态变化观察，同时有助于高尔基体靶向给药和高尔基体疾病的早期诊断和治疗。另外，碳点也可用于原核生物染色，Zhang等^[34]用尿素和柠檬酸合成了具有自猝灭抑制作用的荧光碳点粉末，该碳点具有良好的生物相容性，且在1 min内可实现对14种代表性细菌的快速着色。

  图 8

  

  图 8.  L-半胱氨酸引起碳点靶向高尔基体示意图^[121]

  Figure 8.  Schematic of CDs targeting Golgi apparatus induced by L-cysteine^[121]

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  3.2   活体成像

  元素掺杂碳点在生物体内表现出的光稳定性、低毒性、良好的生物相容性及高质量的荧光成像效果赋予其在生物成像及肿瘤的诊断和治疗方面巨大的应用潜质^{[58, 68, 70, 106, 120, 122~127]}。Wei等^[128]合成了氮掺杂的荧光碳点N-CDs，并以斑马鱼胚胎为模型考察了N-CDs在生物成像方面的应用潜力。将得到的N-CDs与斑马鱼胚胎孵育2 h后，通过荧光共聚焦显微镜可以观察到N-CDs在不同生长阶段的斑马鱼胚胎内的分布情况。在初始的24 h，整个胚胎内都清晰可见碳点的荧光; 随后24 h，碳点缓慢迁移到胚胎表面的绒毛膜上，这是因为绒毛膜上有葡萄糖受体，而碳点表面保留了葡萄糖的部分官能团。整个生长阶段，斑马鱼胚胎正常分裂并形成器官，且存活率可以达到80%以上，说明N-CDs具有良好的生物相容性，且对斑马鱼胚胎的发育没有影响。Yang等^[4]最先将荧光碳点用于活鼠荧光成像：静脉注射后，示踪碳点在小鼠体内各器官的分布和排出方式，得知碳点可以通过肾脏随尿液排出。如果将碳点用于靶向成像，常需要用靶向分子进行功能化修饰^[129]。Zheng等^[126]以D-葡萄糖和L-天冬氨酸为原料裂解，不需要额外靶向分子修饰，即得到具有显著的靶向C6胶质瘤细胞的能力的碳点。小鼠尾静脉注射15 min后，即可见到胶质瘤部位比正常脑中检测到更强的荧光信号，表明这些碳点能够自由穿透血脑屏障，精确靶向胶质瘤组织。

  虽然荧光成像灵敏度高，但也有固有的缺点，如空间分辨率太低，所以发展多模式成像，对于提高成像分析的准确度和精确度都很有必要。有研究者根据碳点特殊的吸收性质，可用于光声成像、光热成像与荧光成像一起实施多模式成像，准确进行肿瘤组织的成像识别。Ge等^[83]合成的具有红色发射的S-CDs，在400~750 nm处有吸收峰，并且有良好的光声响应和光热转化效率，可以作为荧光、光声成像和光热成像试剂，兼具肿瘤诊断和光热治疗的作用(图 9)。Sun等^[120]制备的RNA成像碳点也因为其特殊的吸收可用于光热治疗。

  图 9

  

  图 9.  红色发射的S-CDs用于荧光成像、光声成像和光热治疗示意图^[83]

  Figure 9.  Schematic of S-CDs for fluorescent, photoacoustic and photothermal therapy in living mice^[83]

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  通过掺杂Gd、Fe等磁性元素，碳点可结合荧光与MRI或CT实施多模式成像，从而提高成像效率^[103~106]。如Du等^[106]合成的Gd-CDs作为多功能诊断试剂，既可以在荧光和磁共振双重模式下成像，提高癌细胞成像分辨率，还可以提高肿瘤对辐射的灵敏度实现更好的辐射治疗效果。与商品化的核磁共振成像试剂马根维显相比，Gd-CDs拥有良好的生物相容性和低毒性、更高的纵向弛豫效率，说明其拥有很好的磁共振显影能力; 而且在X射线的照射下，随着Gd-CDs浓度的增加，癌细胞的存活率明显降低。Liu等^[103]合成N、Fe共掺杂的碳点(C-Fe₃O₄QDs)，对HeLa细胞的毒性实验发现，该碳点具有非常好的生物相容性。同时作者考察了碳点的核磁共振性质，证实该碳点可能成为一种有效的核磁共振造影剂，并且具有长时间的连续成像能力。此外作者还发现，该碳点能够吸收X射线，并且随着碳点浓度的增加，断层扫描(CT)成像的亮度也随之增强，因此该碳点也可以作为CT造影剂。基于N、Fe共掺杂的碳点在荧光、核磁共振和吸收X射线的性质上，作者同时实现了小鼠体内癌组织的荧光成像、核磁共振成像和CT成像(图 10)。

  图 10

  

  图 10.  C-Fe₃O₄ QDs的合成及多模式成像应用示意图^[103]

  Figure 10.  Schematic of synthesis and usage of C-Fe₃O₄ QDs multi-mode imaging ^[103]

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  4.   现存的问题与发展前景

  异元素掺杂碳点用于荧光成像具有众多优势：荧光量子产率大幅增加; 具有近红外发射特性; 赋予碳点多模式成像能力。但是掺杂碳点的合成与成像应用仍然存在很大的发展空间：荧光量子产率与半导体量子点和有机分子染料相比仍然没有优势，尤其是红色和近红外发射碳点的光致发光效率较低; 碳点中掺杂的异元素种类仍然有限，尤其是金属元素掺杂还存在很大的空间; 另外，碳点缺乏有效而稳定的修饰，这成为碳点用于细胞或活体成像时，提高其靶向识别能力的瓶颈。因此，合成光致发光效率较高的近红外发射碳点，或者使碳点表面基团多样化且易于修饰，从而发展碳点在生物成像，尤其是靶向成像中的应用，是未来碳点研究中重点需要解决的问题。

  
  
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  图 1  由甘氨酸水热法合成N掺杂碳点示意图^[55]

  Figure 1  Illustration of hydrothermal synthesis of nitrogen doped carbon dots (N-CDs) from glycine^[55]

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  图 2  碳点表面-NH₂与激发依赖或激发无关发光特性的关系：具有不同表面状态的碳点呈现依赖于激发的发射，表面富含氨基的碳点呈现不依赖于激发的发射^[48]

  Figure 2  Excitation-dependent emission (EDE) or excitation-independent emission (EIE) of CDs depend on surface-state of carbon dots. Carbon dots with various surface states present EDE. CDs rich in amino-groups exhibit EIE^[48]

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  图 3  分别以邻、间、对苯二胺为前体，溶剂热反应制备发射绿、蓝、红色荧光的碳点^[45]

  Figure 3  Preparation of RGB fluorescent CDs from three different phenylenediamine isomers^[45]

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  图 4  O-CDs、N-CDs、N，S-CDs的发光机理示意图。(1)从基态激发且被表面状态束缚的电子，(2)从基态以非辐射方式回到基态的电子，(3)从激发态以辐射方式回到基态的电子^[81]

  Figure 4  Schematic of fluorescence mechanism of O-CDs, N-CDs, and N, S-CDs. (1) Electrons excited from the ground state and trapped by the surface states; (2) non-radiative route of excited electrons; (3) radiative route of excited electrons^[81]

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  图 5  Cu(Ⅰ)-CDs的合成及其催化应用示意图^[102]

  Figure 5  Schematic of synthesis of Cu(Ⅰ)-CDs and application of Cu(Ⅰ)-CDs in catalysis on Huisgen 1, 3-dipolar cycloaddition reaction^[102]

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  图 6  Ge-CDs预孵育的Hep-2细胞在不同浓度的Hg²⁺作用后的荧光共聚焦动态成像^[108]

  Figure 6  Dynamic laser confocal microscopic images of Ge-CDs pre-incubated Hep-2 cells under different concentrations of Hg^2+[108]

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  图 7  R-CDs和Hoechst用于MCF-7细胞(对照细胞和核糖核酸酶处理后细胞)共聚焦成像^[120]

  Figure 7  Confocal fluorescent images of R-CDs and Hoechst without and with RNase treatment of MCF-7 cells^[120]

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  图 8  L-半胱氨酸引起碳点靶向高尔基体示意图^[121]

  Figure 8  Schematic of CDs targeting Golgi apparatus induced by L-cysteine^[121]

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  图 9  红色发射的S-CDs用于荧光成像、光声成像和光热治疗示意图^[83]

  Figure 9  Schematic of S-CDs for fluorescent, photoacoustic and photothermal therapy in living mice^[83]

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  图 10  C-Fe₃O₄ QDs的合成及多模式成像应用示意图^[103]

  Figure 10  Schematic of synthesis and usage of C-Fe₃O₄ QDs multi-mode imaging ^[103]

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