English

• 1.   引 言

  赭石(Haematitum)味苦,性寒,主要成分为三氧化二铁(Fe₂O₃),并含有Ca,Mn,Ni,Zn,Co,Cu,As等多种矿物元素^[1],具有平肝潜阳、降逆、止血功效。临床上应用非常广泛,主要用于治疗眩晕耳鸣、呕吐、噫气、呃逆、喘息、吐血等症,其铁含量大于45%,是良好的补铁剂,可以用于治疗缺铁性贫血,调节内分泌平衡。近些年,学者们对赭石的炮制方法、临床配伍应用等研究广泛,但对其作用机理和内源性代谢研究还不完全。

  代谢组学^[2]自提出以来发展迅速,它通过发现、识别、定量分析低分子量的代谢物,研究有关个体健康状况的重要信息^[3]。代谢组学可以通过直观的代谢变化,确定代谢异常的信号(特征性代谢物)、生物标记物^[4]。目前,代谢组学已经成功运用到疾病的诊断、药物安全及药物作用机理、毒理学、食品营养学、植物学等多个研究领域^[4～9]。代谢组学的分析技术手段主要有核磁共振(NMR)、质谱(MS)、液相色谱-质谱联用(LC-MS)、气相色谱-质谱联用(GC- MS)等。

  随着技术的进步,NMR提高了灵敏度和分辨率,被广泛应用到代谢组学的代谢物识别和定量分析中^{[4, 5]}。NMR可对样品进行快速、高通量的、无偏性地检测与分析,且样品处理简单。本研究采用基于¹H NMR的代谢组学方法,结合主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)方法,对灌胃给药赭石的成年Wistar大鼠尿液进行分析,研究给药赭石前后的代谢组特征,找出赭石发挥作用的潜在特征代谢物,从分子水平上对赭石的急性生物效应进行研究,为赭石的科学用药提供了依据。

  2.   实验部分

  2.1.   仪器与试剂

  Bruker AV 600型NMR仪器,质子共振频率为600.13 MHz,采用预饱和方法压制水峰采集信号,FID采集次数64,数据点64k,延迟时间6 s,90°偏转角为13.5 μs,采样时间为1.0224 s,谱宽8992.8 Hz。

  NaH₂PO₄、Na₂HPO₄(分析纯,北京化工厂),用于配制缓冲溶液(pH=7.38);3-(三甲基硅基)氘代丙酸钠(TSP,98%氘代,美国Aldrich公司);重水(D₂O,99.9%,美国剑桥同位素实验室),用于配制0.5 mmol/L TSP;羧甲基纤维素钠(CMC-Na,国药集团化学试剂有限公司),配制0.5%羧甲基纤维素钠溶液;赭石(长春某药房),配制质量分数为33.3%,55.6%和71.4%的赭石悬浊液(羧甲基纤维素钠作溶剂)。

  2.2.   实验方法

  20只成年雄性Wistar大鼠(购于吉林大学基础医学院),随机分为4组,每组5只,1组为对照组,3组为实验组。严格按照要求饲养,环境温度控制在(22±2)℃,湿度保持在50%±10%,昼夜循环,自由摄食饮水。大鼠在饲养笼内适应7天后,实验组灌胃给药2、5和10 g/kg体重(Body Weight,BW)剂量的赭石,对照组灌胃给药同体积0.5% CMC-Na。赭石给药剂量参考其半致死量^[10]。利用代谢笼集尿装置收集给药前1天及给药1,2,3,4,5天后的大鼠尿液,于-80℃保存。

  测样时于室温下解冻,取0.4 mL尿液,加入0.2 mL缓冲溶液,4℃静置20 min,以4000 r/min离心5 min;取上层清液0.55 mL于5 mm NMR 样品管中,加入0.06 mL内含0.5 mmol/L TSP-D₂O,25℃进行测试。

  使用MestRe-C版本软件(http://qobrue.usc.es/jsgroup/MestRe-C,共享软件)进行手动相位调整和基线校正。以TSP为内标,除去残余水峰以及因交叉弛豫变宽的尿素峰(δ=4.50-6.10),谱图按δ=0.01分段积分,并进行概率商归一化(PQN),所得数据用SIMCA-P 11.0(Umetrics ,Sweden)进行主成分分析(PCA)和偏最小二乘-判别分析(PLS-DA),Par(Pareto scaling)中心化方式,PCA得分图数据导出进行作图,PLS-DA模型进行排列验证。单变量分析采用的统计分析方法为单尾双样本异方差t检验,涉及多重比较采用邦费罗尼(Bonferroni correction)法校正p值。

  3.   结果与讨论

  3.1.   尿液 ¹H NMR谱峰归属及多元统计

  尿液极易收集,可以反映机体的代谢状况,对机体疾病的诊断有重要意义。根据文献^{[11, 12]}对谱图(图 1)进行谱峰归属。从图 1可见,大鼠尿液主成分中有糖酵解终端产物乙酸;柠檬酸、琥珀酸、α-酮戊二酸等三羧酸循环中间体;二甲基甘氨酸、N-乙酰谷氨酸等大鼠体内的代谢中间体;同时还有大量代谢终产物: N-氧三甲胺、牛磺酸、肌酸酐、甲酸、马尿酸等,大鼠尿液中代谢物组成及浓度的变化能够反映给药赭石对其机体功能状态的影响。

  图 1

  

  图 1  对照组和给药赭石1天后尿液的¹H NMR谱图

  Figure 1.  ¹H NMR Spectra of urine from control group and 1 day post haematitum treatment group

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  对3个剂量组的¹H NMR谱图数据进行PCA分析,得到PCA得分图(图 2)。从图 2可见,3个剂量组随时间变化的轨迹,给药后第1天,3个剂量组均与对照组分开(将PCA得分图坐标进行ANOVA检验,p＜0.025视为分开);给药后第3天和第4天,2和5 g/kg BW剂量组未能与对照组分开,而10 g/kg BW剂量组仍与对照组分开(ANOVA,p＜0.025);给药5天后,3个剂量组均未能与对照组分开。说明大鼠体内代谢物含量在给药赭石后,第1天变化较大,使不同剂量组PCA得分图均能与对照组完全分开,2和5 g/kg BW剂量组在给药第4天后有明显恢复趋势,10 g/kg BW剂量组在给药第5天后有明显恢复趋势。

  图 2

  

  图 2  对照组和不同赭石给药组的尿液¹H NMR谱主成份分析(PCA)得分图,(a)第1天,(b)第3天,(c)第4天,(d)第5天。椭圆为每组的平均值±标准偏差。

  Figure 2.  Principal component analysis (PCA) scores plots based on¹H NMR spectra of urine from control group and different haematitum treatment groups ,(a) 1 day,(b) 3 day,(c) 4 day,(d) 5 day post dose. Ellipse represent mean ± standard deviation.

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  图 3

  

  图 3  对照组和不同赭石给药组第1天的尿液¹H NMR谱偏最小二乘判别分析(PLS-DA)得分图和载荷图,A为2 g/kg体重(BW)与对照组(R²=99.9%,Q²=95.8%),B为5 g/kg BW与对照组(R²=98.6%,Q²=87.1%),C为10 g/kg BW与对照组(R²=99.9%,Q²=94.7%)

  Figure 3.  Partial least squares-discriminate analysis (PLS-DA) scores and loadings plots based on ¹H NMR spectra of urine from control group and different haematitum treatment groups at 1day post dose,A,2 g/kg body weihgt (BW) and control (R²=99.9%,Q²=95.8%); B,5 g/kg BW and control (R²=98.6%,Q²=87.1%); A,10 g/kg BW and control (R²=99.9%,Q²=94.7%)

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  为了找出3个剂量组与对照组分类贡献最大的代谢物,分别对3个剂量组给药第1天尿液的¹H NMR谱图数据进行PLS-DA分析,得到得分图和载荷图(图 3)。从图 3可见,第1天给药组与对照组完全分开。

  对PLS-DA模型进行排列验证(Permutation test),置换次数n=200,结果如图 4所示。从模型的排列验证结果图可见,部分样本类别信息打乱后,相应模型的性能(R²和Q²)均下降。这一结果说明,PLS-DA模型所呈现的给药组与对照组区别具有较好的可靠性。

  图 4

  

  图 4  PLS-DA模型排列验证结果,A: 2 g/kg BW与对照组,B: 5 g/kg BW与对照组,C: 10 g/kg BW与对照组

  Figure 4.  Permutation test results of PLS-DA,A: 2 g/kg BW and control; B: 5 g/kg BW and control; C: 10 g/kg BW and control

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  3.2.   潜在特征代谢物筛选及其单变量分析

  对尿液PLS-DA载荷图中VIP>1的数据进行分析,得到对分类贡献最大的代谢物有柠檬酸、牛磺酸、肌酸酐、α-酮戊二酸、琥珀酸、二甲基甘氨酸。对柠檬酸、牛磺酸、肌酸酐、α-酮戊二酸、琥珀酸、二甲基甘氨酸的¹H NMR谱图积分面积进行单变量比较,得到给药组与对照组积分面积百分比随时间变化图(图 5),所有数据进行t检验,p＜0.025认为具有统计学意义。

  图 5

  

  图 5  赭石给药组与对照组不同尿液代谢物积分面积百分比随时间变化图:A. 柠檬酸,B. 牛磺酸,C. 肌酸酐,D. α-酮戊二酸,E. 琥珀酸,F. 二甲基甘氨酸。 * 代表p＜0.025,**代表p＜0.005,图中竖线代表标准偏差。

  Figure 5.  Normalized integral changes of urinary metabolites from different haematitum treatment groups and control group compared at seven matched time points (from day -1 to 5): A,Citrate; B,Taurine; C,Creatinine; D,α-Ketoglutarate; E,Succinate; F,Dimethylglycine. Key: * indicated p＜0.025,** indicated p＜0.005. The bars indicated standard standard deviation.

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  如图 5所示,对照组柠檬酸、牛磺酸、肌酸酐、α-酮戊二酸、琥珀酸、二甲基甘氨酸的含量与给药前相比均无显著性变化,可以排除上述代谢物含量变化是由于溶剂羧甲基纤维素钠引起的。从图 5可见,给药赭石后,大鼠尿液中柠檬酸、α-酮戊二酸含量降低(p＜0.025),牛磺酸、二甲基甘氨酸含量升高(p＜0.025),随给药时间的变化出现恢复趋势,且恢复趋势与给药剂量相关。琥珀酸不同给药剂量组变化不同,2 g/kg BW组先降低(p＜0.025)后恢复,而5和10 g/kg BW组出现不同程度升高(p＜0.025)趋势。不同给药剂量尿液中肌酸酐含量变化也不同,2和5 g/kg BW组升高(p＜0.025)后恢复,而10 g/kg BW组降低(p＜0.025)后未能恢复。不同给药剂量组大鼠体内代谢物含量变化趋势的差异,说明赭石给药剂量不同,对大鼠体内代谢的影响也可能发生变化。

  3.3.   特征代谢物生物学分析

  三羧酸循环反应部位在细胞的线粒体中,反应产生高能磷酸键(ATP或GTP),是重要的能量代谢途径,体内铁过载对机体损伤的靶向性是线粒体^[13～15],Bacon等^[15]在对大鼠口服过量的羰基铁实验中观察到肝铁浓度过高可以引发线粒体过氧化损伤。3个剂量组观察到的尿液中柠檬酸、α-酮戊二酸含量降低,2 g/kg BW 组琥珀酸含量降低,三羧酸循环能力降低,可能是由于赭石引发了线粒体过氧化损伤,抑制了三羧酸循环。三羧酸循环中琥珀酸在琥珀酸脱氢酶的作用下生成延胡索酸。文献^[16]报道,在大鼠铁过载模型中,琥珀酸脱氢酶的活性受到抑制。在5和10 g/kg BW组观察到琥珀酸含量升高,可能是由于较高剂量的赭石抑制了琥珀酸脱氢酶的活性而造成的。在给药赭石后观察到尿液中柠檬酸、α-酮戊二酸和琥珀酸含量发生变化,说明赭石抑制了三羧酸循环,影响了能量代谢。

  肌酸酐在肌酸酐水解酶的作用下水解生成肌酸,反应可逆。肌酸酐在肌酸酐脱氨酶和胞嘧啶脱氨酶的作用下生成N-甲基乙内酰脲。肌酸酐水解酶、肌酸酐脱氨酶和胞嘧啶脱氨酶的活性受到金属离子浓度的影响,Fe²⁺,Co²⁺,Zn²⁺等在一定的浓度范围内可以抑制肌酸水解酶活性,激活肌酸酐脱氨酶和胞嘧啶脱氨酶的活性^[17]。在给药组观察到的肌酸酐含量发生明显变化,可能是由于赭石影响了肌酸酐水解酶、肌酸酐脱氨酶和胞嘧啶脱氨酶等肌酸代谢酶的活性造成的。 牛磺酸与自由金属离子(如Fe²⁺,Cu²⁺等)形成螯合物使其活性降低^[18],从而保护肝脏免受损害^[19]。有研究表明,大鼠喂食牛磺酸,可以改善乙醇和羰基铁引起的肝损伤和肝脏纤维化^[18]。在给药组观察到牛磺酸含量升高,可能是由于在赭石的刺激下,大鼠机体的应激行为,促进机体内牛磺酸合成,降低赭石对肝脏的影响。2和5 g/kg BW组随后恢复,说明较低剂量赭石对肝脏的影响程度较低;而10 g/kg BW组牛磺酸含量保持在较高水平,到给药后第5天仍未恢复,说明高剂量赭石对肝脏具有较大影响。

  二甲基甘氨酸和水在电子转移黄素蛋白作用下生成肌氨酸和甲醛,电子转移黄素蛋白存在于细胞线粒体膜上。有研究表明,SPIO(超小型超顺磁氧化铁粒子)具有膜毒性,可以改变膜的溶透性和完整性^[12]。体内铁过载会造成线粒体损伤^[13～15]。因此,药组观察到的二甲基甘氨酸水平显著升高,可能是由于赭石影响了电子转移黄素蛋白的活性,使得二甲基甘氨酸生成肌氨酸的代谢途径受阻。

  4.   结 论

  实验结果表明,赭石能够引起大鼠体内柠檬酸、牛磺酸、肌酸酐、α-酮戊二酸、琥珀酸、二甲基甘氨酸等代谢物浓度变化,可作为赭石的潜在特征代谢物。赭石降低三羧酸循环能力,影响了能量代谢、肌酸的代谢和二甲基甘氨酸代谢,并在一定程度上影响了肝功能。通过大鼠尿液轨迹图可知,给药3个剂量组在给药后第1天对大鼠具有较大影响,随后3个剂量组均有随时间恢复的趋势,但10 g/kg BW剂量组恢复缓慢。因此,基于¹H NMR的代谢组学方法可以有效运用到赭石的研究中,为赭石的研究提供新思路,同时也为赭石的安全用量提供了理论依据。

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  Figure 1  ¹H NMR Spectra of urine from control group and 1 day post haematitum treatment group

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  Figure 2  Principal component analysis (PCA) scores plots based on¹H NMR spectra of urine from control group and different haematitum treatment groups ,(a) 1 day,(b) 3 day,(c) 4 day,(d) 5 day post dose. Ellipse represent mean ± standard deviation.

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  Figure 3  Partial least squares-discriminate analysis (PLS-DA) scores and loadings plots based on ¹H NMR spectra of urine from control group and different haematitum treatment groups at 1day post dose,A,2 g/kg body weihgt (BW) and control (R²=99.9%,Q²=95.8%); B,5 g/kg BW and control (R²=98.6%,Q²=87.1%); A,10 g/kg BW and control (R²=99.9%,Q²=94.7%)

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  Figure 4  Permutation test results of PLS-DA,A: 2 g/kg BW and control; B: 5 g/kg BW and control; C: 10 g/kg BW and control

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  Figure 5  Normalized integral changes of urinary metabolites from different haematitum treatment groups and control group compared at seven matched time points (from day -1 to 5): A,Citrate; B,Taurine; C,Creatinine; D,α-Ketoglutarate; E,Succinate; F,Dimethylglycine. Key: * indicated p＜0.025,** indicated p＜0.005. The bars indicated standard standard deviation.

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